核心蛋白聚糖原核表达体系的构建

目的通过克隆核心蛋白聚糖(decorin,DCN)基因,构建原核表达体系并表达DCN蛋白。方法利用特异引物,通过反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)方法扩增编码DCN分子的外显子序列,与表达载体pET-21a(+)重组,构建原核表达体系pET-21a(+)-DCN的重组质粒。经双酶切、测序鉴定基因序列,将重组质粒转入E.coliBL21(DE3)中,用IPTG37℃诱导获得DCN融合蛋白。结果克隆了hDCN基因,成功构建了pET-21a(+)-DCN重组质粒,获得了稳定的pET-21a(+)-DCN原核表达体系,并得到了纯化的融合蛋白。结论建立了pET-21a(+)-DCN稳定的原核表达体系,表达并纯化了DCN。     

肿瘤—睾丸基因SSX1的原核表达载体的构建

目的：构建肿瘤-睾丸基因SSX1的原核表达载体,为进一步表达、纯化SSX1蛋白,制备肝癌疫苗奠定基础。方法：行RT-PCR从肝细胞癌组织中扩增CT基因SSX1,将SSX1和pMAL-C2质粒进行BamH Ⅰ和Hind Ⅲ酶切,然后连接并转化大肠杆菌DH5α,最后对重组质粒进行蓝白斑筛选,酶切和测序鉴定。结果：重组表达质粒经鉴定准确无误。结论：成功构建了肿瘤-睾丸基因SSX1的原核表达载体。     

肿瘤坏死因子α诱导蛋白6在胃癌组织中的表达及其与预后的关系

目的　探讨肿瘤坏死因子α诱导蛋白6（TNFαIP6）在胃癌中的表达及其与患者临床病理特征及预后的关系。方法　收集133例胃癌患者的临床病理资料及随访数据,通过免疫组化染色检测TNFαIP6在胃癌组织中的表达情况,分析TNFαIP6表达与胃癌临床病理特征的关系。绘制Kaplan-Meier生存曲线比较TNFαIP6高表达与低表达者的总生存率差异,采用Cox回归分析确定胃癌患者预后的影响因素。结果　133例患者中TNFαIP6高表达52例,低表达81例。低分化腺癌、Borrmann Ⅳ型、T3~T4期、M1期、淋巴结转移及血管侵犯患者TNFαIP6高表达的比例明显升高。生存分析显示,TNFαIP6高表达组5年总生存率较低表达组明显下降（56.5% vs. 82.9%,Log-rank χ2=12.404,P＜0.01)。Cox多因素分析证实,T3~T4期（HR=2.291,95%CI：1.028~5.103）、M1期（HR=3.628,95%CI：1.421~9.260）及TNFαIP6高表达（HR=2.742,95%CI：1.265~5.945）是胃癌患者预后的独立危险因素（均P＜0.05）。结论　TNFαIP6在胃癌组织中的高表达与肿瘤的侵袭性特征有关,是影响胃癌患者预后的一个独立标志物。     

人SMYD3基因原核表达载体的构建及在大肠杆菌中的表达

构建人SMYD3基因原核表达载体,并在大肠杆菌中诱导表达。通过PCR方法从重组质粒pcD-NA-SMYD3中扩增得到SMYD3基因,将其克隆入pGEX-6P-1原核表达载体。将重组质粒转化入E.coli Rosetta(DE3)中,以IPTG诱导融合蛋白表达。表达产物用SDS-PAGE及Western blotting分析鉴定。酶切鉴定和测序结果证明成功构建了重组表达载体pGEX-SMYD3。SDS-PAGE及Western blotting鉴定结果表明人SMYD3基因在大肠杆菌中获得了良好的表达。实验成功地构建了SMYD3基因原核表达载体并在大肠杆菌中获得良好表达,为进一步研究SMYD3蛋白功能奠定了基础。     

重组人突变型TNF-α在大肠杆菌中的诱导表达及高效纯化

建立重组人突变型ＴＮＦ－α的纯化工艺,获得ＴＮＦ－α纯品,为下游规模生产打基础。方法：诱导表达重组 ＴＮＦ－α突变体蛋白,用 ＤＥＡＥ－Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＦＦ、ＣＭ－Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＦＦ两步层析结合小范围线性梯度洗脱法纯化。结果：所得重组蛋白的纯度达９８％以上,比活达１．７×１０９ｕ／ｍｇ蛋白,无热原。结论：此纯化方法可对重组ＴＮＦ－α突变体蛋白进行高效快速纯化,易于实现规模化生产。     

黑色素瘤抗原-3原核重组质粒的构建及表达

目的 构建MAGE-3目的 基因原核重组表达质粒pGEX-4T-1-MAGE-3并检测其在大肠杆茵(E.coli)B121(DE3)中的表达.方法 RT-PCR法制备MAGE-3目的 基因,连接入原核表达载体pGEX-4T-1.构建MAGE-3目的 基因的原核重组表达质粒pGEX-4T-1-MAGE-3并测序,将该质粒转化E.coli BL21(DE3)菌株,经IPTG诱导,12%SDS-PAGE和Western Blot表达鉴定.结果 扩增出349bp的MAGE-3 目的 基因并构建了原核重组表达栽体pGEX-4T-1-MAGE-3;测序结果与GenBank收录序列相一致;在E.coli BL21(DE3)中检测到含该重组表达载体的转化菌表达出分子量约35kD的融合蛋白并证实其为目的 蛋白.结论 成功构建的原核重组表达栽体pGEX-4T-1-MAGE-3及其所表达的融合蛋白,为以MAGE-3为基础的肽疫苗及特异诊断试剂的研制提供抗原打下了基础,为后续实验提供了依据.     

抗人膀胱癌单克隆抗体重链可变区基因的克隆及原核表达载体的构建

目的 克隆抗人膀胱癌单克隆抗体重链可变区基因(VH),并构建其原核表达载体.方法 从能分泌抗人膀胱癌单克隆抗体的杂交瘤细胞BDI-1中提取总RNA,通过RT-PCR扩增出VH cDNA,用HindⅢ和XhoⅠ酶切纯化的RT-PCR产物和原核表达载体pET28a( ),在T4 DNA连接酶作用下室温连接.重组质粒经酶切鉴定,阳性克隆测序并进行序列分析.结果 扩增出VH cDNA片段,大小约为370bp,重组质粒的酶切鉴定结果与预期一致.VH基因序列长度为366bp,编码122个氨基酸.VH基因属于鼠免疫球蛋白重链Ⅱ亚类.结论 成功克隆出抗人膀胱癌单克隆抗体重链可变区基因,并成功构建其原核表达载体.     

AIF重组质粒的构建、表达和功能的研究

目的构建人凋亡诱导因子(AIF)基因功能片段的真核表达载体pcDNA3.1( )AIF,并初步研究AIF在细胞凋亡中的作用。方法从人细胞中提取总RNA,RTPCR扩增AIF基因片段;克隆到pMD18T载体上,通过酶切和测序进行鉴定;将AIF基因片段插入pcDNA3.1( ),构建真核表达载体;电转化淋巴母细胞Raji细胞,观察AIF的表达水平和功能。结果成熟AIF蛋白分子在真核细胞中表达,并转移到细胞核中,诱导Caspase非依赖性细胞凋亡。结论成功构建了pcDNA3.1( )AIF真核表达载体,AIF在Caspase非依赖性细胞凋亡中发挥重要作用。     

肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体基因原核表达载体的构建、表达与抗体制备

目的 获取抗肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(TRAIL)抗体。方法 利用PCR技术和基因重组技术将TRAIL基因构建于原核表达载体pPre-TMHTb中，经酶切、测序鉴定证实构建完全正确后，通过IPTG诱导其在大肠杆菌DH-5α中获得表迭，并将TRAIL蛋白免疫家兔，通过DotBlot及Western Blot检测抗TRAIL抗体的产生。结果 成功构建TRAIL基因原核表达栽体，并在大肠杆菌DH一5α中获得表达，TRAIL蛋白表达量占菌体蛋白质总量的11．8％，经Dot Blot及Western Blot检测证实获得了抗TRAIL抗体。结论 成功制备抗TRAIL抗体，从而为TRAIL在真核细胞水平的深入研究奠定了实验基础。     

SP-D基因真核表达质粒的构建及鉴定

目的构建并鉴定含肺表面活性蛋白D(SP-D)基因的重组真核表达质粒。方法提取A549细胞的总RNA为模板,用RT-PCR方法扩增含SP-D基因的cDNA,将产物克隆进真核载体pGEFP-N1内,构建含SP-D基因的重组真核表达质粒。将pGEFP-N1-SP-D重组质粒和pGEFP-N1空载体分别转染293T细胞,Western blot法检测SP-D的蛋白表达。结果双酶切鉴定及核酸序列分析证实,SP-D已成功插入真核载体pGEFP-N1内。转染pGEFP-N1-SP-D的293T细胞中检测到高表达的SP-D蛋白。结论成功构建含SP-D基因的重组真核表达质粒,并能在293T细胞中高表达。     

缺氧诱导因子1α在宫颈鳞癌组织中的表达及其意义

目的 研究缺氧诱导因子1α在宫颈鳞癌组织中的表达及其意义。方法 选取50例门诊和住院部接受治疗的宫颈病变患者为观察组, 20例因子宫肌瘤行全子宫切除且术后病理报告为正常宫颈组织的患者为对照组。两组均采用免疫组织化学染色方法[酶标聚合物(LDP)法]检测子宫颈鳞癌组织中缺氧诱导因子1α的表达水平,并比较两组缺氧诱导因子1α阳性表达评分以及不同宫颈病变组织(低度鳞状上皮内病变、高度鳞状上皮内病变、宫颈鳞癌Ⅰ期、宫颈鳞癌Ⅱ期)缺氧诱导因子1α阳性表达评分。结果 观察组缺氧诱导因子1α阳性表达评分(1.94±0.58)分高于对照组的(1.10±0.30)分,差异有统计学意义(P<0.05)。宫颈鳞癌Ⅰ期患者的缺氧诱导因子1α阳性表达评分(2.10±0.31)分明显低于宫颈鳞癌Ⅱ期患者的(2.60±0.51)分,差异有统计学意义(P<0.05);低度鳞状上皮内病变患者的缺氧诱导因子1α阳性表达评分(1.46±0.51)分明显低于高度鳞状上皮内病变患者的(1.87±0.35)分,差异有统计学意义(P<0.05)。结论 缺氧诱导因子1α的阳性表达与宫颈癌组织分期有关,其表达水平关系...     

SLPI基因真核表达质粒的构建和鉴定

目的构建并鉴定含分泌型白细胞蛋白酶抑制蛋白(SLPI)基因的重组真核表达质粒。方法以HeLa细胞的总RNA为模板,用RT-PCR方法扩增出SLPI基因cDNA,将产物克隆进真核载体pcDNA3.1(+)内,构建含SLPI基因的重组真核表达质粒。将pcDNA-SLPI重组质粒和空载体pcDNA分别转染HeLa细胞,Western blot检测SLPI蛋白表达。结果核酸序列分析及双酶切鉴定SLPI已成功插入pcDNA3.1(+)载体中,转染pcDNA-SLPI的HeLa细胞中检测到高表达的SLPI蛋白。结论成功构建了含SLPI基因的重组真核表达质粒。     

人肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体在家蚕中的表达与鉴定

目的 以家蚕为生物反应器表达人肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(TRAIL),并检测其生物学活性.方法 将人TRAIL(93～281aa)基因重组于质粒pBacPAK8构建重组转移载体pBacAK8-TRAIL.与经线性化修饰的家蚕棱型多角体病毒(BmBacPAK)DNA共转染家蚕培养细胞株BmN,获得了插入TRAIL基因的重组病毒,重组病毒感染家蚕细胞和家蚕幼虫,使其表达人TRAIL.结果 Southern杂交表明重组病毒基因组中含有人TRAIL基因片段,RNA斑点杂交表明人TRAIL基因得到了转录,重组病毒感染家蚕细胞株(BmN)、家蚕幼虫,在细胞培养上清、细胞抽提物、幼虫的体液样品中通过Westblot分析都能检测得到表达产物的特异性条带;采用L929细胞检测TRAIL的生物学活性.结论 提示人TRAIL基因分别在家蚕培养细胞和蚕幼虫中得到高效表达,此基因杆状病毒表达系统的建立为进一步研究TRAIL奠定了基础.     

TNF-α诱导的人肺动脉内皮细胞GITRL的表达及意义

目的研究糖皮质激素诱导的肿瘤坏死因子受体家族相关蛋白配体(GITRL)在TNF-α诱导的人肺动脉内皮细胞(HPAECs)中的表达及意义。方法原代培养HPAECs,分别加入TNF-α0、5、10、20ng/ml培养2、12、24、48、72h后,采用RT-PCR和Western blot分别检测GITRL mRNA和蛋白表达,ELISA法检测GITRL在细胞上清液中的表达水平。结果 TNF-α呈浓度和时间依赖性地促进GITRL mRNA及其蛋白和上清液GITRL表达水平,其中TNF-α浓度为10ng/ml、培养时间为72h时的表达量最高(P<0.05或P<0.01)。结论 GITRL在TNF-α诱导的HPAECs中表达增加,提示GITR/GITRL可能参与HPAECs的损伤机制,在肺动脉高压的发病过程中起重要作用。     

两型TNF-α及其受体在胸主动脉缩窄诱导压力负荷心肌肥厚小鼠中的表达

目的检测压力负荷所致心肌肥厚小鼠模型心肌组织中两型TNF及其受体的表达。方法使用野生型BALB／c小鼠,将其分为假手术组（n=10只）和手术组（n=8只）,通过胸主动脉缩窄术诱导压力负荷性心肌肥厚模型。术后2周处死小鼠,并对小鼠进行心脏形态学、血流动力学检测;使用WesternBlot方法对心肌组织中两型TNF-α及其受体表达进行检测。结果（1）在BALB／c小鼠中成功建立胸主动脉缩窄诱导心肌肥厚模型;（2）术后2周手术组小鼠心脏组织中可见分泌型TNF-α和跨膜型TNF-α表达量均有增加,且分泌型TNF-α表达量明显高于跨膜型TNF-α,差异有统计学意义（P〈0．05）;（3）术后2周小鼠心脏组织中TNFRl和TNFR2表达量均有增加,但TNFRl表达量高于TNFR2（P〈0．05）。结论在小鼠压力负荷诱导心肌肥厚模型中,两型TNF-α及其两种受体表达量均有增加。虽然起负性肌力作用的分泌型TNF-α及TNFRl表达起主导作用,其研究相对集中且广泛,但跨膜型TNF-α和TNFR2表达量增加提示其在这一病理过程中具有生物学作用。其作用和机制仍需进一步研究。     

不同菌型幽门螺杆菌感染消化性溃疡患者IL-10、TNF-α的表达情况观察

目的：观察不同菌型幽门螺杆菌（H．pylori）感染消化性溃疡患者白介素-10（IL-10）、肿瘤坏死因子-α（ TNF-α）的表达情况。方法选择2012年3月至2014年11月接受治疗的100例H．pylori感染消化性溃疡患者作为研究病例,分别测定患者血清中IL-10、TNF-α水平。记录患者血清中IL-10、TNF-α水平含量,并比较H．pylori感染十二指肠球部溃疡与胃溃疡血清中IL-10、TNF-α水平含量。结果 IL-10的表达水平Ⅰ型H．pylori感染检测值显著高于H．pylori阴性组,差异有统计学意义（ P ＜0?．05）;Ⅰ型H．pylori感染组检测值仅稍高于Ⅱ型H．pylori感染组,差异无统计学意义（P＞0．05）。 TNF-α的表达水平Ⅰ型H．pylori感染检测值均显著高于H．pylori阴性组及Ⅱ型H．pylori感染组,差异均有统计学意义（ P ＜0．05）。 IL-10的表达水平在Ⅰ型H．pylori感染及Ⅱ型H．pylori感染十二指肠球部溃疡均与胃溃疡基本相符,差异均无统计学意义（ P ＞0．05）;TNF-α的表达水平在Ⅰ型H．pylori感染十二指肠球部溃疡显著高于胃溃疡,差异有统计学意义（ P ＜0．05）;TNF-α的表达水平在Ⅱ型H．pylori感染十二指肠球部溃疡仅稍高于胃溃疡,差异无统计学意义（ P ＞0．05）。结论不同菌型H．pylori感染消化性溃疡患者血清中的IL-10、TNF-α水平差异较大,可以为临床上消化性溃疡的诊断提供有利价值。     

TNF-α在糖尿病心肌病变中的表达

目的:观察链脲佐菌素(STZ)糖尿病大鼠肿瘤坏死因子-α(TNF-α)在血清、心肌组织中的表达水平及心肌细胞结构改变,探讨TNF-α在糖尿病心肌病变发生、发展中的作用。方法:建立糖尿病大鼠模型(实验组),分别于6周、10周、14周,在光镜、电镜下观察心肌结构,酶联免疫吸附法(ELISA)测定血清TNF-α水平,免疫组化方法检测心肌组织TNF-α表达,并与对照组对比。结果:TNF-α在实验组较对照组表达增加(P<0.01),并随病程进展增加。光镜、电镜下可见糖尿病心肌细胞肿胀、肌丝稀疏,线粒体肿胀、破裂。结论:TNF-α在糖尿病大鼠心肌中表达增强,促进糖尿病心肌病变进展。     

肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体及其诱导肿瘤细胞凋亡机制的研究进展

肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(TRAIL)与死亡受体结合后，可启动凋亡信号的转导。它对肿瘤细胞的高效杀伤作用使其成为最具有潜力的肿瘤治疗药物，但在TRAIL的研究领域中仍然存在许多热点问题有待解决。本文综述了近年来TRAIL认几诱导肿瘤细胞凋亡的胞内机制、抗肿瘤活性及安全性问题的研究进展。     

SARS病毒E2蛋白保护性抗原片段原核表达载体的构建及表达

为构建SARS病毒E2蛋白保护性抗原片段的原核表达载体，采用人工合成法合成SARS病毒E2蛋白3’端cDNA；用常规分子克隆方法将此cDNA片段克隆入原核表达载体pBV220中，经温度诱导和SDS-PAGE电泳证明外源蛋白表达。结果表明合成的E2蛋白cDNA经序列测定，与报道的SARS病毒相应序列一致，内切酶酶切及PCR均得到456bp的cDNA片段，与实验设计一致，证明此cDNA片段已插入pBV220载体中；SDS-PAGE电泳表明有外源蛋白表达。结论：用本文介绍的方法可成功地合成并克隆SARS病毒E2蛋自原核表达载体，此项研究结果为SARS的诊断和预防奠定了基础。     

重组人TNF-α在大肠杆菌中的表达、纯化及生物学活性研究

构建有利于人肿瘤坏死因子α(TNF-α)大量表达及有效纯化的原核表达载体,并在大肠杆菌中诱导表达。通过密码子优化构建表达质粒pET28-TNF,并将其转化入大肠杆菌,对表达条件进行优化后进行大量表达并通过两轮镍柱亲和纯化获得高纯度重组人TNF-α(rhTNF-α)蛋白。应用Western blot和细胞测活分别检测重组人TNF-α蛋白的抗原性和细胞毒活性。成功构建了重组人TNF-α原核表达载体,并通过表达纯化获得了纯度>95%,具有生物活性(LD50<10 ng/mL)的rhTNF-α蛋白。