重组人TNF-α在大肠杆菌中的表达、纯化及生物学活性研究

构建有利于人肿瘤坏死因子α(TNF-α)大量表达及有效纯化的原核表达载体,并在大肠杆菌中诱导表达。通过密码子优化构建表达质粒pET28-TNF,并将其转化入大肠杆菌,对表达条件进行优化后进行大量表达并通过两轮镍柱亲和纯化获得高纯度重组人TNF-α(rhTNF-α)蛋白。应用Western blot和细胞测活分别检测重组人TNF-α蛋白的抗原性和细胞毒活性。成功构建了重组人TNF-α原核表达载体,并通过表达纯化获得了纯度>95%,具有生物活性(LD50<10 ng/mL)的rhTNF-α蛋白。     

pET28a-Streptag I-SbpA-Ag85B重组质粒的表达与鉴定

目的 应用分子克隆技术获得纳米级Ag85B蛋白并对其进行鉴定和免疫学特性检测.方法 利用S-layer/Streptag I这一具有自我组装能力的纳米模式嵌合结核杆菌分泌的Ag85B蛋白基因,将其克隆到原核表达载体pET28a（＋）中,并在大肠杆菌中表达Ag85B蛋白,表达后的蛋白经SDS-PAGE和Western blotting鉴定.结果 原核表达重组质粒pET28a-Streptag I-SbpA-Ag85B成功构建,并可在大肠杆菌中诱导表达,得到的Streptag I-Sbpa-Ag85B蛋白经SDS-PAGE和Western blotting鉴定正确,重组蛋白能被结核患者血清识别.结论 重组后的Ag85B蛋白具有较强的免疫反应性.所建立的原核表达体系为新型结核疫苗研制提供了一个新的思路.     

人纤溶酶原K5基因的结构改造及其在大肠杆菌中的表达、纯化与鉴定

目的 改造人纤溶酶原Kringle 5(K5)基因,构建RGDRGD-liteK5融合表达质粒,并表达纯化所得RGDRGD-liteK5蛋白.方法 以入纤溶酶原K5 cDNA为模板,通过PCR得到RGDRGD-liteK5基因片段,并克隆到质粒pGEXl-λT中,构建重组原核融合表达载体pGEX-RGDRGD-liteK5;在IPTG诱导下,观察融合蛋白在大肠杆菌Rosetta中的表达情况;利用亲合层析柱纯化表达产物,用Western blot分析鉴定表达产物.结果 PCR扩增得到274 bp的片段,并成功插入pGEX1-λT质粒;含重组质粒的大肠杆菌在IPTG诱导下表达了特异性的融合蛋白,其分子量为36 kD;获得的融合蛋白经凝血酶酶切后,得到了分子量约为10 kD的RGDRGD-liteK5蛋白;Western blot证实了表达产物的正确性.结论 成功地改造了人纤溶酶原K5基因,构建了重组融合表达质粒pGEX-RGDRGD-liteK5,并纯化了其表达产物.     

人SMYD3基因原核表达载体的构建及在大肠杆菌中的表达

构建人SMYD3基因原核表达载体,并在大肠杆菌中诱导表达。通过PCR方法从重组质粒pcD-NA-SMYD3中扩增得到SMYD3基因,将其克隆入pGEX-6P-1原核表达载体。将重组质粒转化入E.coli Rosetta(DE3)中,以IPTG诱导融合蛋白表达。表达产物用SDS-PAGE及Western blotting分析鉴定。酶切鉴定和测序结果证明成功构建了重组表达载体pGEX-SMYD3。SDS-PAGE及Western blotting鉴定结果表明人SMYD3基因在大肠杆菌中获得了良好的表达。实验成功地构建了SMYD3基因原核表达载体并在大肠杆菌中获得良好表达,为进一步研究SMYD3蛋白功能奠定了基础。     

pTAT-XIAP融合蛋白的原核表达及纯化

目的将X连锁凋亡抑制蛋白(XIAP)插入质粒pTAT-HA,构建pTAT-XIAP原核表达载体,以获得高产量、高纯度的pTAT-XIAP融合蛋白。方法将pTAT-XIAP融合蛋白表达载体转入大肠杆菌BL21plysS,异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导融合蛋白表达,产物经镍离子亲和层析柱(Ni-NTA)亲和层析纯化,并用Western blot方法鉴定。结果 pTAT-XIAP融合蛋白在大肠杆菌中获得表达,纯化后蛋白呈单一条带,表达产物经Western blot分析证实目的蛋白表达。结论构建重组融合表达载体,在大肠杆菌中成功表达并纯化pTAT-XIAP融合蛋白。     

HPV18E6基因的原核克隆及表达

目的:构建pET32a(+)HPV18E6原核表达质粒并优化其表达条件,探讨喉癌组织中HPV18E6蛋白的表达及意义.方法:应用基因重组技术,构建pET32a(+)与HPV18E6的原核表达重组质粒,采用PCR方法扩增HPV18E6基因,经BamHⅠ和Hind Ⅲ双酶切后插入相同酶切pET32a(+)载体,转化JM109感受态细胞并进行阳性克隆筛选,用限制性内切酶酶切和核酸序列检测方法鉴定重组质粒DNA,将其转入宿主菌E.coli BL21(DE3),用IPTG对重组质粒进行诱导表达,SDS-PAGE及Western blot方法鉴定表达蛋白的分子质量及特异性.结果:成功构建了原核表达质粒Pet32/HPV18E6, 限制性内切酶酶切和核酸序列检测证实重组质粒中插入的是目的基因,其DNA大小、方向、插入位点和阅读框架均正确;HPV18E6蛋白得到高效原核表达,表达HPV18E6的工程菌BL21(DE3)的最佳诱导温度是37 ℃,诱导剂IPTG的浓度为1 mmol/L. 结论:HPV18E6融合蛋白的表达为进一步深入研究HPV18E6蛋白的生物学特性及其致细胞转化的作用机制奠定了基础.     

大肠杆菌偏嗜性人促甲状腺激素β亚基编码DNA序列的克隆及表达

目的:构建PGEX-3X/大肠杆菌偏嗜性人促甲状腺激素(hTSH)13DNA编码序列原核表达载体,并在E.coliDH5α中进行表达,用于GD(Graves diease)的实验研究.方法:用大肠杆菌偏嗜性密码子替换已知hTSHβ亚基基因编码序列中相应的密码子,按重新设计后的编码序列进行DNA化学合成,然后克隆入表达载体pGEX-3X并进行酶切电泳、测序鉴定,进而在E.coli DH 5α中进行诱导表达.对所表达的GST融合蛋白进行SDS-PAGE、Western blotting及hTSH电化学发光免疫测定.结果:经鉴定,重组质粒pGEX-3X/hTSHβ含有与预期结果一致的435 bp编码hTSHβ链的DNA序列.表达产物为hTSHβ与GST融合蛋白.分子质量约42 ku,于SDS-PAGE中的相应部位可见深染的特异性蛋白条带,可被GST抗体识别并可被抗hTSH抗体检测.结论:实验成功建立了hTSHβ肽链的体外表达系统,为进一步制备hTSHAb及进行GD的研究奠定了基础.     

舟山眼镜蛇毒细胞毒素的克隆及原核表达

目的构建舟山眼镜蛇毒细胞毒素（Cytotoxin,CTX）原核表达载体（pET42α（＋）-CTX）,并在大肠杆菌中表达CTX重组蛋白。方法从舟山眼镜蛇毒中分离纯化细胞毒素（CTX）,测定N-末端氨基酸序列并据此设计引物,以提取的舟山眼镜蛇毒腺总RNA为模板,通过RT-PCR方法扩增细胞毒素基因序列（CTXcDNA）。将CTXcDNA定向克隆到原核表达载体pET42α（＋）中,双酶切图谱、PCR和DNA测序鉴定,转化宿主菌E.coliBL21（DE3）,异丙基硫代-β-D半乳糖苷（IPTG）诱导,SDS-PAGE凝胶电泳分析表达产物,GSTrap FF亲和层析纯化融合蛋白CTX;Western-blotting鉴定。结果成功合成CTXcDNA,并构建原核表达质粒pET42α（＋）/GST-CTX,在大肠杆菌E.coliBL21（DE3）中表达融合蛋白CTX,SDS-PAGE凝胶浓度扫描显示表达量占菌体总蛋白的28.9%,Western-blotting证实纯化蛋白为重组CTX融合蛋白（rCTX）。结论成功构建CTX基因的原核表达载体,并在大肠杆菌中表达,获得rCTX具有眼镜蛇毒CTX的抗原性。     

Daxx-C626-740原核细胞表达载体的构建与诱导表达

目的为了研制Daxx-C抗体并观察其在宫颈癌细胞中的应用效果,构建原核表达载体pET28a／DM626-740,将其在大肠杆菌中进行诱导表达,纯化表达产物,鉴定其抗原性。方法用PRIMER5．0软件设计Daxx-C基因片段（氨基酸626-740）特异性引物,引入BamHl和SalI酶切位点,PCR扩增目的基因。将PCR产物连入载体pMD18-T,构建pMD18-T／DM626-740;然后,将BamHI和Sail酶切产物连入载体pET28a,经酶切鉴定及DNA序列分析后,构建原核表达载体pET28a／DM626-740。将其转化E．coliBL21,IPTG诱导表达,利用Ni琼脂糖凝胶层析柱纯化表达产物,Western-blot检测表达物与纯产物。结果双酶切和DNA测序结果显示,PCR正确扩增了Daxx-C基因片段并成功连入载体pET28a,构建了原核表达载体pET28a／DM626-740,该质粒在E．coli中诱导表达分子量约19kDa目的蛋白,且该蛋白能被抗Daxx抗体检出。结论构建的原核表达载体pET28a／DM626-740能在E.coli中表达目的的蛋白6His-DM626-740,并具有良好的抗原性。     

铜绿假单胞菌外排泵MexA蛋白原核表达纯化

目的 构建MexA原核表达载体,并实现MexA原核表达、纯化.方法 从多重耐药的铜绿假单胞菌抽提DNA,经PCR扩增出mexA1基因与PUC18克隆载体连接,PCR、酶切及测序鉴定,再经PCR扩增出mexA基因,酶切纯化后克隆到原核表达载体PQE30,构建重组表达载体PQE30/mexA,PCR及酶切鉴定,IPTG诱导表达,SDS-PAGE、Western blot检测有无蛋白的表达.结果 已获得长约1.5kb PCR产物,酶切结果显示所构建的重组质粒已成功地克隆了mexA基因,序列分析结果与PA01mexA序列相同.SDS-PAGE检测表达产物,在相对分子量40kDa处有表达条带,诱导表达之菌体,超声破碎后,目的蛋白主要以包涵体形式存在.结论 获得mexA基因,并在E.coliM15中成功表达.融合蛋白纯化后作免疫原,为制备多克隆抗体打下基础.     

重组人促甲状腺激素α亚基在大肠杆菌中的表达

目的:构建pGEX-3X/hTSHα大肠杆菌表达系统,制备重组人促甲状腺激素α(TSHα)亚基.方法:Trizol法提取新鲜人绒毛膜组织总RNA,将1 μg总RNA逆转录合成cDNA并以之为模板进行PCR扩增hTSHα亚基的完全编码序列.EcoR1和BamHI双酶切将所扩增的hTSHα基因定向克隆入表达载体pGEX-3X,转化感受态大肠杆菌Mach1-T1,IPTG诱导表达融合蛋白GST-rhTSHα.离心收集菌体,超声碎菌后获得包涵体.以梯度浓度降低的尿素溶液洗涤,8 mol/L尿素溶液溶解包涵体.包涵体溶解液经透析后复性进行SDS-PAGE鉴定及竞争性ELISA抗原性分析.结果:DNA序列分析证实重组pGEX-3X/h TSHα质粒含有读码框正确的hTSHα基因.PAGE显示重组质粒可表达产生36 ku大小的特异蛋白条带.ELISA结果表明,所表达的融合蛋白具有与抗人TSHα抗体相结合的能力.结论:成功构建了重组pGEX-3X/hTSHα表达载体,其产物具有hTSHα抗原性.     

人源热休克蛋白HSC70与HPV16型E7融合蛋白在大肠杆菌中的表达、纯化和活性检测

目的 克隆人热休克蛋白HSC70的N端具有ATPase活性的结构域(简称为A基因)与HPV 16型E7的融合基因,在大肠杆菌中表达,并纯化获得有生物活性的AE7融合蛋白.方法 利用PCR方法扩增获得A基因片段,插入原核表达载体pET29b中,再通过PCR方法扩增HPV 16型E7基因片段,插入A基因的3′端,构建原核表达质粒pET29b-AE7,并转化大肠杆菌BL21(DE3),表达产物经离子交换层析和金属螯合层析纯化后,在一定的剂量下皮下免疫小鼠,检测对HPV-16的E7基因感染的预防及治疗作用.结果 重组质粒pET29b-AE7经DNA序列测定确认.SDS-PAGE检测,表达产物分子量为66kD,大部分为包涵体.纯化后产物经SDS-PAGE电泳分析纯度>90%.纯化产物AE7在一定的剂量下皮下免疫小鼠,对HPV-16的E7基因的感染有预防及治疗作用.结论 AE7融合蛋白的获得为进一步临床研究奠定基础.     

pET15b-pep-1-p27mt的构建、表达及意义

构建细胞穿膜肽(cell-penetrating peptides,CPPs)PEP-1和细胞周期抑制蛋白p27mt的重组体,并在大肠杆菌中表达。将已构建的表达细胞周期抑制蛋白p27mt的基因,克隆入pET15b-pep-1原核表达载体,在大肠杆菌BL21(DE3)LysS内,以IPTG诱导融合蛋白表达。表达产物用SDS-PAGE及Western blot分析鉴定。结果:成功地构建PEP-1-p27mt融合蛋白原核表达载体,并在IPTG诱导下获得特异性的表达。PEP-1-p27mt融合蛋白表达载体的构建,为体内应用细胞周期抑制蛋白诱导肿瘤细胞凋亡提供了理论基础。     

人胰岛素样生长因子1前体基因的重组、表达及纯化

目的 构建含有人胰岛素样生长因子1（hIGF-1）前体编码基因的重组载体,在E.coli BL21中表达,并探讨其抗原性和应用价值。方法 用PCR法,从现有重组质粒pBakPAK 8／hIGF-1中,扩增编码hIGF-1前体的基因片段,经双酶切、纯化、连接后得到pET29a（＋）／hIGF-1重组体,再将其转化大肠杆菌BL21-CodonPlus并诱导表达。表达产物经镍柱亲和层析纯化后,用Western blot法检测重组蛋白的抗原活性。结果 重组持粒pET29a（＋）／hIGF-1经双酶切鉴定和测序分析证实构建成功。在大肠杆菌BL21-CodonPlus中经IPTG诱导表达,有一相对分子质量15000的重组蛋白hIGF-1前体,该蛋白经镍柱亲和层析获得了良好的纯化效果,具有特异的抗原活性。结论 成功地克隆并表达相对分子质量为15000的hIGF-1前体编码基因,为进一步制备抗hIGF-1抗体和后续hIGF-1生物学功能研究打下了良好基础。     

蝎镇痛抗菌活性肽BmK AS的融合表达及蛋白切割

目的构建镇痛抗菌活性肽BmK AS原核融合表达载体,实现可溶性表达,获得重组活性肽BmK AS。方法利用本实验室已构建成功的pET 28a-AS质粒,设计引物经过聚合酶链式反应,将目的基因克隆至pET 32a载体中,构建融合表达载体pET 32a-AS,优化诱导表达条件,实现BmK AS在大肠杆菌BL21(DE 3)中的融合可溶性表达,通过金属离子螯合亲和薄层色谱法对重组蛋白进行初步分离纯化,获得重组融合蛋白后采用凝血酶进行切割去除纯化标签,经SDS-PAGE检测切割效果。结果成功构建重组表达质粒,优化得到低温诱导促进蛋白可溶性表达的方法;采用金属离子螯合亲和薄层色谱法获得重组蛋白;电泳结果表明凝血酶可以切割融合蛋白。结论实现活性肽BmK AS在大肠杆菌中的融合可溶性表达,经凝血酶切割后获得重组镇痛抗菌活性肽BmK AS,为后续药理活性研究奠定基础。     

重组TGF β1在大肠杆菌中的表达、纯化

目的通过pET 43.1原核表达载体,表达重组人转化生长因子β1(human transform growth fac-tor,rhTGFβ1)。方法将人工整合了肠激酶作用位点的TGFβ1,插入到含有NusA蛋白的融合表达载体pET 43.1中。重组质粒转化大肠杆菌(E.coli)BL21(+)并用IPTG诱导表达。通过镍柱纯化重组蛋白,用Western blot杂交检测重组蛋白的免疫原性,用肠激酶酶切得到TGFβ1单体。结果 SDS-PAGE结果显示,相对分子质量约为70 000的融合蛋白大部分在上清中表达,目的融合蛋白量约占菌体总蛋白量的80%。取超声上清,通过His亲和色谱系统纯化目的融合蛋白,纯度质量分数为95%。肠激酶切割得到TGFβ1单体,经Western blot检测重组蛋白的免疫原性。结论人转化生长因子β1在大肠杆菌中实现了高效表达,获得了具有免疫原性的重组TGFβ1。     

重组人干扰素大肠杆菌高效表达系统的建立

目的:构建重组人干扰素-α2b(rhIFN-α2b)原核表达系统,以获得rhIFN-α2b在大肠杆菌中的高效表达。方法:依据大肠杆菌遗传密码子频率表,在不改变氨基酸组成的情况下,人工半合成适于在大肠杆菌中表达的rhIFN-α2b编码序列;经PCR扩增后,克隆人表达型质粒载体pDH;筛选阳性菌落,温度诱导表达,表达产物行聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)、蛋白质印迹(WesternBlot)鉴定,并以人羊膜细胞-水泡性口炎病毒(WISH-VSV)系统鉴定rhIFN-α2b抗病毒活性。结果:PCR产物经琼脂糖凝胶电泳鉴定可见与预期大小符合的512bp的DNA条带;重组质粒pDH/IFN-α2b经序列分析,证实含有与预期相符且读码框架正确的hIFN-2b编码序列;SDS-PAGE可见与IFN-α2b分子质量大小一致的蛋白质条带,WesternBlot鉴定此条带为rhIFN-2b,其比活性达(1.8～2)×108U/mg。结论:rhIFN-α2b在大肠杆菌中的高效表达系统构建成功,且能高水平地表达出具有生物活性的rhIFN-α2b。     

心脏型脂肪酸结合蛋白(H-FABP)原核表达、纯化及多克隆抗体制备研究

目的构建H-FABP高效原核表达载体,并实现H-FABP的高效原核表达、纯化及多克隆抗体的制备。方法通过RT-PCR扩增人H-FABP的基因序列,将目的基因克隆入质粒pET28a构建原核表达重组质粒pET28a-H-FABP。将重组质粒转化入大肠杆菌BL21中,通过IPTG诱导H-FABP的表达,采用Q Sepharose F.F.阴离子层析柱等方法建立H-FABP的纯化工艺。用免疫胶体金法和Western blot鉴定纯化后重组蛋白免疫特异性,用重组表达蛋白制备兔抗H-FABP多克隆抗体。结果成功构建人H-FABP重组蛋白原核表达载体,重组蛋白以包涵体形式表达,其相对分子质量为15kD,与预期一致。亲和层析纯化产物的SDS-PAGE和Western blotting鉴定表明获得纯度>95%的目的重组蛋白。制备的抗H-FABP多克隆抗体的抗血清ELISA效价可达1∶512000。结论本研究在原核系统中成功表达了H-FABP重组蛋白,并制备多克隆抗体,为H-FABP的结构和功能研究及开发临床诊断试剂盒打下了基础。     

Chinese 1基因型弓形虫棒状体蛋白 ROP16的基因克隆表达及生物信息学分析

目的：构建弓形虫Chinese 1基因型TgCtWh3（以后均简称Wh3）株棒状体蛋白（ rhoptry protein ,ROPs）16的原核和真核重组表达质粒及其3D结构。方法参照ROP16序列分别设计引物,采用PCR从弓形虫Chinese 1基因型Wh3株基因组DNA中扩增出编码ROP16的基因片段,克隆至pMD18-T载体;经PCR及测序分析鉴定;阳性克隆的质粒分别亚克隆至原核表达载体pET-28a和真核表达载体pEGFP-C2,分别转化大肠杆菌BL21和DH5α,PCR和酶切鉴定转化菌落插入的序列;将构建的原核表达菌株经IPTG诱导,SDS-PAGE和免疫印迹分析融合蛋白的表达;将构建的真核重组质粒经脂质体转染293T细胞,观察其在细胞中表达;采用生物信息学方法分析构建了蛋白的3 D结构。结果各组均PCR扩增出约2．1 kb ROP16基因的特异片段,序列检测结果均正确;分别亚克隆到原核表达载体pET-28a和真核表达载体pEGFP-C2中,成功构建了Chinese 1基因型弓形虫棒状体蛋白ROP16的原核表达质粒和真核表达质粒;原核表达质粒在大肠杆菌中表达了ROP16的融合蛋白;真核表达质粒在293T细胞中成功表达,成功构建出ROP16基因的3D结构图。结论以pET-28a和pEGFP-C2为载体,分别成功构建并表达了ROP16的原核和真核重组质粒,并构建出其3D结构图。     

空肠弯曲菌表面蛋白特异性多表位抗原的设计、表达与鉴定

构建空肠弯曲菌表面蛋白特异性多表位抗原原核表达载体,并在大肠杆菌中诱导表达,免疫动物后检测其抗血清与空肠弯曲菌菌体的反应性。从空肠弯曲菌的6个表面蛋白中分析到特异性抗原表位,人工合成其串联基因片段,将其插入原核表达载体,获得重组质粒pET-32a(+)-CJMEA-A,经IPTG诱导后表达出25k的目标蛋白,纯化后免疫新西兰大白兔,Western blot和间接ELISA检测重组蛋白抗原性和抗血清反应性。结果表明目标蛋白具有良好的反应原和免疫原性,抗血清能与菌体发生反应。其抗体可用于C.jejuni免疫磁珠和免疫胶体金等检测方法的建立。