个旧矿粉诱导的支气管上皮转化细胞cDNA消减文库的构建

目的 构建永生化人支气管上皮细胞BEAS-2B与其受个旧矿粉体外诱导的恶性转化细胞之间差异表达的cDNA消减文库.方法 以BEAS-2B为对照组,以采自个旧井下作业面的矿粉为染毒物在体外成功诱导的恶性转化细胞为实验组.分别提取总RNA;应用SMART cDNA合成技术,获得充足的ds cDNA;应用抑制性消减杂交(SSH)技术分离BEAS-2B与其恶性转化细胞之间差异表达的基因片段;再通过T/A克隆和蓝白筛选实验,克隆BEAS-2B与其恶性转化细胞之间差异表达的基因片段,构建二者之间差异表达的cDNA消减文库.结果 通过SSH和T/A克隆等技术成功构建了具有较高消减效率的BEAS-2B与其恶性转化细胞之间差异表达的cDNA消减文库,文库经扩增后得到107个白色克隆和41个蓝色克隆.结论 应用SSH技术成功构建了具有较高消减效率的BEAS-2B与其恶性转化细胞之间差异表达的cDNA消减文库,为进一步研究个旧矿粉致肺癌发生的分子生物学机制奠定了基础.     

云锡矿粉诱导人肺上皮细胞转化和成纤维细胞活化过程中的相互作用

目的 探讨云锡矿粉诱导人肺上皮细胞转化及成纤维细胞活化过程中的相互作用.方法 常规培养永生化人支气管上皮细胞(BEAS-2B)及人胚肺成纤维细胞(WI-38),每6天传代1次;100μg/ml的云锡矿粉隔代诱导BEAS-2B及WI-38至第9代,共诱导5次,自第11代分组共培养至第40代.刀豆凝集素A及锚着独立性生长实验检测细胞恶性转化,流式细胞术检测细胞周期变化,免疫细胞化学法检测成纤维细胞α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)表达.结果 (1)与正常BEAS-2B细胞相比,矿粉诱导的BEAS-2B细胞单独培养至第28代细胞形态开始出现改变;与WI-38细胞共培养后,细胞形态改变提早至第20代;与矿粉诱导的WI-38细胞共培养后,细胞形态改变进一步提早至第16代.矿粉诱导的BEAS-2B细胞培养至第26代时凝集实验出现阳性;与WI-38细胞及矿粉诱导的WI-38细胞共培养后,细胞凝集时间缩短.与WI-38细胞共培养的矿粉诱导BEAS-2B及与矿粉诱导WI-38细胞共培养的矿粉诱导的BEAS-2B细胞分别在第26及第36代锚着独立性生长实验出现阳性,第36代的克隆形成率分别为6.00‰±1.00‰和15.33‰±2.52‰,且差异有统计学意义(P<0.05).矿粉诱导的各组上皮细胞S期细胞所占比例随培养代数增加逐渐升高,细胞发生恶性转化.(2)100 μg/ml矿粉诱导的成纤维细胞培养至第26代出现α-SMA表达;与上皮细胞共培养后,成纤维细胞α-SMA表达增强,且随培养代数的增加,阳性表达细胞数明显增多,着色程度增强.结论 个旧矿粉能诱导支气管上皮细胞恶性转化及成纤维细胞活化;肺上皮细胞是矿粉诱癌的主要靶细胞;肺上皮细胞的转化和成纤维细胞的活化相互影响,相互促进.     

P53、MDM2、P21、P16在云锡矿粉诱导的人支气管上皮恶性转化细胞中的表达

[目的]研究P53通路相关蛋白在云锡矿粉诱导的细胞恶性转化过程中的变化情况。[方法]采用免疫荧光细胞化学染色技术分别检测正常人支气管上皮细胞株(BEAS-2B)、矿粉作用后第25代细胞(BEAS-MD-25)及软琼脂克隆形成细胞(BEAS-MD-C)中P53、MDM2、P21、P16的表达。[结果]P53、MDM2蛋白在BEAS-2B细胞中表达呈阴性,而在BEAS-MD-25及BEAS-MD-C细胞中均呈阳性;P21、P16蛋白在BEAS-2B细胞中表达呈阳性,随细胞转化进程表达不断下降;在BEAS-MD-25细胞中呈弱阳性;在BEAS-MD-C中呈阴性。[结论]转化细胞中P53、MDM2、P21、P16的表达异常,提示其P53通路已发生改变,第25代细胞P53蛋白的阳性表达,提示P53基因异常可能是细胞发生恶性转化的关键步骤之一。     

云锡矿粉诱导人肺上皮细胞转化过程中FHIT蛋白和Ki-67抗原的表达及意义

目的 探讨云锡矿粉诱导人肺上皮细胞转化过程中脆性组胺酸三联体(FHIT)蛋白和Ki-67抗原的表达及意义.方法 选用100 μg/ml的云锡矿粉染毒永生化人支气管上皮细胞BEAS-2B(B)及人胚肺成纤维细胞WI-38(W),每次染毒72 h,隔代染毒直至第9代.自第11代起将上述细胞分组共培养.B100表示100μg/ml矿粉诱导的B细胞,W100表示100 μg/ml矿粉诱导的W细胞.分组如下:B组;B(W)组:与W共培养的B细胞;B(W100)组:与W100共培养的B细胞;B100组:100 μg/ml矿粉诱导的B细胞;B100(W)组:与W共培养的B100细胞;B100(W100)组:与W100共培养的B100细胞.应用免疫细胞化学法检测第16、26及36代各组上皮细胞中FHIT蛋白和Ki-67抗原的表达,以Ki-67蛋白阳性细胞数计算细胞增殖指数(PI).结果 BEAS-2B上皮细胞中存在FHIT蛋白表达,各代B组、B(W)及B(W100)组细胞FHIT蛋白表达水平无明显差异.第16代,B100组细胞FHIT蛋白表达水平低于B组细胞,B100(W)组及B100(W100)组FHIT蛋白表达水平较B100组进一步降低.第26代,B100、B100(W)及B100(W100)组细胞FHIT蛋白表达水平进一步降低,而至第36代,经矿粉诱导转化的上皮细胞重现FHIT蛋白的表达,且B100组、B100(W)组、B100(W100)组表达强度呈递增趋势.第16、26及36代未经矿粉诱导的各组肺上皮细胞Ki-67阳性细胞数PI均＜3%.第16代,B100组、B100(W)组及B100(W100)组细胞Ki-67阳性细胞PI分别为4.40%、4.97%和7.87%,第26代时分别增加为7.33%、7.87%和12.66%,第36代时分别进一步提高为12.60%、19.73%和24.80%.与B100、B100(W)组比较,第16、26、36代B100(W100)组阳性细胞PI明显增高,差异有统计学意义(P＜0.05).结论 FHIT可能是云锡矿粉诱导BEAS-2B上皮细胞转化的一个作用靶点,云锡矿粉诱导可导致BEAS-2B上皮细胞Ki-67阳性细胞数增加,增殖活性增强.     

miR-3666在香烟烟雾诱导人支气管上皮细胞恶性转化中的表达变化及其功能研究

目的 探索microRNA-3666(miR-3666)在香烟烟气长期染毒致使的人永生化支气管上皮细胞BEAS-2B恶性转化过程中的表达调控及其功能研究。方法 将BEAS-2B细胞以每孔1×10⁵个的浓度种植于六孔板Transwell膜上室，设置细胞气体染毒装置染毒程序为烟雾浓度20%,染毒时间10 min,每4天染毒一次，2次染毒后收集细胞作为染毒1代，依次获得染烟恶性转化第30代(S30)细胞。通过荧光定量PCR(qPCR)技术检测miR-3666在S30恶性转化细胞以及肺腺癌(LUAD)细胞系A549和H1299中的表达量；通过miRNA mimic转染，过表达S30及LUAD细胞系中的miR-3666;通过CCK8法检测过表达miR-3666后S30细胞和LUAD细胞系恶性增殖能力的变化；通过Transwell侵袭实验检测过表达miR-3666对S30细胞及LUAD细胞系侵袭能力的影响；通过流式细胞术检测miR-3666表达对S30细胞及LUAD细胞系凋亡能力的影响。结果 与BEAS-2B细胞相比，染烟恶性转化S30细胞和肺腺癌细胞系中miR-3666表达...     

煤焦沥青烟提取物致人支气管上皮细胞BEAS-2B染色体不稳定性研究

目的 建立煤焦沥青烟提取物诱导的人支气管上皮细胞BEAS-2B株的恶化模型;观察不同时期细胞的染色体不稳定性与细胞恶性转化之间的关系.方法用四唑蓝(MTT)法测定煤焦沥青烟提取物的细胞毒性,以煤焦沥青烟提取物诱导并观察BEAS-2B细胞传代转化过程中的形态学改变;软琼脂克隆形成实验检测细胞恶性转化能力,流式细胞术检测细...     

α照射致BEAS-2B 细胞损伤circRNA分子筛选及功能预测

目的 探讨α照射对BEAS-2B细胞circRNA表达的影响，筛选潜在标志分子。方法 利用α源照射装置对BEAS-2B细胞进行分次照射，每次照射剂量为0.1 Gy，每次照射后传代培养10代，累计照射4次，传代培养40代。选取累计照射2次并传代培养20代细胞2B-0.1Gy（2）-20和累计照射4次传代培养40代的细胞2B-0.1Gy（4）-40，利用基因芯片进行circRNA的检测，进而筛选标志分子；通过CircInteractome等在线工具进行circRNA分子的功能预测分析。结果 经α照射后，2B-0.1Gy（2）-20及2B-0.1Gy（4）-40分别获得差异表达circRNA 357个及451个；共同差异表达且趋势一致的 circRNA 6个。circRNA功能预测显示，与6个circRNA相互作用miRNA达195个，且这些miRNA主要参与脂肪酸生物合成、赖氨酸降解、脂肪酸代谢等KEGG通路；5个circRNA相互作用蛋白及2个母源基因与肺癌患者总生存期显著相关。进一步利用Metascape构建了共同差异表达circRNA母源基因及蛋白的相互作用网络图。结论 α照射可诱导BEAS-2B细胞circRNA的差异表达，筛选获得6个潜在circRNA标志物分子；生物信息学分析揭示，候选circRNA可能通过“miRNA海绵”、“RBP海绵”等参与α照射致BEAS-2B细胞的损伤及恶性转化。     

温石棉对人支气管上皮细胞BEAS-2B凋亡的影响

[目的]研究温石棉对永生化人支气管上皮细胞（BEAS-2B）凋亡的影响,比较单细胞凝胶电泳试验（SCGE）与流式细胞术（FCM）检测细胞凋亡结果的异同。[方法]选用BEAS-2B细胞为受试物,以5、10,20、40、100、200μg／cm^2不同剂量的温石棉,分别刺激BEAS-2B细胞24、48、72h,阳性对照用石英（SiO2）,阴性对照用硅灰石（WO1）,用四甲基偶氮唑盐（MTT）比色法检测温石棉对BEAS-2B活力的影响。用终剂量10μg／cm^2温石棉、5μg／cm^2 SiO2、20μg／cm^2 WO1分别刺激细胞24、48和72h后,采用SCGE和FCM检测温石棉对BEAS-2B凋亡指数和凋亡率的影响。采用逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）技术检测凋亡相关半胱氨酸蛋白酶-3基因caspase-3、caspase-9的表达。[结果]10μg／cm^2温石棉可诱导BEAS-2B细胞凋亡,呈时间-效应关系（P〈0.05）,采用SCGE和FCM方法检测细胞凋亡率结果一致。温石棉刺激BEAS.2B细胞24、48、72h后凋亡指数为11.7％、21.8％和34.5％,凋亡率为9.6％、17.9％和31.2％;温石棉诱导细胞caspase-3、caspase-9表达水平随时间增加而增加。[结论]温石棉可诱导BEAS-2B凋亡;SCGE和FCM均可以灵敏、快捷地检测温石棉对BEAS-2B的凋亡作用。     

煤焦沥青烟提取物致人支气管上皮细胞恶性转化细胞端粒损伤研究

目的 探讨煤焦沥青致人支气管上皮细胞(BEAS-2B)恶变细胞的端粒损伤作用.方法 用中温煤焦沥青烟提取物作为诱导剂,建立永生化BEAS-2B的恶性转化模型,用实时荧光定量聚合酶链反应(RT-PCR)法检测端粒DNA长度和端粒酶活力变化.结果 煤焦沥青烟提取物诱导BEAS-2B细胞后,30代时诱导组细胞能在软琼脂上形成典型的阳性克隆,染色体二倍体核型比例显著降低,形成恶性转化细胞.BEAS-2B恶性转化细胞端粒DNA长度缩短(0.41±0.03),与正常对照组(1.01±0.08)和二甲基亚砜(DMSO)组(0.92±0.04)比较,差异均有统计学意义(P ＜0.001).BEAS-2B恶性转化细胞端粒酶活力增强(1.62:0.07),与正常对照组(1.03±0.08)和DMSO组(1.11±0.03)比较,差异均有统计学意义(P＜0.001).结论 端粒损伤在煤焦沥青致细胞恶性转化中起重要作用.     

温石棉诱导人支气管上皮细胞错配修复基因表达改变

目的研究温石棉诱导人支气管上皮细胞系的BEAS-2B细胞恶性转化活力及错配修复基因表达的变化。方法以2×10-3μg/m2温石棉纤维染毒BEAS-2B细胞,每10 d染毒24 h,待细胞出现生长抑制后用锚着不依赖性生长实验判断细胞恶性转化,并利用实时定量逆转录聚合酶链反应(qRT-PCR)方法检测温石棉对BEAS-2B染毒12 h、24 h、48 h、60 d等不同染毒阶段的人类错配修复基因hMSH1和hMLH2的mRNA表达的变化。结果细胞染毒60 d后生长加快,接触抑制消失,呈现重叠生长,并可在软琼脂中生长。温石棉染毒24 h和48 h组mRNA表达下调,60 d组表达上调。结论温石棉可导致人支气管上皮细胞BEAS-2B错配修复基因表达发生变化。     

煤焦沥青烟提取物致BEAS-2B恶性转化细胞端粒蛋白的变化

目的 通过检测端粒保卫蛋白复合体中端粒保卫蛋白1 (POT1)、端粒重复序列结合因子1(TRF1)和TRF2在煤焦沥青烟致永生化人支气管上皮细胞(BEAS-2B)癌变细胞中的表达变化,探讨其在煤焦沥青烟致肺癌发生中的作用。方法 用中温煤焦沥青烟提取物作为诱导剂,建立BEAS-2B的恶性转化模型,用实时荧光定量反转录-聚合酶链反应法(RT-PCR)检测POT1、TRF1和TRF2基因mRNA表达水平;细胞爬片免疫组化半定量法检测其蛋白表达改变。结果 BEAS-2B恶性转化细胞POT1和TRF1基因mRNA表达水平（分别为：0.63-0.04,0.36-0.01）和蛋白表达水平(分别为：0.36±0.05,0.09±0.03)均下调,与正常对照组(mRNA：POT1：1.00±0.04,TRF1：1.01±0.16;蛋白：POT1:0.55±0.07,TRF1：0.27±0.07)和二甲亚砜溶剂对照组(mRNA:POT1:0.89±0.12,TRF1：0.90±0.08;蛋白：POT1:0.55±0.10,TRF1:0.26±0.04)相比,差异均有统计学意义(P＜0.05)。BEAS-2B恶性转化细胞TRF2基因mRNA表达水平( 1.45±0.07)和蛋白表达水平(0.88±0.06)均上调,与正常对照组(mRNA:1.00±0.07,蛋白：0.48±0.06)和二甲亚砜溶剂对照组（mRNA:1.00±0.06,蛋白：0.50±0.06）相比,差异均有统计学意义(P＜0.05)。结论 在煤焦沥青烟致支气管上皮细胞恶性演化过程中,POT1、TRF1和TRF2基因和蛋白表达水平发生变化。     

煤焦沥青烟提取物致BEAS-2B恶性转化细胞中姊妹染色单体分离相关蛋白的改变

目的 通过检测姊妹染色体凝集和分离相关蛋白染色体结构维持蛋白(SMC)1、SMC3、分离酶(Separase)和保全素(Securin)在煤焦沥青致BEAS-2B癌变细胞中的变化,探讨其在煤焦沥青接触者肺癌发生中的作用.方法 用中温煤焦沥青烟提取物作为诱导剂,建立永生化人支气管上皮细胞BEAS-2B的恶性转化模型,用实时定量反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测相关基因的mRNA表达水平;细胞爬片免疫组化半定量法检测其蛋白表达改变.以二甲亚砜(DMSO)溶剂组和未染毒的正常传代的BEAS-2B细胞为对照组.结果 与正常对照组和DMSO溶剂对照组比较,煤焦沥青烟提取物诱导转化细胞中,SMC1基因和蛋白表达水平的差异无统计学意义(P＞0.05);煤焦沥青烟诱导组SMC3和Separase的基因和蛋白表达水平明显升高(基因:SMC3:2.54±0.20、Separase:2.42±0.22,蛋白:SMC3:0.27±0.02、Separase:0.25±0.02),Securin的基因和蛋白表达水平明显降低(基因:0.30±0.04,蛋白:0.17±0.01),与其他两组(DMSO溶剂对照组:基因:SMC3:1.13±0.12、Separase:1.00±0.04、Securin:0.90±0.11,蛋白:SMC3:0.10±0.03、Separase:0.18±0.02、Securin:0.22±0.02;正常对照组:基因:SMC3:1.00±0.11、Separase:1.00±0.08、Securin:1.00±0.11,蛋白:SMC3:0.09±0.01、Separase:0.18±0.01、Securin:0.23±0.02)相比,差异均有统计学意义(P＜0.05).结论 在煤焦沥青致支气管上皮细胞恶性转化过程中,姊妹染色单体凝集和分离相关蛋白SMC3和Separase升高,Securin表达水平降低,参与了细胞恶性转化过程.     

NF-κB在香烟烟雾凝集物诱导人支气管上皮细胞IL-8表达中的作用

目的研究核因子κB(NF-κB)在香烟烟雾凝集物(CSC)诱导人支气管上皮细胞IL-8表达中的作用。方法利用IL-8促进子上NF-κB结合位点突变的BEAS-2B细胞株(IL-8mNF-κB-BEAS-2B细胞)和野生型BEAS-2B细胞株(IL-8 WT BEAS-2B细胞,其IL-8促进子上含有完整的NF-κB结合位点),经7.5%CSC处理后,用荧光定量PCR方法检测处理后细胞荧光素酶基因(luciferase,fLCF)mRNA水平的变化,并用荧光素酶报告基因活性检测试剂盒检测处理后细胞的荧光素酶活性大小。结果 7.5%CSC处理2种BEAS-2B细胞后,IL-8 WT BEAS-2B细胞的fLCF mRNA表达量和荧光素酶活性均高于IL-8mNF-κB-BEAS-2B细胞(P<0.001),其中fLCF mRNA表达量是IL-8mNF-κB-BEAS-2B细胞的1.32倍(P<0.001)。结论 NF-κB转录因子通过参与炎症因子IL-8表达,促进吸烟导致的呼吸系统炎症反应。     

大气PM_(2.5)有机提取物暴露对BEAS-2B细胞因子表达的影响

目的通过观察人支气管上皮细胞(BEAS-2B)株释放IL-8I、L-1β、SICAM-1等的变化,探讨PM2.5有机提取物(EOM)对气道上皮细胞的炎性损伤作用;并研究BEAS-2B损伤后释放的炎症因子诱导T淋巴细胞表达CD25,从而可能参与类似于过敏性哮喘的变态反应过程。方法BEAS-2B暴露于3.75、7.5、15μg/mlPM2.5有机提取物,双抗夹心ELISA法检测培养上清液中IL-8I、L-1β、SICAM-1的变化;将BEAS-2B细胞损伤后释放的炎症因子作用于人外周血淋巴细胞,流式细胞仪检测淋巴细胞CD25阳性表达率。结果阴性对照组有少量IL-8I、L-1β、SICAM-1表达,且随着时间延长略有增加;与阴性对照组相比,随着PM2.5有机提取物染毒剂量的增加和作用时间的延长,IL-8I、L-1β、SICAM-1的表达也增高,差异具有统计学意义(P<0.01)。结论BEAS-2B细胞暴露于PM2.5有机提取物后,释放与气道炎症反应及气道高变应性相关的IL-8I、L-1β、SICAM-1等炎性因子;BEAS-2B细胞损伤后释放的IL-1β等炎性因子能够促进T淋巴细胞表达CD25分子,从而可能参与类似于过敏性哮喘的变态反应过程。