骨质疏松大鼠骨髓基质细胞膜片的体外构建研究

目的探讨骨质疏松大鼠骨髓基质细胞膜片的构建及基本生物学特性。方法建立大鼠绝经后骨质疏松症(PMOP)模型,分离培养骨质疏松大鼠骨髓基质细胞(O-r BMSCs),并以O-rBMSCs为种子细胞构建细胞膜片。通过倒置显微镜、HE染色、扫描电镜及透射电镜对细胞膜片进行形态学检测;以免疫组织化学染色检测细胞外基质相关蛋白的表达情况。结果成功建立了大鼠PMOP模型,体外分离培养的O-rBMSCs具有多向分化潜能。显微镜下可见细胞复层生长,采用富含维生素C的培养基连续培养10 d左右即可获得白色膜样结构,该细胞膜片具有较好的弹性,HE染色及扫描电镜观察发现O-rBMSCs膜片由多层细胞及丰富的细胞外基质组成。透射电镜下可观察到细胞间连接。免疫组织化学染色示O-rBMSCs膜片高表达Ⅰ型胶原、纤维连接蛋白。结论 O-rBMSCs体外采用富含维生素C的培养基连续培养可构建细胞膜片,该细胞膜片富含细胞外基质,有望应用于骨质疏松机体的组织再生。     

基于细胞膜片技术构建三维真皮样组织的体外研究

目的探讨应用细胞膜片技术构建三维真皮样组织的新策略。方法取2~3周龄新西兰大白兔骨髓,采用全骨髓贴壁法分离培养兔BMSCs(rabbit BMSCs,rBMSCs)并传代,取人皮肤成纤维细胞(human dermal fibroblasts,HDFs)传代培养。取第2代rBMSCs、第3代HDFs分别于培养皿采用膜片条件培养基连续培养2周,获得单层细胞膜片。取人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells,HUVECs)接种于rBMSCs膜片上,构建预血管化膜片。培养期间于倒置相差显微镜下观察膜片上细胞形态变化;共培养1、3、7、14 d后取材行HE染色、CD31免疫荧光染色,观察细胞分布及微血管网络生成情况,以rBMSCs膜片作为对照。分别将培养7 d的预血管化膜片(实验组)及rBMSCs膜片(对照组)放于2层HDFs膜片中间,制备三维真皮样组织,培养24 h后行CD31免疫荧光染色及Ⅰ、Ⅲ型胶原免疫组织化学染色,评估细胞分布及胶原表达情况。结果细胞连续培养2周后成功制备HDFs膜片及rBMSCs膜片。HUVECs接种于rBMSCs膜片3 d后重新排列,7 d后形成网状结构,14 d后网状结构更明显;HE染色见膜片间有空泡形成,且随时间延长空泡日趋明显、膜片厚度显著增加;CD31免疫荧光染色可见微血管管腔形成。而rBMSCs膜片仅见细胞膜片增厚,未见细胞形态改变、空泡结构形成。三维真皮样组织观测显示,实验组内皮细胞CD31免疫荧光染色呈阳性,rBMSCs、HDFs及HUVECs细胞排列整齐;而对照组染色呈阴性,细胞随机排列。实验组和对照组Ⅰ、Ⅲ型胶原均呈阳性表达,与对照组比较,实验组细胞排列紧密,细胞基质分布规律,呈"蜂巢状"结构;两组Ⅰ、Ⅲ型胶原表达量差异无统计学意义(P>0.05)。结论应用细胞膜片技术可以构建三维真皮样组织,其中采用HUVECs联合rBMSCs膜片构建预血管化膜片后细胞基质分布较规律,具有形成组织工程真皮的潜力。     

不同发育阶段人皮肤β1整和素及细胞角蛋白K19表达特征及其与创面修复结局关系的研究

严重烧创伤等所致皮肤损伤后的愈合能力随着人年龄的增大而逐渐降低,其原因涉及多方面,其中表皮细胞增殖分化潜能的改变可能是其重要原因之一.由于皮肤中β1整和素及细胞角蛋白K19仅在具有增殖与分化潜能的表皮干细胞和短暂扩充细胞上表达,本研究利用β1整和素和细胞角蛋白K19单抗,观察人胚胎期、幼儿期、成人期皮肤中表皮干细胞和短暂扩充细胞分布、数量的差异,并探讨这种差异特征与创面表皮再生能力随年龄降低的关系.分别取23～24周龄胎儿、4～10周岁幼儿、35～51岁三组全层皮肤.取材后即刻10％甲醛固定,常规石蜡包埋,切片5μm待用.采用免疫组织化学SP法,β1整和素和细胞角蛋白K19单抗分别购自Neo Markers和Maxim Biotech公司.β1整合素细胞膜染成棕黄色为阳性细胞,角蛋白细胞浆染成棕黄色为阳性细胞,同时设不加一抗的阴性对照.结果显示在胎儿期皮肤表皮基底层细胞β1整和素及角蛋白K19染色均为阳性,毛囊隆突部细胞β1整和素及角蛋白K19表达也均为阳性.幼儿期表皮基底层细胞中有部分细胞表达β1整和素及角蛋白K19,阳性细胞并非散在均匀分布,而是数个阳性细胞相对集中呈片状分布,β1整和素与角蛋白K19的表达规律相似.成年人表皮基底层中表达β1整和素及角蛋白K19的细胞也呈片状分布,阳性细胞率较幼儿组低,且染色强度较弱.本实验结果提示,胎儿期表皮基底层均为表皮干细胞和短暂扩充细胞,毛囊隆突部也含有大量的表皮干细胞和短暂扩充细胞,而幼儿期表皮基底层中仅有部分细胞为干细胞和短暂扩充细胞,成人期干细胞及短暂扩充细胞所占的比例则进一步降低.这可能与胎儿期皮肤的损伤在结构上能够完全修复,包括皮肤附件如毛囊、汗腺等也能完全再生,以及临床中幼儿皮肤损伤后再上皮化能力较成人强的现象有关.     

毛囊干细胞结合电纺纳米丝素纤维构建组织工程尿道膜片的体外研究

目的：探索毛囊干细胞结合电纺纳米丝素纤维,构建组织工程尿道膜片的可行性。方法使用酶消化法分离兔毛囊细胞,利用流式细胞仪分选毛囊干细胞,体外原代培养扩增,计算细胞的最大扩增倍数及克隆形成率;使用流式细胞仪检测细胞K19、p63、CD29的阳性表达率。将毛囊干细胞接种在电纺纳米丝素纤维支架上,构建组织工程尿道。应用组织学、荧光染色法观察组织工程尿道的体外构建情况。结果兔毛囊干细胞与兔毛囊细胞的最大扩增倍数分别为（5.92±0.77）×10^4倍和（6.61±3.62）×10^3倍;兔毛囊干细胞与兔毛囊细胞的克隆形成率分别为（9.07±1.18）%和（3.95±1.01）%。K19、p63、CD29在毛囊干细胞中表达率分别为（89.36±6.69）%、（92.10±5.49）%和（89.98±6.89）%;在兔毛囊细胞中分别为（39.38±2.20）%、（40.78±2.61）%和（40.57±2.79）%;毛囊干细胞在支架上能形成复层上皮样结构,AE1/AE3染色阳性。结论兔毛囊干细胞结合电纺纳米丝素纤维,能成功构建组织工程尿道,可用于体内修复的进一步研究。     

胎鼠表皮干细胞的分离培养及毛囊再生研究

目的：分离培养胎鼠的表皮干细胞及毛囊乳头层细胞，通过动物模型观察两者复合移植后，上皮形成及毛囊的再生情况。方法：采用IV型胶原分离培养胎鼠表皮干细胞，检测β1整合素及角蛋白15的表达水平，测定其细胞周期及克隆形成率（以角质细胞为对照）；分离培养毛囊乳头层细胞，并接种在纤维蛋白胶中，与表皮干细胞膜片复合形成全层皮肤等同物，移植在裸鼠全层皮肤缺损创面作为实验组，同时将胎鼠成纤维细胞替代乳头层细胞作为对照组，8－10周后观察创面及囊的组织学变化。结果：胎鼠表皮干细胞表达高水平的β1整合素及角蛋白15；细胞周期分析显示，G1期细胞百分率为94．9％，S期为3．5％，提示为慢循环细胞周期；角质细胞的G1期细胞有百分率为74．1％，S期为17．5％；表皮干细胞的克隆形成率为15．3％，明显高于对照组的6．7％；裸鼠创面愈合后8－10周，实验组可见新生毛囊形成，对照组未见到此现象。结论：能初步实现对胎鼠表皮干细胞的体外分离培养；在毛囊乳头层细胞的诱导下，胎鼠表皮干细胞可参与形成新的毛囊结构。     

人胎儿毛囊隆突细胞的培养方法及其向皮脂腺细胞诱导分化的初步研究

目的探讨简单快捷地获得大量人毛囊隆突细胞并保持其干细胞特性的方法,观察其向皮脂腺细胞分化的可行性。方法用传统的器械分离法(简称传统法)和改进的消化分离法(简称改良法)对人胎儿毛囊隆突细胞进行分离培养,比较两种方法的细胞获得效率和细胞生长特性。在对毛囊隆突细胞进行诱导培养后,行抗上皮膜抗原(EMA)抗体免疫组织化学染色,以检测细胞EMA的表达情况。噻唑蓝(MTT)法检测细胞克隆形成率。用亲和素-生物索复合物(ABC)标记法行毛囊隆突细胞角蛋白19(K19)染色。结果传统法每小时可获得8～10个毛囊隆突,贴壁48h后有细胞长出,贴壁率为40%～50%,培养14d左右传代；改良法每小时可获得毛囊隆突100个左右,接种后12h即可贴壁并有细胞长出,贴壁率30%,细胞生长迅速,7d左右即可传代。毛囊隆突细胞诱导培养7d后,细胞体积变大,随着时间延长,细胞进一步变大,细胞质中有脂滴样颗粒围绕在核的周围,细胞形状不规则。诱导培养14d后,抗EMA抗体免疫组织化学染色呈阳性表达。改良法的细胞克隆形成率为(18．2±2．1)%,明显高于传统法[(12．7±3．4)%,P＜0．05]。毛囊隆突细胞K19免疫组织化学染色呈阳性,其细胞分布满视野,细胞质内含有大量棕色颗粒。结论改良法可以获得大量毛囊隆突细胞并保持其干细胞特性,在体外诱导条件下,具有向皮脂腺细胞分化的潜能。     

角蛋白在头皮中的分布及其在干细胞研究中的意义

目的：研究不同类型角蛋白（Cytokeratin，CK）在头皮及毛囊结构中表达分布情况。方法：将头皮病理切片和游离培养的毛囊使用不同类型角蛋白抗体进行免疫组化染色，检测角蛋白的分布情况。结果：CK15主要分布在毛囊隆突部，部分毛囊外根鞘最外层也有一定的表达；CK19主要分布在汗腺、毛囊外根鞘最外层和皮肤的基底层；CK16在表皮层和毛囊外根鞘均有阳性表达；CK10主要分布在头皮表皮的基底上层和皮脂腺腺泡的最外层。结论：不同类型角蛋白在头皮和毛囊结构中具有明显差异性，CK19和CK15阳性表达细胞可能具有干细胞特性。     

人表皮干细胞改良培养及其组织工程皮肤的构建

目的：改良传统人表皮干细胞（hESCs）分离、培养方法,为组织工程皮肤构建提供产率更高、活力更好的种子细胞。方法：应用改良的酶消化法（改良法）及传统酶消化法（传统法）分离、培养hESCs,倒置显微镜观察细胞形态,MTT法绘制生长曲线、免疫组化法测定hESCs标志物角蛋白19（K19）和β1整合素的表达,并且进一步比较上述两种方法所获种子细胞构建的组织工程皮肤的形态学的特性。结果：台盼蓝染色显示改良法细胞消化分离数为92.25±15.61个,传统法细胞消化分离数为68.50±26.91个（P〈0.01）;改良法活细胞比率是（94±0.01）%,传统法活细胞比率是（75±0.04）%（P〈0.05）。在8天时改良法细胞MTT法OD值为1.300,传统法为0.779,改良法较传统法活力好,增殖快;细胞免疫组织化学染色显示表皮干细胞标志物角蛋白19（K19）和β1整合素均为阳性染色;HE染色结果显示采用改良法hESCs构建的组织工程皮肤表皮细胞复层层数为5～6层、基底细胞排列整齐,传统法hESCs构建的组织工程皮肤表皮细胞复层层数为3～4层、基底细胞排列散乱。结论：利用改良的酶消化法可获得数量更多、活力更好的人表皮干细胞,为以hESCs为种子细胞构建组织工程皮肤奠定基础。     

显微分离培养与免疫磁珠法分离纯化人毛囊干细胞

目的 探讨从人毛囊隆突区细胞(bulge cells,BCs)获取高纯度有活性的人毛囊干细胞(hair folliclestem cells,HFscs)的方法及条件. 方法 取自愿捐献的成人头皮标本,显微分离培养获得BCs,应用免疫磁珠纯化BCs中CD200阳性的HFSCs.苔盼蓝染色比较纯化前后细胞活性;流式细胞仪检测细胞纯化效率;免疫荧光检测纯化前后细胞CD200的表达情况. 结果 显微分离培养获得的人毛囊BCs,培养6 d后细胞生长融合,呈铺路石样.所得细胞角蛋白19组织化学染色阳性.CD200免疫磁珠分选法纯化细胞后,苔盼蓝染色显示纯化前细胞活力为95.0%±0.6%,纯化后为94.2%±1.0%,差异无统计学意义(P＞0.05).流式细胞仪及免疫荧光检测显示纯化前CD200阳性细胞的纯度为8.31%,纯化后CD200阳性细胞纯度为82.31%,纯化后CD200阳性细胞回收率为65.39%. 结论 联用显微分离培养与免疫磁珠法,可获得高纯度HFSCs,且细胞活性不受影响.     

应用胶原凝胶构建组织工程化皮肤的研究

目的探讨以胶原凝胶为支架材料构建组织工程化皮肤的可行性。方法体外分离、培养人皮肤表皮细胞和成纤维细胞；利用自制的胶原蛋白制成胶原凝胶作为组织工程支架材料；在成功构建人工真皮的基础上种植表皮细胞，构建复合人工皮肤；采用HE染色与免疫组织化学的方法对复合人工皮肤进行组织学检测。结果HE染色可见，构建的复合人工皮肤具有表皮和真皮双层结构；免疫组织化学染色显示，Ⅳ型胶原、纤维连接蛋白和层粘连蛋白阳性，在形态结构上与正常皮肤相似。结论培养的人表皮细胞和成纤维细胞种植于胶原凝胶支架上，气一液界面培养可构建出具有类似正常皮肤结构的组织工程化皮肤。     

毛囊干细胞表皮膜片修复裸鼠皮肤缺损的实验研究

目的开发新的组织工程表皮替代物,利用毛囊干细胞-壳聚糖明胶膜片(Chitosan-gelatin membrane,CGM)进行修复裸鼠皮肤缺损的实验研究。方法将体外扩增培养的毛囊干细胞接种于CGM,构建组织工程表皮膜片,裸鼠背部作直径1cm的全层皮肤缺损,将毛囊干细胞-CGM复合物覆盖创面。回植后1周、4周和12周分别进行组织学和免疫组织化学检测。结果毛囊干细胞在CGM上生长良好。毛囊干细胞-CGM修复裸鼠后1周切片示创面有新生上皮覆盖,表皮分化良好,而对照组残留较大未愈创面。修复后4周和12周可见对照组收缩较实验组显著。结论体外构建的毛囊干细胞-CGM可以修复裸鼠皮肤缺损。     

毛囊单位促进组织工程皮肤形成的体外实验研究

目的 通过插入分离的毛囊单位,构建带有皮肤附属器的组织工程皮肤,探讨毛囊对组织工程皮肤形成的作用.方法 将头皮分离成毛囊单位,插入由Ⅰ型鼠尾胶原、成纤维细胞和角质形成细胞构建的组织工程皮肤模型中,浸没培养1周,气-液界面培养3周.通过镜下观察、HE染色和免疫组化检测组织工程皮肤和毛囊的生长状态.结果 相对于悬浮培养的毛囊,实验组毛囊体外生长期延长,结构更完整.HE染色显示,实验组组织工程皮肤可见毛囊和皮脂腺存在.免疫组化染色显示,带有毛囊的组织工程皮肤中可见反映基底膜完整性的Laminin和Ⅳ型胶原呈线状连续分布于表皮、真皮连接处;而反应表皮成熟度的CK4和CK10/13则呈阳性分布于基底上层非角化细胞.结论 复合毛囊单位可以促进组织工程皮肤表皮组织的分化和成熟.本方法为组织工程皮肤的构建和毛囊的体外培养提供了新的思路和方法.     

人毛囊外根鞘细胞的分离及培养

目的 建立毛囊外根鞘细胞的分离和培养方法.方法 利用中性蛋白酶分离得到单个毛囊,采用组织块法和消化法进行细胞培养,倒置显微镜、扫描及透射电镜观察细胞形态,培养各代细胞做生长曲线,RT-PCR检测干细胞相对特异性标识分子K15和细胞分化标识分子外皮蛋白的mRNA表达情况.结果 组织块法和消化法均能培养出毛囊外根鞘细胞,并可传代培养,组织块法细胞生长慢,不易汇合,消化法细胞增殖快.各代细胞中K15和外皮蛋白mRNA均有表达.结论 消化法适合毛囊外根鞘细胞的体外培养,该方法的建立为进一步分离纯化培养毛囊干细胞奠定了基础.     

Hair follicle stem cells can be driven into a urothelial‐like phenotype: An experimental study

The aim of this study was to show that conditioned medium might induce transdifferentiation of hair follicle stem cells into urothelial‐like cells. Several conditioned media and culture conditions (skeletal muscle cell conditioned medium, smooth muscle cell conditioned medium, fibroblast conditioned medium, transforming growth factor‐conditioned medium, urothelial cell conditioned medium, and co‐culture of hair follicle stem cells and urothelial cells) were used. The hair follicle stem cells phenotype from rat whisker hair follicles was checked by using flow cytometry and immunofluorescence. Cytokeratins 7, 8, 15 and 18 were used as markers. Urothelial cell conditioned medium increased the expression of urothelial markers (cytokeratin 7, cytokeratin 8, cytokeratin 18), whereas it decreased a hair follicle stem cells marker (cytokeratin 15) after 2 weeks of culture. This process depended on the time of cultivation. This medium was able to sustain the epithelial phenotype of the culture. Other media including a co‐culture system failed to induce similar changes. Smooth muscle conditioned medium resulted in a loss of cells in culture. Hair follicle stem cells are capable of differentiating into urothelial‐like cells in vitro when exposed to a bladder‐specific microenvironment.     

游离毛囊体外培养模型构建及形态学检查的实验研究

目的：构建游离毛囊体外培养模型，观察离体培养人头皮毛囊形态变化。方法：在Williams E无血清培养基中，建立离体人头皮毛囊培养模型；通过倒置显微镜观察毛囊的形态变化；目镜测微器测量毛囊长度；3H-TdR掺入检测毛囊DNA合成率；组织学检测用冰冻切片光镜观察和电镜切片透射电镜观察。结果：毛囊有不同程度的生长，随时间后移形态结构由清晰逐渐变为模糊；冰冻切片HE染色后在光学显微镜下可清楚分辨出毛囊的结构；培养3天毛囊的内外根鞘中可见凋亡细胞，内皮根鞘较外皮根鞘明显多见。结论：在离体培养人头皮毛囊时，Williams E无血清培养基是合适的选择，该模型也是筛选促进或抑制毛发生长药物的良好模型；离体培养毛囊组织学检测用冰冻切片可以简化步骤；透射电镜可以用来观察离体培养的毛囊的形态和超微结构的变化，也可以用来协助观察细胞凋亡的状况。目镜测微器测量毛囊长度简单可行，辅以3H—TdR掺入则更为客观。     

胎儿头皮毛囊内黑素细胞HMB-45和NKI/beteb的表达

目的：观察黑素细胞在胎儿头皮内的定位。方法：获取胎儿头皮（胎龄7月,畸形引产,死亡2h）,制备冰冻切片,分别用HMB-45和NKI/beteb抗体进行免疫荧光染色和免疫组化染色,激光共聚焦显微镜和倒置显微镜观察摄片。结果：NKI/beteb阳性细胞主要位于胎儿头皮的毛囊外根鞘隆突区,也见于毛球处、表皮基底部。HMB-45阳性细胞主要存在于毛球部、毛母质和表皮基底部,外根鞘区表达则阴性。结论：胎儿头皮毛囊内存在不同状态的黑素细胞,位于毛囊外根鞘隆突区的黑素细胞是黑素母细胞。     

毛囊干细胞体外诱导分化为血管内皮细胞的实验研究

目的探讨体外诱导人毛囊干细胞成血管内皮细胞的可行性。方法采用中性蛋白酶(Dispase)分离人毛囊干细胞,用含10 ng/mL VEGF、2 ng/mL bFGF及10%血清的EGM-2诱导液对其诱导,以无诱导因子的基础培养液为对照组,对每代细胞形态进行观察。诱导4代后,检测vWF(von Willebrand factor)与CD31的表达。结果在诱导液的作用下,细胞形态逐步向内皮细胞的铺路石样形态转变,对照组细胞形态改变不明显。至第4代,实验组已明显表达vWF与CD31,对照组表达不明显;流式细胞仪检测显示,实验组阳性表达率近80%,对照组则低于5%;RT-PCR显示,实验组表达vWF,对照组未见明显表达。结论使用含10 ng/mL VEGF、2 ng/mL bFGF及10%血清的EGM-2诱导液,可在体外诱导人毛囊干细胞分化成血管内皮细胞。