三种提取丙型肝炎病毒RNA方法的定量比较

目前用ＲＴ—ＰＣＲ检测ＨＣＶ尚缺乏稳定理想的ＲＮＡ提取方祛,不同方法效果相差极大。我们利用荧光定量ＲＴ－ＰＣＲ技术准确定量、易于判断ＲＮＡ提取效率的优点,建立了一种快速高效的血清ＲＮＡ提取方祛。 １．资料与方法：（１）血清：高病毒滴度的阳性血清由广州市血站购回,ＨＣＶ抗体阳性,并经荧光定量ＲＴ－ＰＣＲ检测证实。阴性血清为健康人血清,ＨＣＶ抗体和ＨＣＶ荧光定量ＲＴ－ＰＣＲ均为阴性。（２）检测ＨＣＶ的荧光定量ＲＴ－ＰＣＲ方法：检测ＨＣＶ的荧光定量ＲＴ—ＰＣＲ试剂盒为我们中心生产的同一批号试剂,荧光定…     

竞争PCR及其产物酶联杂交定量检测HBV DNA

（本文编辑：何亚玲校对：谢娜）我们用与野生模板等长和等效扩增的突变模板作为内参照,通过竞争ＰＣＲ对ＨＢＶ基因进行扩增,并引入微反应板酶联杂交技术对扩增产物定量分析。１．资料与方法：（１）ＨＢＶＤＮＡ标准品：质粒ｐＡＤＲ－１ＤＮＡ经ＢａｍＨ　Ｉ酶切线性化后精确定量。（２）ＰＣＲ２．１－ＷＳ３１９和ＰＣＲ２．１－ＭＳ３１９质粒：均由长征医院感染科实验室（简称本室）构建。（３）ＨＢＶＤＮＡ阳性血清抽提物（１０份）本室冻存。（４）竞争ＰＣＲ：在０．２ｍｌ薄壁ＰＣＲ反应管内,每管加入２５μＩＰＣＲｍｉｎ、…     

分级定量PCR检测血清HBV DNA

目的利用竞争ＰＣＲ法建立分级测定ＨＢＶＤＮＡ含量的定量方法．方法设立３个标准竞争模板（１０２ｃｏｐ,１０４ｃｏｐ,１０６ｃｏｐ）,分别和恒量的待测模板混合,分别进行４０,３０,２０次循环的ＰＣＲ扩增,最后凝胶电泳分离待测模板和竞争模板的ＰＣＲ产物,测定两者的荧光强度的比值,计算待测模板的初始量．结果对乙型肝炎血清ＨＢＶＤＮＡ定量表明,１２份ＨＢｅＡｇ阳性血清,ＨＢＶＤＮＡ的血清浓度在６×１０７～１×１０１１ｃｏｐ／Ｌ,而１２份ＨＢｅＡｂ阳性血清只有７份可检出ＨＢＶＤＮＡ,它们的血清浓度均在３×１０８ｃｏｐ／Ｌ以下,其余５份用该ＰＣＲ方法,检测不到．结论该方法可用于ＨＢＶＤＮＡ以及其他病原体ＤＮＡ的定量     

HBV DNA荧光定量PCR检测的临床意义

乙型肝炎病（ＨＢＶ）毒核酸定量测定方法经过近几年的长足发展，迄今已有数种检测设备和商业化试剂盒面市，其中Ｒｏｃｈｅ公司新开发的Ｌｉｇｈｔｃｙｃｌｅｒ荧光定量ＰＣＲ仪和深圳匹基公司推出的ＨＢＶ荧光定量ＰＣＲ（ＦＱ－ＰＣＲ）检测法的临床应用鲜见报道。我们采用上述设备和试剂定量测定ＨＢＶ ＤＮＡ并探讨其临床意义。 一、资料和方法 １．研究对象：我所２００１年１月至６月收治的门诊和住院患者共１５３例。 ２血清标志物检测：由本所临床检验室测定。ＨＢＶ标志检测采用军事医学科学院四环公司研制的试剂盒，ＨＢＶＤＮＡ…     

性病衣原体三种检测方法的比较研究

目的通过实验探讨一种简便、快速、准确而又经济的性病衣原体检测方法。方法对所选择的临床标本同时用ＭｃＣｏｙ细胞分离培养、ＭｃＡｂ荧光染色和ＰＣＲ法进行沙眼衣原体的检测，并用统计学方法分析结果。结果４４份临床标本中有３０份用３种方法检测均为阴性，７份为阳性，余７份结果不尽相同。三种方法检出率依次为２０．４５％、２５．００％、２９．５５％，用多组配对计数资料的ｘ２检验表明差别有显著意义。以培养法为标准，ＭｃＡｂ荧光法的符合率（９０．９１％）高于ＰＣＲ法（８６．３６％），而阳性率低于ＰＣＲ法。结论ＭｃＡｂ荧光法和ＰＣＲ法可为一种简便、快速而经济的判断衣原体感染的方法，但在进行临床诊断时，宜以一种以上方法同时检测，并结合临床表现进行评判为宜。     

鼠疫PCR实验室的设置及质量控制

１９９５年我国建立了鼠疫菌ＰＣＲ检测方法［１］，并应用于鼠疫监测研究工作中［２～３］。近年来我国的部分鼠疫疫源省区也相继开展了鼠疫菌ＰＣＲ检测试验。为了使该项工作顺利开展，确保操作的安全性和结果的可靠性，鼠疫ＰＣＲ实验室除了遵循常规实验室的要求外，还必须配备一些特殊的设备，制订更加严格的工作规程。１ＰＣＲ实验室及其仪器设备配置１．１ＰＣＲ实验室及基本设置 ＰＣＲ操作的不同时期要求在单独的实验室或至少在实验室内单独的区域中进行，以避免操作中造成污染。根据卫生部临床检验中心制定的实验室设置及其仪器设…     

巢式聚合酶链反应扩增幽门螺杆菌尿素酶基因

选用位于幽门螺杆菌（Ｈｐ）尿素酶Ｂ基因上３个引物组成的巢式聚合酶链反应（ＰＣＲ），成功地对Ｈｐ标准菌株及２１４例临床标本进行了扩增，并对样品的准备、ＰＣＲ反应物的组成及ＰＣＲ循环条件方面作了深入的研究，简化了操作程序，缩短了操作时间，降低了消耗。与既往所用的尿素酶试验及Ｗａｒｔｈｉｎ－Ｓｔａｒｒｙ银染色进行比较，显示其具有特异性强、灵敏度高、方法简便、快速且准确等特点，可作为常规检查在临床应用。     

丙型肝炎病毒聚合酶链反应直接序列分析方法的建立及应用(英文)

目的探讨快速完成丙型肝炎病毒ｃＤＮＡ（ＨＣＶｃＤＮＡ）序列分析的方法．方法将聚合酶链反应（ＰＣＲ）扩增与核酸序列分析技术相结合，以ＰＣＲ产物为测序模板，以ｒ３２ＰＡＴＰ标记ＰＣＲ扩增引物为测序引物，用ｔａｑＤＮＡ聚合酶直接测序．结果以琼脂糖或聚丙烯酰胺凝胶电泳回收ＰＣＲ产物制备测序模板可获得最佳测序效果．在需要测定大量标本时，为进一步简化操作步骤，可降低套式ＰＣＲ中第一次扩增反应的ｄＮＴＰ与引物浓度，以第一次ＰＣＲ扩增产物为模板，也可得到较好的测序结果。ＰＥＧ沉淀回收法不能去除非特异性ＰＣＲ产物，对ＰＣＲ直接测序有一定影响．采用此方法首次在一株ＨＣＶＮＳ５ｂ区发现一个新的缺失突变．结论ＰＣＲ直接序列分析是一种简便，快速，经济有效的核酸序列分析方法，适用于丙型肝炎病毒基因组的分析研究．     

三种快速结核病实验室检测方法的评价

三种快速结核病实验室检测方法的评价李晓明庄玉辉李国利吴雪琼张小刚夏湘萱近年来，聚合酶链反应（ＰＣＲ）技术为结核病的快速诊断提供了新方法。但ＰＣＲ方法也有其局限性。我们对结核杆菌特异重复序列ＩＳ９８６部分基因进行扩增，建立了ＰＣＲ检测结核杆菌的方法，用...     

疟原虫DNA模板制备用于PCR诊断方法的研究

为确立一种快速、敏感、特异的疟原虫检测方法，根据红内期疟原虫ＳＳＵｒＲＮＡ基因序列，设计合成引物３条，采用微量全血和滤纸干血滴标本快速制备疟原虫ＤＮＡ模板的９种方法，进行聚合酶链反应（ＰＣＲ）并比较。结果显示有５种方法的实验效果最佳，其中，全血ＰＣＲ仪预热及滤纸干血滴Ｃｈｅｌｅｘ煮沸两法操作简单、所需试剂较少。采用该两法对深圳地区２０２份和湖北地区１６份镜检阳性的全血和深圳地区１２９份滤纸干血滴标本进行检测，结果与镜检的符合率分别为９８．５％和９９．２％。表明本研究筛选出的两种方法制备ＤＮＡ模板的ＰＣＲ检测体系，适用于临床快速准确诊断间日疟、恶性疟或两者混合感染，尤其适用于流行病学调查，值得推广。     

新发现的糖尿病亚型—线粒体tRNA^Leu（UUR）基因突变糖尿病的…

作者介绍检测一种糖尿病亚型的ＰＣＲ／ＡｐａⅠ及ＰＣＲ／ＨａｅⅢ基因诊断２技术，具有省时，简便，结果易于判断的特点，适用于临床医学实验室进行。     

PCR诊断幽门螺杆菌感染的临床价值

目的探讨ＰＣＲ法在诊断胃粘膜幽门螺杆菌（Ｈｐ）感染中的临床价值．方法用ＰＣＲ方法对１５４例胃病患者胃粘膜Ｈｐ尿酶基因ＤＮＡ片断进行扩增，同时与尿酶试验及血清ＨｐＩｇＧ测定方法进行比较．结果ＰＣＲＨｐＤＮＡ的阳性率达９１％，与尿素酶试验（７４％）及血清ＨｐＩｇＧ（８１％）测定相比有显著差异（Ｐ＜００５）．Ｈｐ感染率随受检者年龄增长而增高．Ｈｐ感染与胃窦（９３％）及胃体（８４％）腺癌关系密切，而与食管癌及贲门癌（８０％）关系不大．结论ＰＣＲ法可明显提高Ｈｐ诊断的敏感性和特异性，也为Ｈｐ感染的深入研究开拓了新的研究思路和手段     

用核酸荧光定量PCR技术检测尖锐湿疣HPV的研究

对５０例病理诊断为尖锐湿疣（ＣＡ）的标本进行了核酸荧光定量ＰＣＲ检测，检出率为９６％。结果表明：核酸荧光定量ＰＣＲ可一次性完成对尖锐湿疣ＨＰＶ感染的检测，检测覆盖面宽，漏检率低，对尖锐湿疣的诊断有较好的应用价值。     

初步筛选心血管相关基因——表达序列片段测定法

目的从正常人胎儿心脏ｃＤＮＡ文库中，用ＤＮＡ自动测序的方法筛选心血管相关基因。方法（１）人胚胎心ｃＤＮＡ文库的构建；（２）挑取有目的基因片段插入的噬菌斑，选用正向Ｔ３和反向Ｔ７引物做ＰＣＲ扩增；（３）直接使用其ＰＣＲ产物做ＤＮＡ测序模板，用荧光标记的Ｔ３Ｂ引物做再次ＰＣＲ扩增；（４）用ＤＮＡ测序仪（ｐｈａｒｍａｃｉａ）测定基因表达序列片段（ＥＳＴｓ）；（５）将所获得的ＥＳＴｓ输入Ｇｅｎｅｂａｎｋ数据库做同源序列分析。结果（１）所构建的人胎儿心脏ｃＤＮＡ文库的库容量为１×１０９克隆，平均目的基因片段１．２～１．５ｋｂ，ＰＣＲ产物阳性克隆检出率高达７０％以上，用６％尿素－聚丙烯酰胺凝胶电泳５ｈ，可测ｃＤＮＡ序列片段２１０～５５０ｂｐ，平均３００ｂｐ；（２）在所测３１３２个克隆的ＥＳＴｓ中，新ＥＳＴｓ为４７．４％，已知序列片段为４４．１％。结论利用人胎儿心脏ｃＤＮＡ文库测定ＥＳＴｓ是筛选心血管基因的有效方法；构建高质量的ｃＤＮＡ文库是成功测定ＥＳＴｓ的保证。     

利用聚合酶链反应检测122例结核病患者标本中结核菌的研究

对１２２例门诊及住院结核病人的痰、脓汁等标本进行聚合酶链反应（ＰＣＲ）和直接涂片荧光镜检，培养检查结核菌，结果表示：ＰＣＲ阳性率为５６．９％（５８／１０２），培养阳性率为１４．７％（１５／１０２），直接涂片荧光镜检为２３．５％（２４／１０２）。说明ＰＣＲ特异性好，敏感性强，与临床符合率较高。ＰＣＲ比培养法大大节省时间，为结核病的诊断和鉴别赢得了时间，是一种可以推广的好方法。     

幽门螺杆菌flaA基因的变异

目的鞭毛是幽门螺杆菌（Ｈｐ）的重要侵袭因子,本研究拟检测Ｈｐ鞭毛素Ａ基因的变异性,进而研究其与Ｈｐ致病性的关系．方法我们对５２例胃粘膜活检标本和１８株Ｈｐ临床分离株进行Ｈｐ特异的１６ＳｒＲＮＡ基因和鞭毛素Ａ基因ＰＣＲ扩增和ＰＣＲＲＦＬＰ及ＰＣＲＲＦＬＰＳＳＣＰ分析．结果对４３例Ｈｐ（＋）的ｆｌａＡ基因ＰＣＲＲＦＬＰ（ＨｉｎｄⅢ）大约可分７个型（变异检出率为１６３％）,而ＰＣＲＲＦＬＰＳＳＣＰ可分３７个型（变异检出率为８６０％）,两者有非常显著性差异．结论ｆｌａＡ基因变异性极大,ＰＣＲＲＦＬＰＳＳＣＰ优于ＰＣＲＲＦＬＰ,是检测其变异的有效方法．     

175聚合酶链反应在结核杆菌检测中的应用

本综述了近５年来聚合链反应（ＰＣＲ）技术在结核杆菌检测中的应用情况，主要介绍了ＰＣＲ检测结核杆菌的方法，ＰＣＲ扩增靶基因的选择，敏感性和特异性及临床应用情况，并对临床应用中一些问题，如临床标本处理的简化，假阳性结果和假阴性结果的原因及对策进行了讨论。     

聚合酶链反应－冷单链构象多态性快速检测结核分支杆菌rpoB基因突变

目的评估ｒｐｏＢ基因突变检测在结核分支杆菌利福平耐药性测定中的应用价值。方法采用聚合酶链反应－冷单链构象多态性（ＰＣＲ－冷ＳＳＣＰ）方法对８７株结核分支杆菌临床分离株及有药敏结果的２２份相应肺结核患者痰标本进行分析。结果ＰＣＲ扩增ｒｐｏＢ基因的敏感性为１００ｐｇＤＮＡ及５０００个菌体，属于分支杆菌特异。所有分离菌的ｒｐｏＢ基因ＰＣＲ扩增均为阳性。采用套式ＰＣＲ可使扩增敏感性提高１００倍。与传统药敏试验方法相比，ＰＣＲ－冷ＳＳＣＰ对８７株结核分支杆菌临床分离菌利福平耐药性的检测敏感性和特异性分别为８９．６％及１００％。２２份涂阳培阳痰标本中套式ＰＣＲ扩增阳性的６份均为高度利福平耐药，其ＳＳＣＰ结果也与相应分离株的药物敏感性试验相符。结论ＰＣＲ－冷ＳＳＣＰ检测结核分支杆菌ｒｐｏＢ基因突变快速、简便、易行，适用于结核分支杆菌分离株利福平耐药性的快速测定。如进一步提高引物增特异性及敏感性，该技术可望用于临床标本直接检测     

Fc受体介导HCV跨膜研究系列报告:——丙型肝炎病毒定量及与基因型的关系

比较定性和定量ＰＣＲ检测结果 ,了解血清ＨＣＶＲＮＡ含量及与基因型的关系。为国家自然科学基金资助项目“滋养层细胞Ｆｃ受体介导ＨＣＶ跨膜转运研究”(Ｎｏ .39970 767)课题的检测方法建立、评价及筛选ＨＣＶ高滴度标本等的前期工作。采用荧光定量ＰＣＲ和逆转录套式定性ＰＣＲ同时检 166例丙型肝炎患者的血清ＨＣＶＲＮＡ ,两种方法均阳性者 ,再进行酶切分型。计算各型ＨＣＶＲＮＡ平均含量。结果表明 ,定性ＰＣＲ阳性率为 80 .12 % ,定量ＰＣＲ阳性率为 78.92 %。两者相对符合率为 93.98%。定量ＰＣＲ阳性血清 ( 131例 )ＨＣＶＲＮＡ…     

RT─PCR抗污染技术的研究

ＲＴ─ＰＣＲ抗污染技术的研究杜绍财，陶其敏，朱凌，刘金祥近几年来，ＰＣＲ技术已广泛地应用于不同疾病的临床诊断，由于该技术灵敏度非常高，能将目的基因扩增放大１×１０６￣２×１０６，所以在一般实验室极易发生污染而造成一定的经济损失，并影响实验结果的可靠性...