Bax抑制因子1通过促进视神经萎缩蛋白1表达抑制小鼠动脉血管钙化

目的探讨Bax抑制因子1(BI-1)和视神经萎缩蛋白1(OPA1)蛋白对血管钙化的影响。方法ApoE^-/-糖尿病小鼠高脂喂养12周后予以腹腔注射N^ε(-1-羧甲基)-L-赖氨酸16周建立血管钙化模型, 实验将小鼠分为4组, 6只/组: 对照组(ApoE^-/-小鼠普通饲料喂养)、钙化组(ApoE^-/-小鼠建立钙化模型)、钙化+BI-1^TG组(血管特异性过表达BI-1的ApoE^-/-小鼠建立钙化模型)和钙化+ BI-1^TG+OPA1^-/-组(血管特异性过表达BI-1和基因敲除OPA1的ApoE^-/-小鼠建立钙化模型)。另β磷酸甘油诱导血管平滑肌细胞建立细胞钙化模型。使用von Kossa染色检测血管钙化程度, 使用ELISA检测主动脉钙含量, 使用免疫组织化学方法检测Runt相关转录因子2和骨形态发生蛋白2表达、使用TUNEL检测细胞凋亡率, 使用Western blot检测BI-1、OPA1、Runt相关转录因子2、骨形态发生蛋白2和活化的半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3水平的表达。结果血管钙化后, BI-1和OPA1蛋白表达均下降(P=0.0044), 钙沉积、Runt相关转录因子2、骨形态发生蛋白2及活化的半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3表达增加(P=0.0041)。过表达BI-1促进OPA1蛋白表达, 钙沉积、Runt相关转录因子2、骨形态发生蛋白2及活化的半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3表达均减少(P=0.0006)。基因敲除OPA1蛋白后, 钙沉积、Runt相关转录因子2、骨形态发生蛋白2及活化的半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3又明显增多(P=0.0007)。结论BI-1可能通过促进OPA1表达, 减轻钙沉积、细胞骨型分化和细胞凋亡, 继而抑制血管钙化。     

PFN2在胃癌组织中高表达并促进胃癌细胞的增殖和迁移

目的研究PFN2作为胃癌新的预后评价指标及作为胃癌治疗全新靶点的潜力。方法组织层面上，应用免疫组织化学检测100例胃癌组织及其癌旁组织中PFN2蛋白表达水平；根据PFN2表达量，将研究对象分为癌组织中PNF2高表达组（46例）、低表达（48例）组，以及癌旁组织中PFN2高表达组（26例）、低表达（49例）组；采用χ²检验、Spearman相关性以及Kaplan-Meier生存分析法，分析PFN2蛋白表达水平与患者的临床参数之间关系；细胞功能上，敲低MKN-45细胞中PFN2，将其分为controlsiRNA组与PFN2-siRNA组；过表达MKN-45细胞中PFN2，将其分为control-vector组与PFN2-vector组，选取Transwell实验、CCK-8实验检测PFN2对胃癌MKN-45细胞增殖及迁移影响。结果在胃癌组织中PFN2蛋白表达高于癌旁组织（P < 0.01）；PFN2蛋白的表达水平和胃癌病人的M分期显著正相关（P < 0.05）；在胃癌组织中，PFN2表达和VEGFR表达呈正相关关系（P < 0.01）；PFN2蛋白高表达的胃癌患者预后更差（P < 0.01），并且是胃癌预后的独立预测因子（P < 0.05）；MKN-45细胞中高表达PFN2组较低表达组增殖、迁移能力更强（P < 0.001）。结论PFN2蛋白在胃癌组织中高表达，并促进人胃癌MKN-45细胞的增殖、迁移。     

Leptin对缺氧状态下大鼠视网膜祖细胞体外增殖和分化的影响

目的探讨Leptin对体外培养的缺氧状态下视网膜祖细胞（RPCs）增殖、分化的影响及细胞中PTEN蛋白表达的变化。方法原代培养大鼠RPCs，不同浓度Leptin作用RPCs细胞，分为：常氧培养组（Control组）、缺氧培养（Hypoxia）+0、0.3、1.0、3.0、10、30 nmol/L Leptin组，分别培养至12、24、48 h，CCK-8法检测细胞增殖活性。将原代培养的RPCs细胞分为：Control组、Hypoxia组、Hypoxia+Leptin组，培养48 h后，转换为分化培养基继续培养6 d，采用免疫荧光染色法对GFAP阳性细胞比例和β- tubulin III阳性细胞比例进行统计分析。Control组、Hypoxia组、Hypoxia+Leptin组细胞培养48 h后，采用Western blot法检测各组RPCs中PTEN蛋白表达水平。结果原代培养的P0代RPCs为圆形悬浮生长，培养2 d后细胞可聚集成神经球。低浓度Leptin（0.3、1.0、3.0 nmol/L）作用RPCs 48 h，细胞增殖活性较Control组及Hypoxia组增强，RPCs细胞增殖活性随Leptin浓度增高呈递增趋势，其中，3.0 nmol/L Leptin作用48 h细胞增殖活性最强（P < 0.05）；高浓度Leptin（10 nmol/L，30 nmol/L）组细胞增殖活性较对照组减弱（P < 0.05）。细胞培养48 h，与Control组及Hypoxia组相比，Hypoxia+Leptin组β-tubulin III阳性细胞比例和GFAP阳性细胞比例均无显著性差异（P>0.05），而PTEN蛋白表达量较对照组显著下调（P < 0.05）。结论低浓度Leptin可促进缺氧状态下大鼠RPCs细胞增殖，抑制细胞中PTEN蛋白表达，对细胞分化无明显影响。     

巨噬细胞移动抑制因子介导MPP+/MPTP诱导的小胶质细胞NLRP3炎症小体的激活

目的探讨巨噬细胞移动抑制因子（MIF）/κb（NF-κB）对1-甲基-4-苯基吡啶离子（MPP+）/1-甲基-4-苯基-1, 2, 3, 6-四氢吡啶（MPTP）激活小胶质细胞NLRP3炎症小体的影响和机制，进而对神经元的影响。方法慢病毒MIF-shRNA感染Bv-2细胞，敲低MIF表达。Western blot检测MPP+干预的Bv-2 NLRP3和MIF表达水平、转染病毒后细胞NLRP3、p65、caspase-1表达水平及细胞核、浆蛋白p65表达水平。ELISA检测细胞培养上清液IL-1β、IL-18表达水平。将细胞培养上清液作为条件培养基培养MN9D细胞，Western blot检测TH蛋白表达水平。C57BL/6小鼠腹腔注射MPTP构建PD小鼠模型，向中脑黑质致密部立体定位注射腺相关病毒MIF-shRNA（AAV-MIF-shRNA）敲低MIF表达。对小鼠进行旷场实验、爬杆实验、悬挂实验行为学评估，组织免疫组化检测小鼠多巴胺能神经元细胞数目和小胶质细胞活化情况，Western blot检测小鼠黑质MIF、NLRP3及TH表达情况。结果感染病毒的细胞MIF mRNA（P < 0.001）和MIF蛋白（P=0.014）明显降低。Western blot显示，0.2 mmol MPP+使Bv-2细胞NLRP3（P=0.012）和MIF（P=0.019）表达增高。与MPP组比较，MIF-shRNA组NLRP3（P=0.042）和caspase-1（P=0.003）表达减少，细胞总蛋白中p65表达没有差异（P=0.978）。ELISA检测细胞上清液发现MIF-shRNA组较MPP组IL-1β（P < 0.001）、IL-18（P=0.002）水平降低。与MPP组比较，MIF-shRNA组核蛋白p65表达降低（P=0.016），浆蛋白p65表达升高（P < 0.001）。相较于MPP+的条件培养基，MN9D细胞在MIF-shRNA条件培养基中TH（P=0.01）表达增加。与MPTP组比较，注射MIF-shRNA的小鼠爬杆实验（P=0.024）和旷场实验（P=0.026）评分显著降低，悬挂实验评分显著升高（P=0.001）。组织免疫组化结果显示，相较于MPTP组，AAV-MIF-shRNA组小鼠TH阳性神经元细胞数量增多（P=0.004），小胶质细胞数量减少（P=0.049）。MIF（P=0.033）、NLRP3表达减少（P=0.045），TH蛋白明显增多（P=0.043）。结论抑制MIF表达可以减少MPP+/MPTP干预所引起的小胶质细胞NLRP3炎症小体表达和炎症因子释放，减轻小胶质细胞激活，减轻炎症反应，改善MPTP引起的黑质多巴胺能神经元损伤，在帕金森病神经炎症方面具有保护作用。     

MiRNA-26a通过调控结缔组织生长因子缓解血管平滑肌细胞的钙化

目的探究miRNA-26a调控结缔组织生长因子对血管平滑肌细胞钙化的作用。方法将细胞分为对照组、模型组、模型+ {"type":"entrez-nucleotide","attrs":{"text":"AR234960","term_id":"27277916","term_text":"AR234960"}}AR234960组、{"type":"entrez-nucleotide","attrs":{"text":"AR234960","term_id":"27277916","term_text":"AR234960"}}AR234960+miR-26a mimic组和miR-26a mimic组。对照组细胞正常培养基培养，模型组VSMC细胞诱导钙化，模型+{"type":"entrez-nucleotide","attrs":{"text":"AR234960","term_id":"27277916","term_text":"AR234960"}}AR234960组的VSMC细胞诱导钙化后加入{"type":"entrez-nucleotide","attrs":{"text":"AR234960","term_id":"27277916","term_text":"AR234960"}}AR234960激动剂干预，{"type":"entrez-nucleotide","attrs":{"text":"AR234960","term_id":"27277916","term_text":"AR234960"}}AR234960+miR-26a mimic组的VSMC细胞诱导钙化后用{"type":"entrez-nucleotide","attrs":{"text":"AR234960","term_id":"27277916","term_text":"AR234960"}}AR234960激动剂和miR-26a mimic处理，miR-26a mimic组的VSMC细胞诱导钙化后转染miR-26a mimic。茜素红染色测定各组细胞钙化沉积；试剂盒检测各组细胞碱性磷酸酶（ALP）活性；荧光定量PCR和Western blot检测各组细胞miR-26a、OPG、OPN、BMP-2、Collagen Ⅱ基因和蛋白表达情况。双荧光素酶基因验证miR-26a与CTGF的结合。结果平滑肌A7r5细胞钙化后，miR-26a的表达随着钙化时间的增加而降低（P＜0.05），而CTGF的表达随钙化时间的增加而增加（P＜0.05）。茜素红染色结果显示，{"type":"entrez-nucleotide","attrs":{"text":"AR234960","term_id":"27277916","term_text":"AR234960"}}AR234960能够增加细胞的钙化程度，而miR-26a mimic能够减轻细胞钙化。与对照组相比，模型组ALP活性、OPN、BMP-2、Collagen Ⅱ mRNA和蛋白的表达显著升高（P＜0.05），OPG mRNA和蛋白的表达显著降低（P＜0.05）；与模型组相比，模型+{"type":"entrez-nucleotide","attrs":{"text":"AR234960","term_id":"27277916","term_text":"AR234960"}}AR234960组上述指标均无显著差异（P＞0.05），而miR-26a mimic组ALP活性、OPN、BMP-2、Collagen Ⅱ mRNA和蛋白的表达显著降低（P＜0.05），OPG mRNA和蛋白的表达显著升高（P＜0.05）；与miR-26a mimic组相比，{"type":"entrez-nucleotide","attrs":{"text":"AR234960","term_id":"27277916","term_text":"AR234960"}}AR234960+miR-26a mimic组ALP活性、OPN、BMP-2、Collagen Ⅱ mRNA和蛋白的表达显著升高（P＜0.05），OPG mRNA和蛋白的表达显著降低（P＜0.05）。双荧光素酶基因检测结果显示，miR-26a-inhibitor组CTGF 3''-UTR野生型中相对荧光素酶活性较miR-26a-mimic组显著升高（P＜0.05）。结论miRNA-26a能够有效降低细胞中ALP活性及OPN、BMP-2、Collagen Ⅱ的表达，同时增加钙化细胞中OPG水平，为miRNA-26a通过调控CTGF水平进而对缓解血管平滑肌细胞钙化提供了理论依据。     

钙结合蛋白在健康牙周组织和实验性牙周炎组织的表达分布

目的观察比格犬相对健康的牙周组织和实验性牙周炎的牙周组织标本中钙结合蛋白的表达分布和细胞定位，探讨其与牙周炎症的关系和可能发挥的作用。方法结扎法诱导建立比格犬下颌第二磨牙实验性牙周炎模型，对侧同名牙作为健康对照，诱导12周后处死，组织脱矿后常规制作连续切片，免疫组织化学法检测钙结合蛋白在比格犬健康和实验性牙周炎的组织标本中的表达和分布，明确细胞定位；免疫细胞化学法检测体外培养的原代人牙周组织细胞中钙结合蛋白的表达。结果在健康牙龈组织中，钙结合蛋白表达于牙龈上皮、中性粒细胞，且在结合上皮处呈强阳性表达；牙周炎症病损中，牙龈上皮细胞钙结合蛋白表达水平上调，存在强表达钙结合蛋白的中性粒细胞大量浸润，成纤维样细胞(牙龈结缔组织、牙周膜组织)、骨髓成纤维细胞、微血管内皮细胞存在钙结合蛋白的诱导表达；在体外培养的人牙周膜细胞、人牙龈成纤维细胞中均检测到钙结合蛋白的表达。结论钙结合蛋白组成性表达于牙龈上皮细胞、中性粒细胞，可能对维持牙周组织内环境稳定和完整性发挥重要作用。牙周炎症诱导牙龈成纤维细胞、牙周膜细胞、骨髓成纤维细胞和血管内皮细胞表达的钙结合蛋白可能在抗微生物感染、促炎症细胞迁移等方面发挥作用。     

miR-424通过调控ATG14的表达抑制肝癌细胞的自噬和增殖

目的研究miR-424通过调控ATG14表达影响自噬和肝癌细胞增殖。方法收集肝癌患者因手术切除的肝癌组织及其癌旁组织，采用qRT-PCR法检测肝癌组织中miR-424-5p，ATG14的表达。培养人肝癌细胞系HepG2、SMMC-7721、Huh-7、MHCC97H、HCCLM3和人正常肝细胞LO2，qRT-PCR法检测上述各细胞系的miR-424-5p表达，选取表达量较高的Huh-7和表达量较低的HCCLM3肝癌细胞为研究对象，Huh-7细胞实验分组（n=3）：干扰miR-424-5p表达阴性对照组（in-NC组），干扰miR-424-5p表达组（in-miR-424-5p组）；HCCLM3细胞实验分组（n=3）：过表达miR-424-5p组（mi-miR-424-5p组），另设过表达miR-424-5p阴性对照组（mi-NC组）；过表达miR-424-5p阴性对照+过表达ATG14阴性对照组（mi-NC+NC组）；过表达miR-424-5p阴性对照+过表达ATG14组（mi-NC+ ATG14组）；过表达miR-424-5p+过表达ATG14阴性对照组（mi-miR-424-5p+NC组）；过表达miR-424-5p+过表达ATG14组（mi-miR-424-5p+ATG14组）。qRT-PCR法及Western blot法验证各组miR-424-5p和ATG14的转染情况。采用MTT法检测各组细胞的细胞增殖，流式细胞术检测各组细胞的细胞凋亡水平，Western blot检测各组细胞的ATG14和自噬相关蛋白LC3、Beclin1和P62的表达水平，双荧光素酶报告基因实验检测miR-424-5p和ATG14之间的相互作用。结果在肝癌组织和细胞中ATG14高表达，miR-424-5p低表达。与相应对照组相比，过表达miR-424-5p抑制肝癌细胞增殖和促进凋亡（P < 0.05）；干扰miR-424-5p表达及过表达ATG14促进肝癌细胞增殖和抑制凋亡（P < 0.05）；miR-424可能通过靶向ATG14发挥抑癌的作用。干扰miR-424-5p表达及过表达ATG14均能提高肝癌细胞自噬体标志蛋白LC3-ΙΙ/LC3-Ι、Beclin1的表达水平（P < 0.05），降低自噬受体蛋白P62的表达水平（P < 0.05）；过表达miR-424-5p则降低肝癌细胞自噬体标志蛋白LC3-ΙΙ/ LC3-Ι、Beclin1的表达水平（P < 0.05），提高自噬受体蛋白P62的表达水平（P < 0.05）。结论miR-424调控ATG14表达影响自噬，从而抑制肝癌细胞增殖。     

抑制Sonic Hedgehog信号能抑制脑缺血性损伤后纤维瘢痕形成且不利于神经功能恢复

目的探讨抑制Sonic Hedgehog（Shh）信号对脑缺血性损伤后纤维瘢痕形成及神经功能的影响。方法构建体内成年SD大鼠大脑中动脉闭塞/再灌注（MCAO/R）模型和体外新生24 h SD大鼠脑膜原代成纤维细胞氧糖剥夺/再复氧（OGD/R）模型。成年SD大鼠随机分成假手术组、缺血/再灌注组（I/R）、缺血再灌注腺病毒空载（rAd-NC）组和缺血再灌注腺病毒敲低Shh（rAd-ShShh）组。SD大鼠脑膜原代成纤维细胞随机分成正常组、缺血对照组、肿瘤生长因子-β1预处理组（TGF-β1）、TGF-β1预处理加环王巴明组（TGF-β1+CYC）。每组细胞被预处理24 h经OGD/R 150 min后复氧72 h。采用改良神经严重程度评分（mNSS）、改良Bederson评分评估神经功能缺损。CCK-8法测定细胞增殖，划痕实验检测细胞迁移，免疫荧光法检测缺血中心纤维连接蛋白（Fn）、α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）、Shh的表达，TUNEL染色检测缺血中心细胞凋亡，实时荧光定量PCR（qPCR）法检测缺血中心Fn、α-SMA及Shh mRNA的表达，WB法检测OGD/R后成纤维细胞Shh、α-SMA蛋白的表达。结果体内实验中免疫荧光法及qPCR法结果显示与假手术组相比SD大鼠MCAO/R后可诱导缺血侧大脑半球Shh、α-SMA、Fn蛋白和mRNA的表达升高（P < 0.05）。而与MCAO/R组相比，rAd-Shshh组缺血侧大脑半球Shh、α-SMA、Fn蛋白和mRNA的表达降低（P < 0.05），缺血侧组织细胞的凋亡增加（P < 0.05），改良神经严重程度评分（mNSS）、改良Bederson评分增高（P < 0.05）。体外研究中CCK-8实验显示与正常组和缺血对照组相比TGF-β1组A值升高（P < 0.05），而TGF-β1+CYC组与TGF-β1组相比A值没有明显差异（P > 0.05）。细胞划痕实验结果显示与正常组和缺血对照组相比在24 h内TGF-β1组成纤维细胞的迁移距离增加（P < 0.05），而TGF-β1+CYC组与TGF-β1组相比成纤维细胞的迁移距离减少（P < 0.05）。免疫荧光实验、Western blot及qPCR显示与正常组和缺血对照组相比TGF-β1组细胞Shh、α-SMA和Fn的表达升高（P < 0.05），而TGF-β1+CYC组与TGF-β1组相比Shh、α-SMA和Fn的表达降低（P < 0.05）。结论抑制Shh信号能抑制脑缺血性损伤早期纤维瘢痕的形成且不利于神经功能的恢复。     

复方保肝宁减轻小鼠肝纤维化的机制：抑制肝脏组织中的IDO1进而促进树突状细胞表型成熟

目的观察中药复方保肝宁对肝纤维化模型小鼠的保护作用并探讨其作用机制。方法本研究分为两部分，第1部分：按0.6 mL/（kg·d）予以腹腔注射25% CCl₄（CCl₄∶橄榄油=1∶3）的方式诱导野生型小鼠建立肝纤维化病理模型，随机分为对照组、模型组、阳性对照组及保肝宁低、中、高浓度组，10只/组。造模给药8周后处死小鼠，取小鼠血清检测AST、ALT水平。另取肝组织做HE、天狼星红染色及α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）免疫组化染色并检测吲哚胺2, 3-双加氧酶1（IDO1）的表达水平。流式细胞仪检测小鼠肝脏树突状细胞（DCs）及T细胞的数量和表型变化。第2部分：按3×10¹¹ v.g/只尾静脉注射IDO1过表达腺相关病毒，取正常野生型小鼠随机分为腺相关病毒阴性对照（AAV9-NC）干预组、IDO1过表达腺相关病毒（AAV9-IDO1）干预组及高浓度保肝宁+IDO1过表达腺相关病毒联合干预组，6只/组。干预4周后，取肝组织做IDO1免疫组化染色并检测小鼠肝脏树突状细胞（DCs）及T细胞的表型变化。结果与模型组比较，保肝宁高浓度组能有效降低肝纤维化小鼠血清中AST、ALT水平（P < 0.01）；改善肝组织病理损伤，减少肝纤维组织的形成及α-SMA和IDO1的沉淀（P < 0.05）。保肝宁高浓度治疗组肝纤维化小鼠肝脏中CD11C⁺DCs、CD11C⁺CD80⁺DCs、CD11C⁺CD86⁺DCs、CD11C⁺CD40⁺ DCs、CD11C⁺MHCII⁺ DCs细胞和CD3⁺T、CD3⁺CD4⁺T细胞比例与模型组相比均呈不同程度的升高（P < 0.05）。高浓度保肝宁干预后可显著降低IDO1过表达腺相关病毒干预小鼠肝脏中IDO1的表达水平及上调CD11C⁺CD40⁺ DCs、CD11C⁺MHCII⁺ DCs和CD3⁺CD4⁺T细胞比例（P < 0.05）。结论保肝宁对CCl4所致小鼠肝纤维化具有一定的治疗作用，其机制可能与降低肝组织中IDO1的表达水平继而促进肝脏中DCs表型成熟使DCs刺激T细胞增殖能力增强有关。     

氧化苦参碱通过抑制CHK1/2磷酸化改善糖尿病大鼠肾组织的纤维化和炎症

目的探讨氧化苦参碱（OMT）抗炎抗纤维化是否是通过影响细胞周期检测点激酶1/2（CHK1/2）来发挥。方法SD大鼠采用完全随机设计分为正常对照组（NC）、糖尿病模型组（DM）和氧化苦参碱治疗组（OMT），6只/组，尾静脉注射链脲佐菌素（STZ）（55 mg/kg）复制糖尿病模型。HE、Masson染色观察病理组织形态学变化；免疫组织化学染色观察CHK1、CHK2、p-CHK1、p-CHK2的表达部位；ELISA检测肾组织上清中IL-6和IL-1β的含量；Western blot检测CHK1、CHK2、p-CHK1、p-CHK2、Ⅲ型胶原（Col-Ⅲ）、Ⅳ型胶原（Col-Ⅳ）、纤维连接蛋白（FN）蛋白的表达水平；NRK-52E细胞按处理方式分为正常糖对照组（NG组）、高糖模型组（HG组）、正常糖用药组（NG+OMT组）、高糖用药组（HG+OMT组）、正常糖空载组（NG+con组）、正常糖敲低组（NG+siCHK1/2）、高糖空载组（HG+con组）、高糖敲低组（HG+siCHK1/2），Western blot检测CHK1、CHK2、p-CHK1、p-CHK2、Col-Ⅲ、Col-Ⅳ、FN蛋白的表达水平。结果OMT可降低大鼠血糖、血肌酐和24 h尿蛋白（P＜0.05）；DM组大鼠肾脏已出现炎性细胞浸润和纤维化表型，OMT组有所改善；OMT有明显抗炎作用（P＜0.05）；CHK1/2主要表达在肾小管胞浆及胞核，DM组CHK1/2磷酸化水平高于NC组、OMT组；大鼠肾组织和NRK-52E细胞中经OMT治疗后p-CHK1、p-CHK2、Col-Ⅲ、Col-Ⅳ、FN蛋白表达含量均明显下降（P＜0.05）；敲低CHK1/2后p-CHK1/2、Col-Ⅲ、Col-Ⅳ、FN蛋白表达均明显下降（P＜0.05）。结论OMT在糖尿病大鼠肾脏中发挥抗炎、抗纤维化的作用机制可能是通过影响CHK1、CHK2的表达从而影响其磷酸化水平，减少下游炎症介质的释放，减轻细胞外基质的分泌和沉积。     

Numb通过上调V1G1的表达激活近端肾小管细胞mTORC1信号通路

目的探讨Numb对哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）复合物1（mTORC1）信号通路活性的影响及潜在的分子机制。方法建立Numb-siRNA转染和/或顺铂诱导的雄性BALB/c小鼠急性肾损伤模型，分为4组：NC-siRNA、Numb-siRNA、NC-siRNA+顺铂、Numb-siRNA+顺铂。免疫组化检测肾脏Numb、Megalin的表达与分布；Western blot检测各组动物肾脏中Numb、S6、p-S6、S6K1、p-S6K1、4EBP1、p-4EBP1的蛋白表达。分离培养Numb-siRNA转染的小鼠原代近端肾小管上皮细胞。体外建立Numb-siRNA转染和/或氨基酸刺激的大鼠肾小管上皮NRK-52E细胞模型，分为NC-siRNA组、Numb-siRNA组、NC-siRNA+ 氨基酸刺激组和Numb-siRNA+氨基酸刺激组。Western blot检测各组细胞Numb、S6、p-S6的蛋白表达，检测沉默Numb表达前后的NRK-52E细胞、小鼠肾脏及原代近端肾小管上皮细胞中AMPK、p-AMPK的蛋白表达。V1G1过表达及空白对照慢病毒感染、Numb-siRNA转染和/或氨基酸刺激NRK-52E细胞，分为NC-siRNA+空载慢病毒+氨基酸刺激组、Numb-siRNA+空载慢病毒+氨基酸刺激组及Numb-siRNA+V1G1过表达慢病毒+氨基酸刺激组；Western blot检测V1G1、S6、p-S6的蛋白表达。结果与NC-siRNA组相比，Numb-siRNA组小鼠肾脏近端肾小管上皮细胞Numb及p-S6的蛋白表达均下调（P < 0.05），但不影响近端小管标记蛋白Megalin的表达与分布；与对照组小鼠相比，顺铂处理组小鼠肾脏p-S6K1及p-4EBP1的蛋白表达均上调（P < 0.05），而Numb-siRNA处理组小鼠抑制顺铂介导的p-S6K1及p-4EBP1的蛋白表达水平的上调（P < 0.05）。在NRK-52E细胞中，与氨基酸饥饿组相比，氨基酸刺激组细胞p-S6的蛋白表达上调（P < 0.05），而转染Numb-siRNA的细胞中Numb及p-S6的蛋白表达较对照组均下调（P < 0.05）；在Numb表达水平下调的NRK-52E细胞、小鼠肾脏及小鼠原代近端肾小管上皮细胞中，p-AMPK的蛋白表达均下调（P < 0.05）；在Numb表达水平下调的NRK-52E细胞中，V1G1的蛋白表达下调（P < 0.05），上调NRK-52E细胞中V1G1的蛋白表达，可以逆转Numb沉默介导的p-S6的降低（P < 0.05）。结论Numb可通过上调V1G1的蛋白表达促进近端肾小管上皮细胞mTORC1信号通路的活化。     

ELF4通过激活Akt通路促进胰岛素瘤细胞增殖并抑制细胞凋亡

目的探索ELF4促进胰岛素瘤细胞增殖与抗凋亡的作用及其机理。方法利用逆转录病毒载体系统，构建稳定高表达ELF4的胰岛素瘤细胞BON-ELF4，以及载体对照组细胞BON-Vector。采用MTT法检测胰岛素瘤细胞BON-ELF4和BONVector各组细胞的生长情况。采用0.1 μmol/L化疗药物表阿霉素处理BON-ELF4和BON-Vector细胞24 h后，检测细胞凋亡相关指标，采用免疫印迹法检测各组肿瘤细胞中凋亡通路关键因子caspase-9，caspase-8和PARP切割带的表达水平；采用Annexin V-FITC/PI双染色结合流式细胞术分析各组细胞凋亡情况。采用免疫印迹法检测胰岛素瘤细胞BON-ELF4和BONVector细胞中Akt磷酸化水平。结果免疫印迹法检测结果显示，BON-ELF4细胞中ELF4蛋白表达量高于对照组细胞BONVector（P=0.013），稳定高表达外源性ELF4蛋白的细胞系BON-ELF4构建成功。稳定高表达ELF4的细胞系BON-ELF4生长明显较快（P < 0.05）。相比较于载体对照组BON-Vector，BON-ELF4细胞在0.1 μmol/L表阿霉素处理24 h后caspase-8，caspase-9的蛋白前体降低，而caspase-8，caspase-9切割成熟体升高（P < 0.05）；同时，相应的PARP切割带随着ELF4的高表达而降低（P < 0.05）；流式细胞术检测结果显示，22.90%的载体对照组BON-Vector细胞呈现出Annexin V阳性、PI阴性的早期凋亡结果，6.03%的BON-ELF4细胞组呈现出Annexin V阳性、PI阴性的早期凋亡结果。外源高表达ELF4的肿瘤细胞中Akt的磷酸化显著升高（P < 0.05），而Akt总蛋白的水平基本未受影响（P>0.05）。结论ELF4能通过激活Akt通路而促进胰岛素瘤细胞增殖和抗凋亡。     

miR-20a-5p通过下调HOXB13基因表达抑制肺癌细胞系A549增殖

目的探讨miR-20a-5p调控HOXB13基因表达抑制肺癌细胞系A549增殖的分子机制。方法转染HOXB13过表达质粒与HOXB13 siRNA到肺癌细胞系A549，通过qRT-PCR及Western blot实验检测HOXB13 mRNA及蛋白的表达水平；CCK-8及EdU实验检测HOXB13对肺癌细胞系A549细胞增殖的影响；利用生物信息学分析筛选HOXB13可能结合的miRNA；通过qRT-PCR检测转染miR-20a-5p mimic与miR-20a-5p inhibitor到肺癌细胞系后miR-20a-5p的表达水平；Western blot实验检测HOXB13在肺癌细胞系中的表达情况；CCK-8及EdU实验检测miR-20a-5p肺癌细胞系A549细胞增殖的影响；在A549细胞中共转染miR-20a-5p mimic及HOXB13过表达质粒，CCK-8及EdU实验检测A549细胞增殖能力。结果HOXB13促进了A549细胞的增殖（P＜0.05）；生物信息学筛选出HOXB13可能结合的miRNA为miR-20a-5p；在肺癌细胞系中过表达miR-20a-5p后，HOXB13蛋白表达量降低（P＜0.05）；而干扰miR-20a-5p表达后，HOXB13蛋白的表达量升高（P＜0.05）；细胞增殖实验结果显示，miR-20a-5p与HOXB13对细胞增殖的影响相反，miR-20a-5p及HOXB13同时过表达，细胞增殖情况介于单独过表达miR-20a- 5p及单独过表达HOXB13组之间（P＜0.05）。结论miR-20a-5p调控HOXB13基因表达抑制肺癌细胞系A549的增殖。     

血管抑制素-2通过调控上皮细胞间质化促进宫颈癌细胞的增殖和转移

目的探讨血管抑制素-2（VASH2）能否促进宫颈癌细胞在体外的增殖和转移及其可能的分子机制。方法在外源性过表达和干扰内源性flotillin-1表达的宫颈癌细胞中，通过公共数据库结合RNA-seq挖掘分析差异表达基因；在宫颈正常上皮细胞（HcerEpic细胞）和宫颈癌细胞（HeLa、C-33A、Ca ski、SiHa和MS751）以及不同淋巴结转移状态的新鲜宫颈癌组织中检测VASH2的表达；运用慢病毒稳定表达载体构建外源性过表达VASH2和干扰内源性VASH2表达的宫颈癌细胞及对照细胞，并检测其增殖、迁移、侵袭和淋巴管形成的情况；在上述细胞模型中检测上皮细胞间质化（EMT）过程关键分子及TGF-β的表达水平。结果RNA-seq发现在外源性过表达flotillin-1的宫颈癌细胞中VASH2的表达上调（P < 0.05），而在抑制内源性flotillin-1表达的细胞中VASH2表达下调（P < 0.05），并在公共数据库中证实VASH2在有淋巴结转移的宫颈癌组织中相对于无淋巴结转移的癌组织呈高表达（P < 0.01）。相对于HcerEpic细胞和淋巴结未转移的宫颈癌组织，VASH2在Ca Ski、SiHa、MS751细胞和有淋巴结转移的宫颈癌组织中表达上调（P < 0.05）；相对于对照细胞，外源性过表达VASH2的宫颈癌细胞增殖、迁移、侵袭和淋巴管形成能力增强，而抑制内源性VASH2表达的宫颈癌细胞上述能力则受到抑制（P < 0.05）；相对于对照细胞，外源性过表达VASH2的宫颈癌细胞中EMT过程的关键分子E-cadherin下调，N-cadherin、Vimentin和VEGF-C上调，而抑制内源性VASH2表达的宫颈癌细胞中E-cadherin上调，N-cadherin、Vimentin和VEGF-C下调（P < 0.05）；外源性过表达VASH2的宫颈癌细胞中TGF-β的mRNA表达水平上调，而抑制内源性VASH2表达的宫颈癌细胞中TGF-β的mRNA表达水平下调（P < 0.001）。结论flotillin-1可能通过下游靶基因VASH2参与TGF-β信号通路诱导EMT过程在体外促进宫颈癌细胞的增殖、迁移、侵袭和淋巴管形成。     

VIPR1启动子甲基化促进转录因子AP-2α下调VIPR1的表达并促进肝细胞癌的生长

目的探讨血管活性肠肽受体1（VIPR1）在肝细胞癌（HCC）组织中低表达的转录调控机制和生物学功能。方法肝癌细胞系Hep3B和Huh7常规培养，实验分为VIPR1启动子野生型组、启动子突变载体1组、启动子突变载体2组和启动子突变载体1+ 2组。双荧光素酶报告基因实验检测AP-2α表达对VIPR1启动子活性的影响；DNA甲基化转移酶抑制剂（DAC）处理肝癌细胞，焦磷酸测序法检测VIPR1启动子甲基化水平的变化；染色质免疫共沉淀检测AP-2α与VIPR1启动子的结合能力；Western blot检测AP-2α的敲减作用以及VIPR1的表达；Western blot检测两种细胞株中VIPR1的差异表达；qPCR和Western blot检测VIPR1过表达和敲减效果；流式细胞术检测细胞周期和细胞凋亡；CCK8实验检测细胞增殖。建立裸鼠移植瘤模型，检测LV-NC组和LV-VIPR1组中肿瘤的体积和质量。结果与VIPR1启动子野生型组相比，启动子突变载体1+2与AP-2α表达质粒共转染后，荧光素酶活性明显恢复（P < 0.05）；DAC处理后，VIPR1启动子甲基化水平降低，并且随着甲基化程度减弱，与VIPR1启动子结合的AP-2α显著减少（P < 0.01）；敲减AP-2α后，VIPR1表达上升；Huh7细胞株中VIPR1表达低于Hep3B细胞株，在两种细胞株中成功构建了VIPR1过表达和敲减模型，VIPR1过表达增加了G2/M期的细胞数量（P < 0.01），凋亡细胞显著增加（P < 0.001），细胞增殖受到抑制（P < 0.001），而VIPR1敲低则相反。体内实验表明VIPR1过表达组的肿瘤体积减小（P < 0.001），肿瘤量降低（P < 0.05）。结论HCC中VIPR1的启动子甲基化促进了转录因子AP-2α的结合，并且抑制了VIPR1表达，而VIPR1过表达可使细胞周期阻滞在G2/M期，促进细胞凋亡，抑制细胞增殖和肿瘤生长。     

人参皂苷Rh2调控盘状结构域受体1对糖尿病大鼠肾纤维化和细胞凋亡的影响

目的分析人参皂苷Rh2（G-Rh2）对糖尿病肾病（DN）大鼠肾纤维化和细胞凋亡的影响及其作用机制。方法SPF级，雄性，SD大鼠30只，随机分为对照组（Control组）、DN组以及G-Rh2药物干预组。DN和G-Rh2药物干预组大鼠腹腔注射链脲佐菌素构建DN大鼠模型，Control组大鼠给予等量的柠檬酸缓冲溶液注射。待DN大鼠模型构建成功后，G-Rh2药物干预组给予G-Rh2（20 mg·kg^-1·d^-1）连续灌胃12周，Control和DN大鼠给予等量的生理盐水灌胃。HE染色和PAS染色观察大鼠肾组织形态，Masson染色观察大鼠肾组织纤维化程度，TUNEL染色观察肾组织细胞凋亡情况；Western blot检测大鼠肾组织CollagenⅠ、CollagenⅢ、Cleaved-caspase-3、Bcl-2、DDR1表达水平；免疫组化定位检测肾组织DDR1表达情况。结果与Control组相比，DN组肾组织纤维化程度加重，细胞凋亡指数升高（P < 0.01），CollagenⅠ、CollagenⅢ、Cleaved-caspase-3、DDR1表达上调（P < 0.01），Bcl-2表达下调（P < 0.01）；与DN组相比，G-Rh2药物干预组肾组织纤维化程度，细胞凋亡指数，CollagenⅠ、CollagenⅢ、Cleavedcaspase-3、DDR1表达均显著降低（P < 0.05或P < 0.01），Bcl-2表达显著升高（P < 0.05）。结论G-Rh2抑制糖DN肾纤维化和细胞凋亡可能与下调DDR1表达有关。     

Mage-D1与活化后的p75神经营养因子受体结合可正向调节大鼠外胚间充质干细胞的矿化

目的检测Mage-D1与活化后p75NTR的结合及对外胚间充质干细胞（EMSCs）矿化的调控。方法取孕19.5 d SD大鼠牙胚，组织贴壁法获取EMSCs，流式细胞术检测细胞表面抗原。设置实验分组：空白对照组（NC），100 ng/mL NGF刺激组（100 ng/ mL NGF）、慢病毒干扰Mage-D1组（SH-Mage-D1）。邻位连接技术检测Mage-D1与经NGF活化后p75NTR结合的变化，并比较不同分组间的结合强度差异。茜素红与ALP染色观察染色，RT-PCR与Western blot检测ALP、Runx2、OCN、BSP、OPN、Col1、Msx1及Dlx1的表达水平。结果组织块贴壁法获得孕19.5 dEMSCs，流式细胞术检测细胞表面抗原结果为CD44、CD90、CD29、CD146，CD105高表达，CD45低表达；邻位连接法检测Mage-D1与经NGF活化后p75NTR的结合随着时间的延长而增多，且实验组与对照组相比结合强度差异具有统计学意义（P＜0.05）；茜素红与ALP染色结果显示矿化结节与碱性磷酸酶与强度变化一致；RT-PCR与Western blot检测ALP、Runx2、OCN、BSP、OPN、Col1、Msx1及Dlx1在100 ng/mL NGF组最高（P＜0.05）。结论Mage-D1在外胚层间充质细胞中可与经NGF活化后的p75NTR直接结合，且二者的结合对EMSCs的矿化有正向调节作用。     

抑制线粒体活性氧自由基可减轻高糖诱导的心肌细胞焦亡和铁死亡

目的探讨抑制线粒体氧化应激和炎症小体减轻高糖诱导的H9C2心肌细胞焦亡和铁死亡的作用，分析线粒体活性氧自由基（ROS）和炎症小体之间可能的上下游关系。方法将H9C2心肌细胞按照随机数字表法随机分为5组。正常对照组（CON）：含25 mmol/L浓度葡萄糖的DMEM完全培养基；高糖损伤组（HG）：含35 mmol/L浓度的高糖完全培养基；高糖+线粒体抗氧化剂Mitoquinone（MitoQ）组（HG+MitoQ）：35 mmol/L高糖完全培养基中加入终浓度为0.5 μmol/mL的MitoQ；高糖+ NLRP3抑制剂MCC950组（HG+MCC950）：35 mmol/L高糖完全培养基中加入终浓度为1 μmol/mL的MCC950；高糖组+MCC950+线粒体电子传递抑制剂Rotenone（ROT）组（HG+MCC950+ROT）：35 mmol/L高糖完全培养基中加入终浓度为1 μmol/mL的MCC950和0.5 μmol/mL的ROT。各组心肌细胞干预24 h后，CCK-8法测定细胞活性；CellRox和MitoSox荧光探针分别测定心肌细胞内和线粒体氧化应激水平变化；免疫荧光法检测细胞内NLRP3炎症小体水平；Western blot检测心肌细胞中NLRP3、GSDMD和CleavedGSDMD（GSDMD-NT）等焦亡相关重要因子的蛋白表达和铁死亡相关因子GPX4蛋白表达。结果与CON组相比，HG组细胞活性明显下降（P < 0.01），心肌细胞和线粒体内ROS荧光强度（P < 0.01）、NLRP3免疫荧光强度（P < 0.01）以及焦亡相关因子NLRP3，GSDMD和GSDMD-NT的蛋白表达（P < 0.01）均明显升高，铁死亡相关因子GPX4蛋白表达下降（P < 0.01）。与HG组相比，HG+ MitoQ和HG+MCC950组细胞活性明显升高（P < 0.01），细胞和线粒体内ROS荧光强度（P < 0.01）、NLRP3免疫荧光强度（P < 0.01）以及NLRP3、GSDMD和GSDMD-NT的蛋白表达明显降低（P < 0.05），GPX4蛋白表达增高（P < 0.01）。与HG组相比，HG+ MCC950+ROT组细胞活性和NLRP3、GSDMD-NT的蛋白表达无明显差异（P>0.05）；但与HG+MCC950组相比，HG+MCC950+ ROT组细胞活性明显降低（P < 0.01），ROS荧光强度、NLRP3炎症小体免疫荧光以及NLRP3、GSDMD-NT的蛋白表达均明显升高，GPX4蛋白表达降低（P < 0.05）。结论MitoQ直接抑制线粒体ROS的产生减轻了高糖诱导的心肌细胞NLRP3炎症小体的生成，减少焦亡和铁死亡的发生；抑制NLRP3炎症小体减少线粒体ROS的产生；线粒体ROS和NLRP3之间可能存在着相互影响。     

雌二醇通过上调IRE1α-XBP1信号轴抑制小鼠腹腔巨噬细胞的分化

目的研究雌二醇其通过内质网应激通路影响巨噬细胞免疫特性的可能机制。方法提取C57小鼠腹腔巨噬细胞，IFN-γ 60 ng/mL作用下体外培养巨噬细胞，分组检测雌激素对巨噬细胞影响：实验组为雌二醇（1.0 nmol/L）处理；抑制剂组为雌二醇（1.0 nmol/L）和雌激素受体拮抗剂（Acolbifene, 4 nmol/L）同时作用；对照组加等量PBS处理，培养48 h后通过Western blot法检测比较巨噬细胞极化蛋白MHC-Ⅱ、iNOS和内质网应激标志性蛋白IRE1α、eIF2α和ATF6的表达水平，通过RT-PCR法检测巨噬细胞TGF-β、IL-6、IL-10、TNFα mRNA水平变化。随后分组检测内质网应激对巨噬细胞的影响：雌激素处理组；雌激素和内质网IRE1α信号抑制剂（4 μ 8 C，50 μmol/L）处理组；IRE1α激动剂组（TG，0.2 nmol/L）处理组；对照组加等量PBS处理，随后检测巨噬细胞的分化情况。结果和对照组比较，雌激素处理后巨噬细胞M1相关蛋白MHC-Ⅱ（P=0.021）和iNOS（P < 0.001）表达显著降低，促炎细胞因子TNF-α（P=0.003）和IL-6 mRNA（P=0.004）表达下调，抗炎的M2型细胞因子TGF-β（P=0.002）和IL-10（P=0.008）mRNA表达上升，同时发现内质网相关的IRE1α（P < 0.001）蛋白活化水平升高，其下游转录因子XBP-1（P < 0.001）表达上调，加入雌激素受体阻断剂能够改变这种变化。和单纯雌激素处理组比较，在培养基中加入雌激素的同时加入IRE1α抑制剂4 μ 8 C会导致巨噬细胞M1相关蛋白MHC-Ⅱ（P=0.002）和iNOS（P=0.003）表达显著上调，促炎细胞因子TNF-α（P=0.003）和IL-6 mRNA（P=0.024）表达上调，抗炎的M2型细胞因子TGF-β（P < 0.001）和IL-10（P < 0.001）mRNA表达下调，而激动IRE1α通路会矫正这种变化。结论雌激素能够通过上调IRE1α-XBP-1信号轴抑制巨噬细胞促炎表型的分化，从而对炎症反应发挥抑制作用。     

苦参碱联合LY294002对人髓系白血病K562细胞增殖、凋亡和细胞周期的影响

目的探究苦参碱（Mat）联合LY294002对人髓系白血病K562细胞增殖、凋亡和细胞周期的影响及可能机制。方法采用CCK-8法检测不同浓度Mat单药和联合LY294002对K562细胞增殖的影响；将K562细胞分为对照组、Mat组、LY294002组和Mat+LY294002组，分别采用0.4 g/L Mat及10 μmol/L LY294002单独或联合干预48 h后，应用光学显微镜观察细胞形态变化，流式细胞术annexin Ⅴ-FITC/PI双标记检测细胞凋亡，PI单标记检测细胞周期变化，Western blot法检测Mat联合LY294002对K562细胞p-mTOR、p-PI3K、Akt、p-Akt、CyclinD1、Bcl-2、Caspase-9蛋白表达的影响。结果CCK-8结果显示，不同浓度Mat单药和联合LY294002均可抑制K562细胞的增殖，具有时间和浓度依赖性，且联合组增殖抑制率比单药组明显升高（P＜0.01）。形态学检查显示，联合用药组比单药组凋亡表现更明显。流式细胞结果显示，与对照组及单药组相比，联合组显著促进细胞凋亡（[42.50±2.63）%，P＜0.01]，显著增加了细胞周期G₀/G₁期细胞比率（[57.23±1.44）%，P＜0.01]。Western blot结果表明，两药联合后K562细胞p-mTOR、CyclinD1、p-PI3K、p-Akt、Bcl-2蛋白表达水平明显增高（P＜0.01），Caspase-9蛋白表达水平下降（P＜0.01）。结论Mat和LY294002联合应用可以增强对K562细胞生长抑制的协同作用，其机制可能是通过有效下调PI3K/Akt信号通路中的p-Akt表达，使p-mTOR、CyclinD1和Bcl-2蛋白表达下调，Caspase-9蛋白表达上调来实现的。