细粒棘球绦虫细胞体外培养的研究：Ⅰ细粒棘球蚴生发层细胞分离

本文报道采用胰酶消化的方法分离细粒棘球蚴生发膜细胞的膜结果，在３７℃下１０分钟的效果最好，延长消化时间可使细胞浆破裂，形成较多的裸核，不利于细胞进一步培养。梯度离心的分离方法增加细胞损伤，不能达到分离不同细胞的效果。分离的生发层细胞超微结构与完整生发膜超微切片上基本相同，能表现有线粒体肿胀和数量减少等特点，表明胰酶处理的细胞代谢能力受到一定的抑制。将分离的生发层细胞接种Ｂａｌｂ／ｃ小鼠腹腔可形成棘     

人体细粒棘球蚴的组织化学观察

包虫囊的组织形态学和超微结构，国内已有较多的报道［１－４］，但对包虫囊的组织化学观察尚少报道。作者对手术切除标本进行组织化学染色观察，旨在进一步探讨人体细粒棘球蚴的组织结构及其生物学意义。材料与方法受检对象为我院１９８１－１９９４年经手术证实的包虫病...     

他克林体外抗细粒棘球蚴作用研究

目的 研究乙酰胆碱酯酶抑制剂他克林体外抗细粒棘球蚴的作用效果。方法 体外分离和培养细粒棘球蚴原头节和生发层细胞,经浓度为4、8、10、20和40 μg/mL的他克林作用3 d后经0.1%亚甲基蓝染色观察,记录死活原头节的数目以计算原头节死亡率,另外用CCK-8试剂盒检测药物对生发层细胞活性的影响并计算细胞活性抑制率。同时用透射电镜和扫描电镜分别观察药物对细粒棘球蚴原头节和生发层细胞超微结构造成的影响。结果 经20 μg/mL和40 μg/mL的他克林体外作用3 d后,原头节的死亡率高达100%,其中死亡原头节的体壁出现轻微肿胀且伴随着外部轮廓的消失,同时超微结构亦发生明显改变,原头节体壁组织中出现了大量的空泡和脂肪滴。当他克林浓度为40 μg/mL时,可造成生发层细胞全部死亡。细粒棘球蚴生发层细胞粘附于培养介质的基质消失、细胞发生聚集且数目减少。扫描电镜可观察到他克林作用3 d后的细胞出现塌陷或者萎缩。结论 他克林可直接影响体外培养的细粒棘球蚴原头节和生发层细胞的活性,是潜在的包虫病治疗药物。     

胆汁对体外细粒棘球蚴原头节的作用观察

目的探讨不同浓度的胆汁对细粒棘球蚴原头节的生长作用及形态学影响。方法将体外培养的细粒棘球蚴原头节分别加入40％、60％、80％、100％的胆汁中体外孵育。0．1％伊红染色在倒置显微镜下检测原头节的活力及形态改变,实验重复三次;透射电子显微镜下（TEM）下观察胆汁作用后原头节表面超微结构改变。结果不同浓度的胆汁对原头节均有杀伤作用,其中浓度为100％和80％的胆汁对细粒棘球蚴原头节杀伤作用最明显。倒置显微镜下观察发现,不同浓度的胆汁作用细粒棘球蚴原头节后,原头节多呈外翻型,原头节顶突上的小钩排列紊乱,部分脱落,吸盘突起,变形,活动性减弱。随着浓度的增加,变化越明显。超微结构显示40％的胆汁作用3d后,原头节纤毛出现少量缺损,合胞体带排列较紊乱,合胞体带内出现散在少量的空泡和脂滴。60％胆汁作用3d后,合胞体带内微毛出现融合,腔内出现空泡和脂滴,数量多且大。结论胆汁作用后,可导致体外细粒棘球蚴原头节的形态发生不同程度的改变并有有抑制作用,然而关于胆汁在体内的疗效有待于进一步研究。     

小鼠细粒棘球蚴不育囊的超微结构观察

用透射电镜观察了小鼠细粒棘球蚴不育囊的超微结构。其囊壁由角皮层和生发膜构成,角度层含有纤维基质和不规则形颗粒,生发膜又可分皮层区和细胞区。在皮层区基部见到线粒体,微毛间见到“吞饮泡”样质膜凹陷;在细胞区主要有皮层细胞、肌细胞、含糖原细胞等,在有的含糖原细胞中还见到“核仁管系统。”     

吡喹酮长程疗法对NIH小鼠体内细粒棘球蚴的组织学影响

本文应用组织学的方法,观察了吡喹酮引起的NIH小鼠体内细粒棘球蝴的变化。结果表明,在剂量为500mg/kg/d ,连续给药15及90天时,生发层变性及坏死的发生率依次分别为41.3％及36.5％和23.5％及70.7％,两组间坏死率的差别有高度显著性(P<0.001);原头节变性及死亡的发生率依次分别为37.9％及1O.3％和28.4%及65.4％,两组间死亡率的差别亦有高度显著性(P<0.001)。连续治疗30～90天,少数细粒棘球蚴的角质层出现不同程度的局部破裂及炎性细胞侵入,部分受损生发层的表面还有炎性细胞的粘附。     

继发性细粒棘球蚴的组织及组织化学观察

本文对感染原头节后7～9个月的 NIH 小鼠体内继发性细粒棘球蚴的组织结构及生化物质定位、含量及活力等进行了较为系统的观察,并与原发性细粒棘球蚴的作了比较。对组织化学的生理意义及结构特点进行了简要的讨论。     

细粒棘球绦虫虫卵的光镜和电镜观察

应用光镜和电镜技术对细粒棘球绦虫虫卵进行了观察，结果表明细粒棘球绦虫虫卵发育经６个时期：受精卵细胞；胚细胞团；早期虫卵；前期虫卵；未成熟虫卵和成熟虫卵。虫卵壳膜由５层构成：卵壳层；卵黄膜；胚膜；钩蚴膜和颗粒层。六钩蚴分为纤维区和代谢区，前者含有网状和条索状纤维物质，不含细胞成分；后者具有生发细胞、体细胞等，并对各自的形态特点和生理意义进行了讨论。     

细粒棘球蚴生发层细胞系的建立

目的：为获得能在体外稳定繁殖的细粒棘球蚴细胞系。方法：用研磨法将绵羊源细粒棘球蚴生发层处理得分散的生发细胞，将其在含10％—20％小牛血清的RPMI1640培养基在24孔培养板和包被胶原的24孔细胞培养板上交替培养至14代，随后在常规24孔培养板上连续传代培养；用倒置显微镜观察细胞形态及生长繁殖情况；将培养细胞接种BALB／c小鼠以观察其形成继发性包囊的能力；用ELISA法研究细胞系抗原的免疫学特征。结果：生发层细胞已在体外连续培养75代以上，生长良好；细胞系细胞呈圆形，具有形成合胞体乃至类组织块 的趋势，在4℃冰箱中至少可保存半个月，在液氮中至少可保存10个月；将细胞接种BALB／c小鼠后3个月至7个月，解剖未见细粒棘球蚴包囊生长; 细胞系抗原可和抗生发层体抗原、原头节可溶性抗原、囊液抗原的小鼠血清及人工感染原头节的阳性小鼠血清起反应。结论: 细粒棘球蚴生发层细胞系已经建立。     

DNA探针用于鉴别细粒棘球绦虫与多房棘球绦虫的研究

用DNA探针pHD5、pEG18、pSM889 对我国细粒棘球蚴与多房棘球蚴通过限制性内切酶 BamHI与 EcoRI 酶解后用 Southern 转移杂交法进行了虫种鉴别。该方法敏感、特异,尤其对在光镜下无法区分的标本更具有鉴别的优越性。它能够用于包虫病流行病学基线调查及监测,为包虫病的防治提供准确的依据。     

细粒棘球绦虫基因库的构建

细粒棘球绦虫DNA经Sau3AI部分水解,并用电洗脱方法从琼脂糖凝胶中回收15-23kb大小的片段。得到的片段与λ噬菌体置换载体EMBL3 DNA重组,采用体外包装系统构建了细粒棘球绦虫的基因库,获得了1.2×10~6个重组子。通过与探针的分子杂交,从库中分离到6个细粒棘球绦虫γDNA基因的阳性克隆。     

人源细粒棘球蚴染色体测定

为鉴定棘球地细胞系及棘球绦虫的遗传分类提供依据，本实验测定了人源细粒棘球拗染色体。从外科手术的包虫病人体内获取棘球蚴原头节和生发层细胞，按染色体的常规制备方法并加以改进，制备染色体标本。通过对141个分裂像的观察分析，结果表明细粒棘球蚴染色体组的染色体数在5～20条之间，14～18条占明显优势。每一核型有一对染色体呈大棒状，似呈中间或亚中着丝粒，其余染色体呈方点状，似呈端着丝粒。本实验建立了适合棘球蚴染色体制备的方法，在国内首次测定了人源细粒棘球蚴染色体。     

细粒棘球蚴全长cDNA文库的构建及初步鉴定

目的　分离目的基因构建cDNA文库的经典方法繁琐且不易得到全长cDNA(3’和 5’端 ,尤其是基因的 5’非翻译区 )。本研究通过构建细粒棘球蚴全长cDNA文库 ,筛选全长目的基因 ,研究其结构和功能。方法　采用TRIZOL试剂提取E .granulosus总RNA ,用ClonTech公司的SMARTTMcDNA文库构建试剂盒构建E .granulosus原头节全长cDNA文库 ,文库的包装使用EICENTERTECHNOLOGIES公司提供的包装蛋白。结果与结论　成功构建细粒棘球蚴全长cDNA文库 ,文库滴度为 1.4× 10 7pfu/ml。文库的重组效率达到 99%以上 ,插入片段长度约为 1.1kb。     

阿苯达唑脂质体对小鼠细粒棘球蚴囊超微结构的影响

目的:探讨阿苯达唑脂质体(liposom alalbendazole,L-ABZ)及其联合西咪替丁(cim etidine,CTD)治疗小鼠细粒棘球蚴病的病理形态变化。方法:将阿苯达唑脂质体及西咪替丁(1.5% 乳液阿苯达唑200 m g/kg,西咪替丁100 m g/kg),经口灌喂感染小鼠3个月后,用光镜和电镜观察小鼠肝、腹细粒棘球蚴囊结构的病理改变。结果:以阿苯达唑脂质体联合西咪替丁治疗组细粒棘球蚴囊组织变性坏死改变最为显著,与对照组有显著性差异(P< 0.01)。结论:脂质体包封阿苯达唑,可提高阿苯达唑的抗细粒棘球蚴作用,西咪替丁具有明显的协同作用     

细粒棘球蚴生发细胞体外培养的实验观察

目的 :为培育人源细粒棘球蚴细胞系 (株 ) ,以供用于免疫预防研究。方法 :用外科方法从临床确诊的细粒棘球蚴患者的肝脏中取出包囊 ,以生发层和原头节为培养材料 ,采用RPMI1640、199和改良 DMEM培养液 ,用鼠尾胶原蛋白包被和不包被的培养瓶 ,对其进行初培养 ,并进行对比观察。结果 :以胶原蛋白作为支撑材料 ,应用改良 DMEM培养液培养的人源细粒棘球蚴生发层和原头节效果优于其他 ,已成功地培育了人源细粒棘球蚴细胞系 ,并传至第 2 0代。原代培养时间需 2 8d- 4 5d,3代以内细胞为多形态性。结论 :建立了适合人源细粒棘球蚴细胞体外培养的方法。     

新疆细粒棘球蚴95基因的克隆及同源性分析

目的　分析新疆地区细粒棘球蚴 95 (EG95 )基因结构特点。　方法　从新疆地区细粒棘球蚴原头节中提取基因组 DNA,以细粒棘球蚴原头节 DNA为模板进行 PCR扩增 ,获得 EG95基因 ,将其克隆至 p UCm- T载体 ,利用 DNAman软件及 Gene Bank/BL AST功能测序并对其进行基因全序列分析。　结果　测序显示新疆株 EG95 (EG95 - XJ)基因片段为 1191bp。 BL AST比对分析表明 EG95 - XJ基因与新西兰株 EG95基因家族成员同源性达 86 %～ 97% ,所有的碱基差异均发生于内含子区域。　结论　中国新疆地区的 EG95基因为 EG95基因家族成员之一 ,但其序列与新西兰株 EG95基因之间存在一定的差异。