HER-2小分子干扰RNA对卵巢上皮性癌细胞侵袭和趋化能力的影响

目的 探讨HER-2小分子干扰RNA（siRNA）对卵巢上皮性癌（卵巢癌）细胞侵袭和趋化能力的影响。方法 选用已知的干扰磷酸甘油醛脱氢酶（GAPDH）的特异性位点作为阳性对照,采用蛋白印迹法检测卵巢癌细胞株SKOV3细胞GAPDH蛋白和HER-2蛋白的表达水平,以吸光度（A）值表示。然后在HER-2基因的编码区内根据干涉位点的筛选原则,选择HER-2siRNAⅠ、HER-2siRNAⅡ、HER-2siRNAⅢ3段靶序列,体外转录合成HER-2siRNA。实验分为4组：空白对照组、脂质体组、非特异性转染组（非特异性siRNAⅢ）、特异性转染组（HER-2siRNAⅢ）,以B肌动蛋白（B-actin）作为内参照,用荧光实时定量PCR和蛋白印迹法检测转染前后SKOV3细胞HER-2mRNA和蛋白表达的变化;细胞侵袭实验和细胞趋化实验检测转染前后SKOV3细胞体外侵袭和趋化能力的变化。结果 GAPDHsiRNA能明显抑制SKOV3细胞内源性GAPDH蛋白的表达,空白对照及加入不同剂量（0．5、1．0、1．5、2．0μg）的GAPDHsiRNA转染SKOV3细胞后,其GAPDH蛋白的表达水平分别为0．6855±0．0259、0．5698±0．0275、0．4542±0．0296、0．3341±0．0178及0．1816±0．0180,各剂量间比较,差异有统计学意义（F=198．126,P〈0．01）。HER-2siRNAⅡ、HER-2siRNAⅢ均有抑制HER-2蛋白表达的作用,HER-2siRNAⅡ、HER-2siRNAⅢ转染后SKOV3细胞中HER-2蛋白的相对表达水平（分别为0．2162±0．1589、0．1562±0．0067）,分别与空白对照组、非特异性转染组及转染HER-2siRNAⅠ的SKOV3细胞（分别为0．3674±0．0350、0．3839±0．0188、0．3532±0．0197）比较,差异均有统计学意义（F=69．461,P〈0．01）。不同剂量（0．5、1．0、1．5、2．0μg）的HER-2siRNAⅢ转染后,SKOV3细胞中HER-2mRNA的相对表达水平比较,差异有统计学意义（F=174．53,P〈0．01）;HER-2siRNAⅢ转染后第1、3、6天,SKOV3细胞中HER-2mRNA的相对表达水平分别为0．0506±0．0017、0．0266±0．0011及0．0154±0．0020,不同时间点比较,HER-2mRNA的相对表达水平呈明显下降趋势（P〈0．01）;特异性转染组SKOV3细胞的侵袭和趋化能力均明显低于非特异性转染组及空白对照组,差异均有统计学意义（F=53．707,P〈0．01;F=11．361,P〈0．01）。结论 HER-2siRNA对卵巢癌细胞HER-2基因的抑制作用呈时间及剂量依赖性,HER-2siRNA能显著抑制细胞侵袭和趋化能力,这为卵巢癌的基因治疗提供了一种新策略。     

体外模拟的二氧化碳气腹环境对卵巢上皮性癌细胞黏附及侵袭能力的影响

随着腹腔镜技术的发展，其在妇科恶性肿瘤手术中的应用逐渐开展，但其安全性，特别是CO2气腹是否可能促进肿瘤细胞的转移及播散，尚存在争议。有研究发现，CO2气腹腹腔镜手术可改变肿瘤细胞的生物学活性，引起肿瘤的穿刺点转移和腹腔内播散。但其播散机制尚未明确。本研究选取与卵巢上皮性癌（卵巢癌）黏附、侵袭关系密切的CD44 V6分子、基质金属蛋白酶9（matrix metalloproteinase-9，MMP-9）和E钙黏素（E-cadherin，E-cad），在CO2不同作用压力、作用不同时间、CO2作用后常规孵育箱内培养不同时间的条件下，检测卵巢癌细胞株SKOV3细胞中3个指标的表达情况，探讨SKOV3细胞黏附及侵袭能力的变化，对CO2气腹腹腔镜手术在卵巢癌中应用的安全性作出初步评价。     

针对Her-2基因的小分子干扰RNA对卵巢上皮性癌细胞生物学行为影响的研究

目的通过小分子干扰RNA(siRNA)对Her-2基因表达的影响,探讨其对卵巢上皮性癌(卵巢癌)细胞生物学行为的影响。方法针对Her-2基因的siRNA质粒和阴性对照质粒在脂质体介导下转染到包装病毒细胞株PT67中,嘌呤霉素筛选细胞克隆,收集其上清液并感染SKOV3细胞,经过嘌呤霉素筛选得到稳定转染的细胞株SKOV3/siRNA、SKOV3/siRNA-negative,并通过RT-PCR和免疫组化方法鉴定Her-2基因表达的抑制效果。用四甲基偶氮唑蓝法检测细胞增殖并绘制生长曲线,通过流式细胞仪检测细胞周期、细胞凋亡,并将稳定转染的细胞株接种到裸鼠皮下检测成瘤情况。结果(1)SKOV3/siRNA细胞Her-2基因的表达明显减弱。(2)SKOV3/siRNA细胞的G0/G1期细胞占68·6%,S期细胞占15·1%,SKOV3/siRNA-negative细胞的G0/G1期占55·8%,S期占23·3%。(3)SKOV3/siRNA细胞的早期凋亡率为(10·500±0·250)%,而SKOV3/siRNA-negative细胞为(0·340±0·010)%,两者比较,差异有统计学意义(P<0·01)。(4)与SKOV3/siRNA-negative细胞比较,SKOV3/siRNA细胞的生长速度减慢(P<0·05),接种于裸鼠皮下的肿瘤生长速度明显减慢(P<0·01)。结论siRNA可以有效抑制Her-2基因的表达,抑制卵巢癌细胞的生物学行为。     

RNA干扰技术沉默survivin基因对卵巢上皮性癌细胞株SKOV3生物学行为的影响

survivin基因是凋亡抑制蛋白家族（IAP）成员之一,具有肿瘤组织表达特异性,与肿瘤化疗耐药相关,已有研究证明,survivin基因在卵巢肿瘤组织高表达,与肿瘤的恶性程度及预后密切相关.RNA干扰（RNA interference,RNAi）技术具有很强的转录后基因沉默作用,已广泛用于抗肿瘤的研究中.     

RNA干扰技术逆转卵巢上皮性癌细胞多药耐药的研究

目的探讨应用RNA干扰(RNAi)技术逆转卵巢上皮性癌(卵巢癌)细胞多药耐药的可行性。方法将设计合成的针对多药耐药基因MDR1的特异性小分子干扰RNA(siRNA),用脂质体转染具有MDR1基因高表达的卵巢癌紫杉醇耐药细胞株OVCAR8/TR。用荧光定量RT-PCR技术和流式细胞仪分别测定转染前后细胞MDR1mRNA及糖蛋白P-gp表达的变化;三磷酸腺苷(ATP)生物荧光法检测转染前后细胞对顺铂、氟尿嘧啶、阿霉素和紫杉醇药物敏感性(以ATP抑制率判断)的变化情况。结果转染后24、48、72、96和120h,OVCAR8/TR细胞MDR1mRNA的抑制率分别为26·42%、84·00%、78·43%、45·85%和0;转染后48h MDR1mRNA的抑制率达到最高峰。转染后24、48、72、96和120h,OVCAR8/TR细胞P-gp的抑制率分别为16·71%、49·64%、85·23%、65·98%和9·44%;转染后72h P-gp的抑制率达到最高。转染MDR1siRNA后,能够明显提高OVCAR8/TR细胞对紫杉醇和阿霉素的敏感性,在紫杉醇的作用下,转染前后OVCAR8/TR细胞的ATP抑制率分别为(25·8±3·1)%和(78·0±9·8)%,转染前后比较,差异有统计学意义(P<0·05)。结论在OVCAR8/TR细胞中,针对MDR1合成的siRNA能够有效地抑制MDR1mRNA和P-gp的表达,并能恢复其对紫杉醇和阿霉素的敏感性。应用RNAi技术,能够逆转卵巢癌细胞对化疗药物的多药耐药。     

Edg4基因小分子干扰RNA载体的构建及其对卵巢上皮性癌细胞的沉默效应

目的构建针对Edg4基因的小分子干扰RNA（siRNA）载体,初步观察其对卵巢上皮性癌（卵巢癌）细胞的沉默效应。方法利用软件分析、设计针对人Edg4 mRNA的siRNA靶序列,合成发夹样DNA序列;退火成双链,克隆至真核表达载体pRNAT—U6．1质粒上,经PCR技术鉴定及DNA双向测序证实其序列无误后,用脂质体包裹并转染卵巢癌细胞系SKOV3细胞,用荧光显微镜初步观察其在SKOV3细胞中的转染率。采用实时荧光定量荧光定量PCR技术检测转染前后SKOV3细胞中Edg4 mRNA的表达,生化法测定转染前后SKOV3细胞上清液中溶血磷脂酸（LPA）含量的变化,流式细胞术检测转染后SKOV3细胞的凋亡率。结果经PCR技术鉴定及DNA双向测序证实重组真核表达载体的序列无误,并将此命名为pRNAT—U6．1—siEdg4。荧光显微镜下观察,转染后SKOV3细胞内有明显绿色荧光信号,转染率为64％;实时荧光定量PCR技术检测显示,转染后SKOV3细胞的Edg4 mRNA表达水平（0．05±0．01）明显低于转染前（0．29±0．04,P〈0．05）;SKOV3细胞上清液中LPA的含量,转染后明显低于转染前[分别为（3．0±1．0）、（7．5±2．2）μmol／L;P〈0．05];流式细胞仪检测显示,转染后SKOV3细胞的凋亡率明显高于转染前（分别为53．38％、0．51％;P〈0．05）。结论本研究成功构建了针对人Edg4基因的siRNA真核表达载体,并能较高效转染SKOV3细胞,转染后能明显抑制SKOV3细胞中Edg4 mRNA的表达,诱导卵巢癌细胞凋亡。     

X染色体相关凋亡抑制蛋白的小分子干扰RNA对卵巢上皮性癌细胞生长的影响

目的 探讨X染色体相关凋亡抑制蛋白(XIAP)的小分子干扰RNA对卵巢上皮性癌(卵巢癌)细胞系SKOV3细胞生长的影响.方法 设计和合成长度为64 nt的脱氧寡核苷酸链,克隆至pSUPER质粒,转化大肠埃希菌DH5α菌株,构建重组质粒pSUPER-siXIAP,对其进行双酶切和DNA序列分析鉴定.间接免疫荧光染色法鉴定SKOV3细胞XIAP蛋白的表达.实验分为4组:分别用重组质粒pSUPER-siXIAP(pSUPER-siXIAP组)及阴性无关序列重组对照质粒pSUPER-nsRNA(pSUPER-nsRNA组)及空载体质粒pSUPER(pSUPER组)转染SKOV3细胞,以未转染质粒的SKOV3细胞为空白对照组.RT-PCR技术检测各组细胞XIAP mRNA的表达,蛋白印迹法检测各组细胞XIAP蛋白的表达,流式细胞仪分析各组细胞细胞周期的变化,四甲基偶氮唑蓝(MTT)比色法观察各组细胞生长的变化.结果 本实验成功构建了XIAP特异性的RNA干扰载体pSUPER-siXIAP质粒.间接免疫荧光染色法检测证实SKOV3细胞中存在XIAP蛋白的过度表达.转染后72 h,SKOV3细胞XIAP蛋白表达水平降低,空白对照组、pSUPER组、pSUPER-nsRNA组及pSUPER-siXIAP组的相对密度值分别为3584±124、2138±65、1973±80和110±12,各组间比较,差异有统计学意义(P=0.0334);转染后72 h,SKOV3细胞XIAP mRNA表达水平明显下降,空白对照组、pSUPER组、pSUPER-nsRNA组及pSUPER-siXIAP组各组的相对密度值分别为6674±274、4532±107、2322 ±57和1864±78,各组间比较,差异有统计学意义(P=0.0127).流式细胞仪检测结果显示,pSUPER-siXIAP组G1期细胞较空白对照组、pSUPER组明显增加(P＜0.05);pSUPER-siXIAP组S期细胞较空白对照组、pSUPER组明显减少(P＜0.05).MTT比色法检测结果显示,pSUPER-siXIAP组细胞生长增殖被抑制,生长速度较空白对照组细胞明显减慢(P=0.0237);pSUPER-nsRNA组和pSUPER组细胞生长速度较空白对照组细胞也明显减慢(P=0.0441,P=0.0472).结论 本研究成功构建了XIAP RNA干扰载体pSUPER-siXIAP质粒,将其转染SKOV3细胞后可有效降低其XIAP mRNA及蛋白的表达水平,并将SKOV3细胞阻滞于G1期,造成转染细胞生长速度减慢,这有望为卵巢癌基因治疗提供一个新的有希望的分子靶点.     

缺氧诱导卵巢上皮性癌细胞形成拟态血管的前期研究

目的探讨缺氧在卵巢上皮性癌细胞系SKOV3和ES2细胞拟态血管形成过程中的作用及西罗莫司对其的抑制效应。方法建立人工基底膜基质凝胶Matrigel三维培养系统,分别在常氧(常氧组)、缺氧(缺氧组)、缺氧时加入西罗莫司(缺氧+西罗莫司组)等条件下诱导,观察SKOV3和ES2细胞形成拟态血管的能力;应用相差显微镜和扫描电镜观察拟态血管的形态及其立体结构的特点;用RT-PCR技术检测不同条件下缺氧诱导因子(HIF)1αmRNA的相对表达量。结果培养7d后,缺氧组SKOV3和ES2细胞出现变形、伸展,形成腔样、管状、分支和网络状等管道结构;而常氧组及缺氧+西罗莫司组,部分细胞出现伸展但不形成管道结构。缺氧组SKOV3和ES2细胞的HIF-1αmRNA表达量分别为0·801±0·034和0·736±0·059,显著高于缺氧+西罗莫司组(分别为0·025±0·007和0·231±0·035;P<0·01,P<0·05)和常氧组(分别为0·010±0·004和0·011±0·002;P均<0·01)。结论缺氧是卵巢上皮性癌细胞形成拟态血管的重要诱导因素,西罗莫司通过抑制HIF-1αmRNA的表达阻断拟态血管的形成。     

短发夹状RNA抑制AKT2基因表达增强卵巢上皮性癌细胞对紫杉醇敏感性的研究

RNA干扰（RNAi）技术是运用双链RNA引发的转录后水平基因沉默机制,特异性抑制靶基因转录,进而下调相应蛋白表达水平及功能.新近的RNAi技术,是利用DNA载体直接在体内表达短发夹状RNA（shRNA）,特异性封闭相应的靶基因mRNA,抑制mRNA的翻译.与早期的RNA干扰技术相比,该方法的特异性和干扰效率均有较大提高,已广泛应用于多种研究领域.利用RANi技术特异地抑制癌基因、癌相关基因或突变基因的过度表达,使这些基因保持在沉默或休眠状态,从而使肿瘤细胞增殖速度减慢,凋亡加快,显示了RNAi技术用于肿瘤基因治疗的可行性和有效性.     

卵巢癌细胞诱导T淋巴细胞凋亡的实验研究

目的　探讨卵巢癌细胞诱导T淋巴细胞凋亡及一氧化氮与细胞内游离钙离子在T淋巴细胞凋亡过程中的作用。方法　分别采用电子显微镜、流式细胞仪观察 3个卵巢癌细胞株 (OVCAR3、CAOV3和SKOV3 )的培养上清液诱导的CD+ 8T淋巴细胞的凋亡 ;逆转录 聚合酶链反应 (RT PCR)技术检测诱导型一氧化氮合成酶 (iNOS)mRNA的表达 ;Fura 2荧光负荷技术和酶联免疫 (EIA)法分别检测细胞内游离钙离子浓度 ( [Ca2 + ]i)和环鸟苷酸 (cGMP)浓度。结果　 ( 1)分别经卵巢癌细胞株OVCAR3、CAOV3和SKOV3细胞培养的上清液作用后 ,CD+ 8T淋巴细胞出现典型的凋亡改变 ,即染色质固缩和片段化 ;流式细胞仪上见凋亡峰 ;细胞凋亡率 [分别为 ( 2 3 8± 3 5) % ,( 2 3 1± 2 9) %、( 2 4 2± 4 9) % ]较对照 [( 4 6± 0 5) % ]明显增高 (P <0 0 1) ;( 2 )CD+ 8T淋巴细胞凋亡过程中iNOSmRNA的表达 (分别为 1 14± 0 0 3 ,1 0 5± 0 0 4,1 16± 0 0 2 )较对照 ( 0 60± 0 0 3 )显著增高 (P <0 0 1) ;细胞内游离 [Ca2 + ]i[分别为 ( 3 80± 3 8)、( 3 66± 13 )、( 3 56± 2 0 )nmol L]和cGMP浓度 [分别为 ( 0 65± 0 0 9)、( 0 62± 0 16)、( 0 57± 0 12 )pmol ml]均较对照 [分别为 ( 184± 11)nmol L、( 0 2 9± 0 0 4     

磷脂酰肌醇3激酶抑制剂联合顺铂对卵巢上皮性癌细胞体外抑制作用的研究

卵巢上皮性癌（卵巢癌）的死亡率居妇科恶性肿瘤的首位，但目前对其分子病因学却知之甚少。由于卵巢癌长期隐匿在腹腔内，早期诊断困难，多数患者诊断时已为晚期，除用顺铂、紫杉醇等少数化疗药物可稍延长患者存活时间外，这些晚期、复发性卵巢癌患者的生存率和预后在近40年几乎无变化，明显低于其他妇科恶性肿瘤患者。近年来研究表明，磷脂酰肌醇3激酶（phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K）在多种人类恶性肿瘤组织中表达水平异常增高，PI3K催化亚单位P110α（PDKCA）在80％原发性卵巢癌细胞内mRNA拷贝数增加约40％。在癌细胞内，P13K通过磷脂酰肌醇依赖性激酶（PDK1）、蛋白激酶B（PKB）形成P13K／PDK1／PKB信号通道，抑制细胞凋亡，刺激细胞增殖。顺铂是治疗卵巢癌的主要化疗药物，本研究观察了P13K抑制剂——LY294002及其联合顺铂对卵巢癌细胞株H08910PM和OVCAR3细胞生长的抑制作用，以期为中晚期卵巢癌的临床治疗提供理论依据。     

卵巢上皮性肿瘤EDNRB基因甲基化状态的研究

卵巢上皮性癌（卵巢癌）是一种严重威胁妇女生命的恶性肿瘤,绝大多数卵巢癌患者早期症状不明显,约有70%的患者诊断时已届晚期,病死率较高,研究卵巢癌的发病机制,阻断其发生过程中的关键环节,寻找新的治疗靶点至关重要.     

卵巢上皮性癌细胞培养上清液增强CD+4CD+25调节性T淋巴细胞增殖及免疫抑制功能的实验研究

CD4^CD25^＋调节性T淋巴细胞是一类具有抑制CD4^4和CD8^＋T淋巴细胞活化和增殖功能的免疫调节细胞。最近的研究发现，在卵巢上皮性癌（卵巢癌）患者外周血及腹腔内，这类细胞的比例显著增加，可能是卵巢癌患者免疫功能下降和生存率低下的重要原因之一。我们先前的体外实验也证实，卵巢癌细胞株SKOV3的培养上清液和健康人外周血淋巴细胞共培养后，能诱导其中的CD4^CD25^＋去调节性T淋巴细胞比例增加。为了进一步阐明其机制，我们将卵巢癌细胞培养上清液和纯化的CD4^CD25^＋调节性T淋巴细胞共同培养，观察其增殖、表型及功能是否发生改变。     

卵巢上皮性癌患者外周血CD+34单核细胞参与肿瘤血管生成的研究

目的通过体外和体内实验观察卵巢上皮性癌(卵巢癌)患者外周血中血管内皮前期细胞(即CD34^ 单核细胞)及由其参与的卵巢癌肿瘤血管生成过程,寻找参与肿瘤血管生成的方式及细胞来源。方法利用磁株分离卵巢癌患者末梢血CD34^ 单核细胞,在体外进行诱导、扩增,并通过双重免疫荧光标记共聚焦显微镜观察、荧光激活细胞分类术、RT-PCR技术等方法鉴定CD34^ 单核细胞的内皮细胞性质;用荧光素(DiI)标记后,上述细胞经裸鼠尾静脉注入到已接受卵巢癌细胞系SKOV3皮下移植瘤手术的免疫缺陷裸鼠体内,4-6周后取出肿瘤组织进行双重免疫荧光标记共聚焦显微镜观察和免疫组化检测血管生成方式。结果CD34^ 单核细胞在体外可被诱导、扩增成为内皮细胞;在体内CD34^ 单核细胞参与卵巢癌肿瘤血管生成过程,4-6周时形成毛细血管和小血管。结论CD34^ 单核细胞参与卵巢癌肿瘤血管的生成过程,肿瘤血管生成的方式包括由原存血管来源的血管新生和由CD34^ 单核细胞来源的血管形成两种形式。     

雷公藤内酯醇诱导上皮性卵巢癌Caov-3凋亡的实验研究

目的 :观察雷公藤内酯醇对上皮性卵巢癌体外生长特性的影响 ,并进一步探讨有关的信号转导机制。方法 :分别采用MTT法、流式细胞仪测定和克隆形成实验观察雷公藤内酯醇对上皮性卵巢癌Caov 3增殖、凋亡和侵袭能力的影响 ,以Westernblot方法检测相关的信号分子。结果 :雷公藤内酯醇显著地抑制了Caov 3的增殖和克隆形成能力 (P <0 .0 5 ) ,诱导其凋亡 ,caspase途径和ERK活化主要参与了诱导凋亡的过程。结论 :雷公藤内酯醇对上皮性卵巢癌Caov 3生长特性的影响 ,使其有望成为一种新的化疗药物应用于卵巢癌的治疗。     

miR-204靶向BDNF调控上皮性卵巢癌细胞抗失巢凋亡的实验研究

目的:探讨miR-204靶向BDNF对OV2008卵巢癌细胞抗失巢凋亡的影响及其可能机制。方法:选用OV2008细胞株,分为贴壁培养组和失巢凋亡组;qRT-PCR法检测miR-204表达水平;选择失巢凋亡组存活细胞,分为空白对照组、转染试剂组、miR-204 NC组、miR-204质粒组进行转染,qRT-PCR检测miR-204表达。应用四组细胞分别建立失巢凋亡模型,流式细胞术检测细胞凋亡率,Transwell实验检测细胞侵袭能力,qRT-PCR检测BDNF mRNA表达水平,Western blot法检测p-Akt和总Akt蛋白表达水平。结果:失巢凋亡组较贴壁培养组的miR-204含量降低(P0.05)。与空白对照组、转染试剂组、miR-204 NC组比较,miR-204质粒组的miR-204表达水平高(P0.05),细胞凋亡率增加(P0.05),侵袭能力减弱(P0.05),BDNF mRNA表达水平降低(P0.05),p-Akt/总Akt值降低(P0.05);前3组比较差异均无统计学意义(P0.05)。结论:miR-204在抗失巢凋亡表型的OV2008细胞株中低表达,过表达miR-204能抑制OV2008细胞的抗失巢凋亡能力,其机制可能与下调BDNF基因表达进而抑制Akt磷酸化有关。     

RNA干扰技术抑制Her2基因表达对卵巢上皮性癌细胞生物学特性的影响

目的 应用RNA干扰技术,观察稳定转染Her2基因的短发夹状RNA(shRNA)对不同恶性程度的卵巢上皮性癌(卵巢癌)SKOV3和SKOV3.ipl细胞Her2基因表达及细胞生物学特性的影响.方法 将表达Her2的质粒pHer2 shRNA分别转染SKOV3和SKOV3.ipl细胞,经抗性筛选获得稳定转染的细胞系.RT-PCR技术、蛋白印迹法检测转染前后细胞Her2 mRNA和蛋白的表达,体外侵袭实验观察转染前后细胞侵袭能力的改变,裸鼠接种肿瘤细胞观察转染前后细胞成瘤能力的改变.结果 转染前后SKOV3.ipl、SKOV3细胞的Her2 mRNA表达量分别为(99.9±1.3)%和(42.4±2.5)%、(68.0±3.1)%和(40.8±2.0)%.Her2蛋白的表达量分别为(98.2±1.7)%和(40.7±2.1)%、(72.1±3.4)%和(36.4±1.5)%,稳定转染后,两种细胞的Her2基因表达均明显下降,分别比较,差异均有统计学意义(P<0.05).稳定转染pHer2 shRNA后,SKOV3.ipl细胞的穿膜细胞数由(36.2±9.7)个下降为(15.7±7.2)个,SKOV3的穿膜细胞数由(7.6±1.1)个下降为(1.8±0.8)个,细胞侵袭能力均显著下降,分别比较,差异均有统计学意义(P<0.05).稳定转染pHer2 shRNA后,SKOV3.ip1和SKOV3细胞的成瘤重量分别由(1.55±0.31)g下降为(0.69±0.20)g、(1.14±0.10)g下降为(0.38±0.03)g,两种细胞的成瘤能力均显著下降,分别比较,差异均有统计学意义(P<0.05).结论 (1)针对Her2基因的RNA干扰技术可以显著降低卵巢癌细胞Her2基因的表达水平.(2)经RNA干扰作用降低Her2基因表达后,卵巢癌细胞的生物学特性改变,恶性度降低.     

稳定转染HMGA1基因的小分子干扰RNA对卵巢上皮性癌细胞生物学特性的影响

目的 观察稳定转染HMGA1基因的小分子干扰RNA(siRNA)对卵巢上皮性癌(卵巢癌)细胞生物学特性的影响.方法 实验分为3组,反义序列载体(卵巢癌细胞系OVCAR细胞转染载有HMGA1基因siRNA序列的pSilence4.1-CMV-Hs质粒)、无关序列载体(OVCAR细胞转染载有HGMA1基因无关序列的pSilence4.1-CMV-Hn质粒)和空白对照组(OVCAR细胞仅转染脂质体),3组均经抗性筛选获得稳定转染的细胞系.采用RT-PCR技术、蛋白印迹法检测3组细胞中HMGA1mRNA和蛋白的表达;四甲基偶氮唑蓝比色法观察细胞增殖情况,绘制细胞生长曲线;体外侵袭实验观察3组细胞转染前后侵袭能力的变化;裸鼠接种3组细胞后观察其成瘤能力的变化.结果 (1)反义序列载体组转染前、后OVCAR细胞中HMGA1 mRNA表达水平分别为(86.3±2.7)%和(35.8±3.1)%,HMGA1蛋白表达水平分别为(68.6±2.8)%和(22.3±4.2)%,分别比较,差异均有统计学意义(P<0.05);无关序列载体组和空白对照组转染前、后HMGA1 mRNA和蛋白表达水平分别比较,差异均无统计学意义(P>0.05).(2)反义序列载体组OVCAR细胞增殖速度明显慢于无关序列载体组和空白对照组(P<0.05).(3)转染前、后的穿膜细胞数,反义序列载体组分别为(53±6)和(21±6)个,两者比较,差异有统计学意义(P<0.05);无关序列载体组和空白对照组转染前、后的穿膜细胞数分别比较,差异均无统计学意义(P>0.05).(4)接种转染后的OVCAR细胞后,反义序列载体组裸鼠的成瘤时间为(6.0±0.9)d,明显短于无关序列载体组的(12.3±3.9)d和空白对照组的(13.0±2.3)d(P<0.05).接种5周后,反义序列载体组裸鼠的肿瘤重量和体积分别为(0.8±0.3)g和(205±34)mm~3,分别与无关序列载体组[分别为(2.1±0.4)g和(987±82)mm~3]和空白对照组[分别为(2.3±0.3)g和(956±79)mm~3]比较,差异均有统计学意义(P<0.05).结论 HMGA1 siRNA可显著降低卵巢癌细胞中HMGA1基因的表达,并对卵巢癌细胞的生长有抑制作用.     

RNA干扰技术抑制卵巢癌细胞系SKOV3.ip1细胞内Her-2/neu基因表达的研究

目的 探讨卵巢癌细胞株SKOV3．ip1细胞转染表达短发卡状RNA（shRNA）的质粒后，SKOV3．ip1细胞中Her-2／neu基因表达的变化，和对SKOV3．ip1细胞凋亡的影响。方法 将针对Her-2／neu基因的shRNA表达载体转染SKOV3．ip1细胞，从mRNA水平、蛋白表达水平和细胞凋亡的变化三个方面评价shRNA表达载体对Her-2／neu基因表达的抑制作用。结果shRNA表达载体可以有效的抑制SKOV3．ip1细胞Her-2／neu基因的表达，使Her-2／neu基因的mRNA和蛋白表达量明显下降，细胞凋亡增多。结论靶向Her-2／neu的shRNA表达载体可以有效抑制Her-2／neu基因的表达。     

miR-101诱导上皮性卵巢癌细胞SKOV3凋亡及其与细胞内Ca~(2+)水平关系的研究

目的:研究microRNA-101(miR-101)对上皮性卵巢癌细胞SKOV3诱导凋亡的作用,并探讨凋亡发生与细胞内Ca~(2+)浓度的关系。方法:采用阳离子脂质体为载体将miR-101 mimics转染SKOV3细胞,随机分为空白对照组、miR-101 NC组和miR-101转染组;实时定量RT-PCR法检测细胞中miR-101表达量;流式细胞术检测细胞凋亡及细胞内Ca~(2+)浓度;Western blot法检测凋亡相关蛋白caspase-3表达。结果:实时定量RT-PCR检测结果显示,miR-101转染组的miR-101表达(5.302±0.069)较空白对照组(1.038±0.036)和miR-101 NC组(1.126±0.062)分别上调了5.10倍和4.70倍(F=5326.276,P=0.000)。流式细胞术检测结果显示,miR-101转染组的细胞凋亡率、细胞内Ca~(2+)浓度分别为(66.36±13.54)%和(228.94±19.51)nmol/L,较空白对照组[(40.60±5.97)%,(62.91±7.73)nmol/L]和miR-101 NC组[(41.54±3.89)%,(59.09±10.66)nmol/L]明显增加,差异有统计学意义(P=0.019);Western blot结果显示,miR-101转染组的细胞凋亡相关蛋白caspase-3表达(1.325±0.052)较空白对照组(0.817±0.073)和miR-101 NC组(0.820±0.062)增加,差异有统计学意义(P=0.000)。结论:miR-101过表达具有诱导上皮性卵巢癌细胞SKOV3凋亡的作用,其诱导凋亡与细胞内Ca~(2+)浓度增加有关。