负载SOX-9的大鼠脂肪干细胞成软骨分化的实验研究

目的 SOX-9基因转染大鼠的ADSCs(Adipose stromal cells,ADSCs),诱导其向软骨细胞分化,为软骨组织工程学种子细胞提供新方法.方法 分离、培养大鼠的ADSCs,免疫荧光法进行鉴定;SOX-9基因转染ADSCs,对转染后细胞进行筛选;MTT法测定筛选后细胞的增殖活性;RT-PCR、Western blot对筛选后细胞的表达进行检测.结果 成功分离、培养大鼠的ADSCs;细胞表面标志物CD29和CD44表达阳性,CD106和CD34表达阴性;基因转染后细胞的增殖力变强;转染SOX-9的ADSCs在目的基因SOX9、Aggrecan、Collagen Ⅱ mRNA的表达和软骨特异性基质-Collagen Ⅱ的分泌上明显高于转染空载体组和对照组;结论 SOX-9基因转染后ADSCs具有了软骨细胞的表型特征,可以用作软骨组织工程的种子细胞.     

人脂肪干细胞向血管平滑肌细胞诱导分化的实验研究

目的：体外诱导培养人脂肪干细胞（adi pose-der i ved st em cel l s,ADSCs）,观察是否可以分化形成血管平滑肌细胞（vascul ar smoot h muscl e cel l s,VSMCs）,为构建组织工程化血管寻找新的种子细胞来源。方法：免疫磁珠法分选收集原代脂肪干细胞,加入PDGF-BB、TGF-β1诱导14天后进行检测。结果：实验组细胞生长呈现血管平滑肌细胞所特有的峰谷样生长,血管平滑肌细胞特有的表面抗原标记物表达阳性。结论：脂肪干细胞定向诱导培养后,具有血管平滑肌细胞的特性,有可能成为构建组织工程化血管新的种子细胞来源。     

TGF-β1,bFGF,IGF联合诱导兔脂肪基质干细胞向软骨细胞分化的实验研究

[目的]分离培养兔脂肪基质干细胞(adipose-derived stem cells,ADSCs),观察在TGF-β1,bFGF,IGF联合诱导下其生物学特性及向软骨细胞定向分化的能力.[方法]取4个月龄新西兰大白兔颈背部脂肪组织,分离、培养ADSCs.选取第3代,分为两组,实验组用软骨诱导液(含TGF-β1、bFGF、IGF)对细胞进行培养,对照组用普通高糖培养液培养,倒置显微镜观察两组细胞形态,MTT测定其增殖情况;14 d后行组织学观察(包括甲苯胺蓝染色、Ⅱ型胶原免疫组化),并实时荧光定量PCR检测两组细胞Ⅱ型胶原、蛋白聚糖、SOX 9基因的表达情况.[结果]实验组细胞逐渐变为软骨样细胞形态,增殖速度明显加快,14 d后实验组甲苯胺蓝染色、Ⅱ型胶原免疫组化阳性,对照组为阴性,荧光定量PCR结果显示实验组Ⅱ型胶原、蛋白聚糖、SOX 9的基因转录水平明显高于对照组.[结论]在TGF-β1,bFGF,IGF联合诱导条件下ADSCs增殖迅速,可高表达Ⅱ型胶原、蛋白聚糖、SOX 9,向软骨细胞定向分化.     

骨髓基质干细胞在体外向软骨细胞分化

目的观察骨髓基质干细胞(B M SC s)在体外能否分化为软骨细胞。方法利用高密度细胞球培养体系在含转化生长因子-β1(TG F-β1)的培养基中培养B M SC s21d,用免疫组化甲苯胺蓝染色方法分析培养的B M SC s球中蛋白多糖(软骨细胞分泌的主要基质成份)的表达、用免疫组化和R T-P C R方法分析Ⅱ型胶原(软骨细胞特异分泌的主要胶原蛋白)的表达来评估B M SC s是否分化为软骨细胞。结果TG F-β1作用的B M SC s表达了Ⅱ型胶原和蛋白多糖。结论B M SC s在体外特定的培养条件下可分化为软骨细胞,从而可能成为临床上治疗创伤或骨关节炎所致的软骨缺损所需的合适的自体来源的种子细胞。     

外源性TGF-β1及IGF-1诱导大鼠脂肪干细胞向软骨细胞分化的实验研究

目的探讨大鼠脂肪干细胞(ADSCs)的分离、培养、扩增方法及单层培养条件下外源性转化生长因子TGFβ-1和胰岛素样生长因子IGF-1诱导ADSCs向软骨细胞定向分化的可能性及两者的协同作用分析。方法取大鼠大网膜及肾周脂肪囊等处脂肪组织,酶消化法分离培养脂肪干细胞;免疫荧光测定CD29和CD44抗原的表达;分别用4组诱导培养基定向软骨方向诱导;诱导2周后细胞爬片行免疫荧光鉴定Collagen II表达;RT-PCR、Western blot对定向诱导后的细胞的表达进行检测。结果自大鼠脂肪组织中可分离出脂肪干细胞,体外生长形态类似成纤维细胞,可长期增殖,CD29和CD44抗原表达阳性,定向诱导后IGF-1组、TGFβ-1组及TGFβ-1 IGF-1组细胞可表现出软骨细胞的特性,TGFβ-1和IGF-1共同作用组软骨特异性基质的分泌明显高于单独诱导组。结论从大鼠脂肪组织中可分离出脂肪干细胞,生物学特性稳定,TGFβ-1和IGF-1均能定向诱导ADSCs向软骨方向分化,两者共同诱导时具有协同作用。     

b-FGF和TGF-β1对体外培养的软骨细胞增殖的影响

目的:研究转化生长因子-β1(TGF-β1)和碱性成纤维细胞生长因子(b-FGF)对体外培养的软骨细胞增殖的影响。方法:细胞取自猪耳弹性软骨,体外培养原代至第6代软骨细胞,将培养液中加入TGF-β1或/和b-FGF作用于软骨细胞,并用MTT比色分析法对其增殖行为进行分析,探讨两种因子对软骨细胞增殖行为的影响。结果:b-FGF明显促进原代至第3代软骨细胞的增殖,并逐渐减弱,对第4代细胞无增殖作用,TGF-β1仅促进原代软骨细胞的增殖,TGF-β1和b-FGF联合应用,其刺激细胞增殖的作用明显低于b-FGF单一作用。结论:b-FGF显著促进体外培养的软骨细胞的增殖,主要作用于原代至第2代软骨细胞,明显强于b-FGF和TGF-β1联合应用。     

重组hTGF-β1腺病毒转染BMSCs对其向软骨分化的影响

目的 研究重组hTGF-β1腺病毒(adeno-hTGF-β1)转染BMSCs对其向软骨分化的作用.方法 重组adeno-hTGF-β1转染第一代猪BMSCs,对照组转染adeno-LacZ,腺病毒的量以200pfu/细胞计算,转染后1 d,消化收集重组腺病毒转染后的BMSCs,置于无菌15 ml聚丙烯试管中,体外细胞团聚集连续诱导培养21 d,然后分别从大体观察、组织学和Ⅱ型胶原蛋白免疫组化的检测对形成组织进行评价. 结果 实验组细胞团收缩成近似小球形的组织块,外观成乳白色,触之有一定的弹性.苏木素-伊红染色观察可见细胞团外周为由数层扁平状成纤维样细胞组成的纤维软骨膜,下层和中部区域有巢状软骨形成,软骨陷窝明显可见,软骨细胞较均匀分布,包埋在软骨陷窝内.Safranin'O染色显示,形成的软骨组织区域有大量被染成桔红色蛋白多糖类基质分泌,Ⅱ型胶原免疫组化染色检测显示细胞团中央出现较明显的阳性染色区域,可见棕黄色的颗粒分布于胞浆内.而对照组形成的组织块略小,苏木素-伊红染色观察见无软骨样组织形成,主要为较致密无结构特征的纤维样组织,Safranin'O染色也无被染成桔红色蛋白多糖类基质分泌,Ⅱ型胶原免疫组化染色检测显示也无明显的阳性染色区. 结论 应用重组hTGF-β1腺病毒转染的BMSCs进行细胞团聚集诱导培养,可诱导BMSCs向软骨细胞表型分化而形成软骨,为hTGF-β1基因转染的BMSCs在软骨组织工程应用中奠定了基础.     

转化生长因子β1诱导永生化人前软骨干细胞向髓核样细胞分化的实验研究

  目的 研究转化生长因子β1 (TGF-β1) 诱导永生化人前软骨干细胞 (IPSCs) 向髓核样细胞分化的可行性。方法 将体外培养的IPSCs 接种于温敏型壳聚糖水凝胶 (C/GP) 三维支架上,加入含TGF-β1的诱导培养基,低氧条件下进行诱导培养,观察三维支架上IPSCs的生长及分化情况。7 d后行Alcian Blue染色,分析细胞外基质糖胺聚糖（GAG）合成情况,并收集细胞,提取RNA。RT-PCR检测诱导前后髓核样细胞标志基因Ⅱ型胶原（Collagen Ⅱ）和蛋白聚糖（Aggrecan）的表达情况,Western Blot 检测诱导前后细胞内β-catenin蛋白表达水平的变化。结果 IPSCs在三维支架上生长状态良好,诱导7 d 后,Alcian Blue染色表明,细胞外基质GAG的合成明显增多,实验组（诱导培养基）明显多于对照组（普通培养基）。RT-PCR证实Ⅱ型胶原和Aggrecan的基因表达水平明显增高,实验组明显高于对照组;Western Blot证实细胞内β-catenin蛋白表达水平明显上调,实验组明显高于对照组。结论 IPSCs经TGF-β1诱导可在体外定向分化为髓核样细胞,诱导分化后的细胞具有良好的分泌功能,能够有效地分泌细胞外基质成分。TGF-β1可能通过上调细胞内β-catenin的表达诱导IPSCs向髓核样细胞分化。     

重组PGL3-转化生长因子β1基因转染兔骨髓基质干细胞体外诱导向软骨细胞分化的实验研究

目的探讨将编码细胞转化生长因子β1(transforming growth factor β1,TGF-β1)的重组PGL3-TGF-β1质粒转染兔骨髓基质干细胞(marrow stromal stem cells,MSCs),体外通过自分泌、诱导作用向软骨细胞方向分化的可行性,为基因加强组织工程学修复软骨损伤提供体外实验依据.方法兔MSCs体外密度梯度离心及贴壁筛选法分离培养,脂质体法转染重组PGL3-TGF-β1,转染后绘制不同时期细胞生长曲线,MTT法分析转染后细胞(实验组)生长活性,以未转染空载体细胞为实验对照组,未转染细胞为空白对照组;转染后第2、7天,分别进行抗TGF-β1和抗Ⅱ型胶原蛋白的免疫组织化学染色(SABC法),以未转染细胞为实验对照组,PBS作为一抗为空白对照组,进行图像定量分析.结果 MSCs体外分离培养,脂质体法转染后,生长曲线显示转染后细胞生长活性较对照组降低,MTT法显示实验组及实验对照组吸光度(A)值较空白对照组低,差异有统计学意义(P＜0.01);实验组转染细胞第2天,抗TGF-β1免疫组织化学染色可见细胞内阳性颗粒,实验对照组及空白对照组均为阴性;转染细胞第7天,抗Ⅱ型胶原免疫组织化学染色实验组可见细胞内阳性颗粒,实验对照组及空白对照组均为阴性.图像分析示,实验组抗TGF β1及抗Ⅱ型胶原免疫组织化学染色阳性值与实验对照组及空白对照组相比,差异均有统计学意义(P＜0.01).结论脂质体法重组PGI3-TGF-β1基因可成功转染兔MSCs,但对细胞生长有一定影响,转染细胞表达TGF β1,通过其自分泌、诱导作用,细胞分泌Ⅱ型胶原蛋白,表现出软骨细胞样生理特征,并向软骨细胞方向分化.     

TGF-β1干预下体内兔骨髓间充质干细胞对退变椎间盘治疗的实验研究

[目的]评价在TGF-β1干预下的兔间充质干细胞移植到兔退变椎间盘后是否可诱导向髓核细胞分化并增加蛋白多糖和Ⅱ型胶原的含量。[方法]采用体外细胞培养技术，将兔骨髓间充质干细胞白骨髓血中分离、纯化和培养，成功传代、纯化后并在TGF-β1干预下植入兔退变椎间盘的模型中。分别于2、4、6、8周用间苯三酚分光光度法测定蛋白多糖含量的变化；免疫组化法测定Ⅱ型胶原的含量变化。所得数据经SPSS 11．5统计学软件进行统计学处理。[结果]原代培养及传代培养显示兔骨髓间充质干细胞具有活跃的增殖倍增能力，并且8周内蛋白多糖和Ⅱ型胶原的含量的恢复实验组对比模型组增高明显，统计学显示差异有显著性意义。[结论]将TGF-β1干预下的兔间充质干细胞移植到退变椎间盘后可以在一定时间内增加蛋白多糖和Ⅱ型胶原的含量，从而延缓椎间盘退变。     

β1转化生长因子体外诱导入表皮干细胞分化为成纤维细胞的初步研究

目的探讨β1转化生长因子（transforming growth factorp1,TGF-β1）诱导入表皮干细胞（human epidermal stemcells,hESCs）分化与瘢痕形成之间存在的关联。方法将包皮环切术后的包皮用中性蛋白水解酶消化,采用改良的Ⅳ型胶原选择黏附法分离、培养,传代至第3代时经过hESCs表面标志物β1整合素和CK19检测,证实为hESCs后接种于24孔板,随机分为3组：3d组、7d组、空白对照组,前两组分别加入梯度浓度的TGF-β1（0．1、5．0、10．0ng／m1）诱导,采用HE常规染色及Masson胶原特殊染色、免疫组织化学染色等手段检测量波形蛋白表达和羟脯氨酸试剂盒法测量各组上清液中胶原含量。结果hESCs在TGF-β1诱导下,形态由圆形转变为梭形类成纤维细胞样,Masson胶原染色阳性,释放到细胞上清液中的胶原浓度,均显著高于对照组,抗-波形蛋白染色阳性率各组都至少在（95．00±1．20）％以上,大于对照组的（5．70±0．20）％（P〈0．05）。结论结果表明,hESCs与病理性瘢痕发生关系极其密切,在TGF-β1体外诱导下向成纤维细胞分化,分泌胶原,提示在病理性瘢痕的发生中,hESCs可能是活化的成纤维细胞的另一个来源,hESCs可能参与瘢痕增生发生过程。     

hTGF-β1基因修饰BMSCs复合藻酸钙凝胶三维培养构建组织工程化软骨

目的 探讨hTGF-β1转染骨髓间充质干细胞(BMSCs)复合藻酸钙凝胶三维培养构建组织工程化软骨的可行性. 方法 全骨髓法获取和培养大鼠BMSCs,取第3代细胞接种于细胞培养板.实验分成3组:Ad-hTGF-β1转染组、Ad-EGFP转染组、空白对照组,前两组分别加入含Ad-hTGF-β1与Ad-EGFP的无血清培养基,空白对照组添加不做任何处理的完全培养基.7d后,运用实时荧光定量PCR与Western blot检测TGF-β1的表达情况.将Ad-hTGF-β1成功转染组的BMSCs继续大量扩增后.按照1.0×107/ml的细胞密度制成细胞—藻酸钙凝胶复合物,将复合物置于培养箱中继续体外培养.10d后,观察凝胶材料中的细胞形态与增殖情况,并将复合物包埋、切片,进行组织学及免疫组织化学染色分析软骨分化情况. 结果 转染后7d,实时荧光定量PCR结果显示TGF-β1表达量的平均相对比值Ad-hTGF-β1转染组(0.863)明显高于Ad-EGFP转染组(0.183)、空白对照组(0.180),差异有统计学意义(P＜0.05).Westem blot检测发现Ad-hTGF-β1转染组的细胞内TGF-β1表达呈强阳性,而Ad-EGFP转染组及空白对照组细胞内的TGF-β1表达很弱.倒置显微镜观察到细胞在藻酸钙凝胶中能够很好的维持球形生长;MTr检测显示,不同时间点细胞在藻酸钙凝胶中的数量变化差异无统计学意义(P＞0.05).HE染色可见有大量软骨陷窝形成,甲苯胺蓝、Masson染色可见有软骨基质分泌,CollagenⅡ免疫组织化学染色呈阳性表达. 结论 hTGF-β1成功转染的BMSCs,在藻酸钙凝胶材料中培养在维持细胞形态的同时能够很好的向软骨细胞分化,此种培养方法更能模拟细胞在体内的生长方式.     

蛋白激酶A在TGF—β1刺激增生性瘢痕成纤维细胞胶原合成中的作用

目的探讨蛋白激酶A在TGF－β     

胰岛素样生长因子-1基因转染脂肪间充质干细胞向软骨细胞分化的研究

目的 观察胰岛素样生长因子(IGF)-1基因转染的脂肪间充质干细胞(ADSCs)向软骨细胞分化的效果.方法 原代培养兔ADSCs,免疫荧光法检测细胞表面抗原CD44、CIM9;脂质体介导人IGF-1基因转染兔ADSCs联合低浓度血清培养基向软骨细胞分化诱导,RT-PCR及Western blot方法检测IGF-1的表达,MMT法绘制细胞增殖曲线、甲苯胺蓝染色软骨结节、免疫组织化学检测Ⅱ型胶原的表达.结果 脂肪间充质干细胞CD44、CD109表达阳性,基因转染后细胞IGF-1表达阳性,细胞增殖速度增快,出现软骨结节,Ⅱ型胶原表达增高.结论 从脂肪组织中能够分离出增殖旺盛的ADSCs,IGF-1在ADSCs内获得稳定表达,细胞增殖能力增强,促进其向软骨细胞分化.     

自体富血小板血浆诱导兔脂肪干细胞成软骨分化的实验研究

[目的]体外分离、培养、鉴定兔脂肪干细胞,探讨富血小板血浆体外诱导脂肪干细胞成软骨分化潜能。[方法]取Ⅰ型胶原酶消化兔脂肪后,贴壁法分离培养脂肪干细胞,取第3代细胞分别予以成脂、成骨诱导,证实其多向分化潜能;同时取第3代细胞予以富血小板血浆诱导,2周后倒置显微镜观察细胞形态,行Ⅱ型胶原免疫荧光细胞化学染色、甲苯胺蓝染色和实时荧光定量PCR检测Ⅱ型胶原和聚集蛋白聚糖的表达。[结果]可以从兔脂肪中培养出脂肪干细胞,成脂、成骨诱导证实其多向分化潜能。经自体富血小板血浆诱导的脂肪干细胞,其Ⅱ型胶原免疫荧光细胞化学染色、甲苯胺蓝染色均为阳性。实时荧光定量PCR检测发现经自体富血小板血浆诱导的兔脂肪干细胞Ⅱ型胶原α1链基因和聚集蛋白聚糖基因表达明显高于对照组未经诱导的兔脂肪干细胞(P<0.01)。[结论]自体富血小板血浆可以有效诱导兔脂肪干细胞表达II型胶原和蛋白聚糖,可以诱导兔脂肪干细胞向软骨细胞方向分化。     

强脉冲光促进大鼠皮肤转化生长因子-β1表达的实验研究

目的观察强脉冲光照射对SD大鼠皮肤转化生长因子-β1(Transforming growth factor-β1,TGF-β1)表达的影响,以进一步阐明强脉冲光治疗皮肤光老化可能的机制。方法随机选取15只SD大鼠,两侧背部皮肤去毛,以一侧为强脉冲光照射实验组,对侧背部皮肤作对照组。采用波长560～1200 nm、能量27 J/cm~2、脉宽3.0 ms、双脉冲方式、脉冲延时10 ms的强脉冲光照射实验组皮肤,取术前及术后4周大鼠实验侧和对照侧皮肤标本,行大鼠皮肤TGF-β1蛋白免疫组化染色定位,观察大鼠皮肤TGF-β1的分布情况以及强脉冲光照射后TGF-β1的表达变化。结果TGF-β1分布于大鼠正常皮肤全层,主要分布在细胞外结缔组织基质胶原纤维中。强脉冲光照射刺激大鼠皮肤分泌TGF-β1,实验组强脉冲光照射4周后,大鼠皮肤TGF-β1表达较对照组显著增强(P<0.001),阳性产物主要分布在细胞外结缔组织中。真皮浅层较对照组有非常强烈的棕黄色着染,同时皮肤表皮细胞亦出现明显的阳性表达产物。阳性表达区成纤维细胞数量明显增多。结论强脉冲光照射后上调大鼠皮肤TGF-β1的表达,是强脉冲光治疗皮肤光老化的内在机制。     

TGF—β1,PAI—1与糖尿病肾病

糖尿病时,多种机制引起转化生长因子β１（ＴＧＦ－β１）和纤溶酶原激活物抑制物１（ＰＡＩ－１）在肾脏局部过度表达。ＴＧＦ－β１有抑制细胞有丝分理解,促进细胞外基质（ＥＣＭ）合成,抑制其降解的作用,ＰＡＩ－１则抑制ＥＣＭ降解,二者共同作用,导致肾脏肥大和ＥＣ积聚。近年来,二者对糖尿病的诊断和治疗的临床意义备受人们的关注。     

葛根素诱导脂肪干细胞成骨分化的实验研究

目的观察葛根素诱导卵巢切除后骨质疏松大鼠模型的脂肪干细胞(adipose-derived stem cells,ADSCs)成骨分化的能力。方法分离、培养、传代及鉴定去卵巢骨质疏松模型大鼠ADSCs;含葛根素培养基诱导去卵巢骨质疏松大鼠ADSCs成骨分化,并测定最大有效浓度。结果去卵巢骨质疏松大鼠ADSCs成骨分化能力与加入含葛根素培养基的时间和培养基中葛根素的浓度呈正向相关,浓度为12 mmol/L时呈现无毒剂量下促进成骨分化最显著作用。结论葛根素具有较强促进去卵巢骨质疏松大鼠ADSCs成骨分化的诱导能力。     

转化生长因子β1基因修饰成骨细胞复合仿生基质材料治疗骨缺损的研究

目的：探讨转化生长广大因子β1(TGFβ1)基因修饰成骨细胞复合仿生基质材料修复鼠胫骨骨缺损的治疗效果。方法：将TGFβ1基因转染成骨细胞后与涂覆多聚赖氨酸(PLYS)的聚DL乳酸(PDLLA)仿生基质材料复合，植入鼠胫骨骨缺损模型，术后摄X线片和组织学检查观察修复情况。结果：实验绑4间时X线片可见骨痂形成，组织学观察有类骨组织和新骨形成，成骨细胞贴附于基质材料表面。8周时缺损基本修复，新骨密度与自体骨接近；照组4周时X线片未见骨痂形成，组织学观察没有类骨组织形成，基质材料表面成骨细胞贴附较少，材料腔隙中有大量淋巴细胞浸润。8周时植入材料基本吸收，为纤维组织替代。结论：将分子生物学和组织工程学结合以修复骨缺损，能获得理想的治疗效果。     

TGF—β1表达对成纤维细胞胶原分泌影响的实验研究

目的 通过siRNA干扰成纤维细胞中TGF-β1（TGF-β1）的表达,探讨其对成纤维细胞合成Ⅰ型胶原蛋白的影响.方法 将siRNA转染兔成纤维细胞,通过RT-PCR,检测siRNA对兔TGF-β1表达的干扰效果,并选筛选出有干扰效果的siRNA.把筛选出的有最佳干扰效率的siRNA,重新转染兔成纤细胞,分别取成纤维细胞培养液行ELISA检测,观察细胞培养液中合成Ⅰ型胶原蛋白变化情况.结果 和对照组相比,siTGF-β1对成纤维细胞有明显的干扰效果;siTGF-β1转染成纤维细胞后,转染组细胞分泌Ⅰ型胶原浓度曲线明显低于空白细胞组,胶原蛋白合成明显降低.结论 siRNA可通过干扰TGF-β1的表达抑制成纤维细胞I型胶原蛋白的分泌,从而抑制瘢痕生成,为临床上尿道瘢痕的基因治疗提供了理论依据.