弓形体SAG1基因DNA诱导小鼠体液免疫应答及保护性研究

目的 :用重组真核表达质粒 pc DNA3- SAG1直接免疫 BAL B/ c小鼠 ,观察其 DNA免疫所诱导的小鼠体液免疫反应和保护性作用。方法 :大量制备重组质粒 pc DNA3- SAG1,然后将其导入 BAL B/ c小鼠体内。抗体滴度用 EL ISA法进行测定 :采用 PCR方法对小鼠的血液组织外源基因进行检测 ;对试验组及对照组进行 RH株攻击感染 ,并对其进行分析。结果 :用 EL ISA法检测的抗体 Ig G滴度为 1∶ 2 5 6 0 ;免疫后三周、六个月从免疫鼠的血液组织中用 PCR仍可检测到特异的SAG1基因的存在 :体外弓形虫攻击感染实验组和对照组 ,可见实验组的存活时间较对照组时间延长 (P<0 .0 5 )。结论 :重组质粒 pc DNA3- SAG1免疫 BAL B/ c小鼠可诱导一定的体液免疫应答和一定的保护性作用     

LW-AFC对环磷酰胺处理小鼠免疫功能的影响

目的探讨LW-AFC对免疫功能低下小鼠是否有改善作用。方法昆明小鼠ip给予环磷酰胺(CTX)0.02g·kg-1,连续10d,制备免疫功能低下小鼠模型。六味地黄(LW)浓缩丸(1.4g·kg-1)和LW-AFC(0.2,0.4和0.8g·kg-1)组小鼠在每次给予CTX后ig给予相应药物,连续10d。监测小鼠体重,以及胸腺和脾脏重量变化,并计算胸腺和脾脏系数;[3H]TdR掺入法检测脾淋巴细胞增殖反应,MTT法检测脾脏自然杀伤(NK)细胞杀伤活性,流式细胞术检测脾淋巴细胞中CD4+CD8-和CD4-CD8+T细胞亚群百分率,并计算CD4+/CD8+T细胞亚群比值。结果与正常对照组比较,模型组小鼠胸腺和脾重量及其系数明显降低,体重增长显著缓慢;LW和LW-AFC对小鼠体重增长缓慢、胸腺重量及其系数降低无明显改善作用;LW-AFC0.2g·kg-1对CTX导致的脾重及系数降低有明显改善(P<0.05)。模型组小鼠脾淋巴细胞自发增殖反应、刀豆蛋白A(ConA)和脂多糖(LPS)诱导的脾细胞增殖反应与正常对照组比较均明显降低,[3H]TdR掺入值由正常对照组的6115±441,19432±1778和(23345±7296)cpm分别降低为2741±340,9210±1387和(3983±263)cpm;与模型组比较,LW-AFC0.8g·kg-1对脾淋巴细胞自发增殖反应有明显的改善作用;LW浓缩丸和LW-AFC对ConA诱导的脾细胞增殖反应均具有明显的促进作用,[3H]TdR掺入值分别为13996±5161,27550±2356,15427±1444和(27333±1701)cpm;对LPS诱导的脾细胞增殖降低无改善作用,甚至低于CTX模型组(P<0.01)。模型组小鼠NK细胞杀伤活性由正常对照组的(39.5±0.5)%降低为(37.0±1.0)%,LW和LW-AFC明显促进小鼠NK细胞杀伤活性,杀伤率分别为(40.9±0.6)%,(39.7±0.8)%,(42.4±0.5)%和(39.8±0.9)%。与正常对照组比较,模型组小鼠脾脏CD3+,CD4+CD8-和CD4-CD8+T细胞百分率明显增加,CD4+/CD8+比值无明显变化;LW浓缩丸和LW-AFC可使CTX导致的升高的CD3+,CD4+CD8-和CD4-CD8+T细胞百分率明显降低,并可明显降低CD4+/CD8+比值。结论 LW-AFC对CTX所致小鼠免疫功能低下具有一定的改善作用。     

宫颈癌患者外周血T淋巴细胞及NK细胞的检测及临床意义

目的 探讨宫颈癌患者外周血T淋巴细胞和NK细胞活性的临床意义.方法 采用流式细胞仪测定宫颈癌患者外周血T淋巴细胞亚群和NK细胞的活性,并与正常人作对照.结果 宫颈癌患者外周血CD+3,CD+3+,NK细胞数量及CD+4/CD+8比值较正常对照组均明显下降(P<0.05),而CD+8细胞水平显著升高.外周血T淋巴细胞亚群和NK细胞数量的改变与宫颈癌临床病理指标有关,分期越晚,CD+3细胞、CD+3细胞、CD+3/CD+8细胞比值及NK细胞数量越低,CD+8细胞水平越高.结论 宫颈癌患者细胞免疫功能降低,导致肿瘤的发生、发展,应用流式细胞仪检测外周血T淋巴细胞和NK细胞等指标可用于宫颈癌患者的免疫状态监测,对宫颈癌患者的免疫辅助治疗提供依据.     

宫颈癌患者外周血T淋巴细胞及NK细胞的检测及临床意义

目的 探讨宫颈癌患者外周血T淋巴细胞和NK细胞的活性及临床意义.方法 采用流式细胞仪测定45乳腺癌患者外周血T淋巴细胞和NK细胞的活性,以20例正常人同期监测结果作对照.结果 宫颈癌患者外周血CD+3,CD+4,NK细胞数量及CD+4/CD+8比值较正常对照组均明显下降(P＜0.05),而CD+8细胞水平显著升高.外周血T淋巴细胞亚群和NK细胞数量的改变与宫颈癌临床病理指标有关,分期越晚,CD+3细胞、CD+4细胞、CD+4/CD+8细胞比值及NK细胞数量越低,CD+8细胞水平越高;I、II期宫颈癌患者与III、IV期患者之间有显著差异(P＜0.05).结论 宫颈癌患者细胞免疫功能低下,且临床病理分期越晚,其免疫功能越低,检测T淋巴细胞亚群、NK细胞可用于宫颈癌患者的免疫监测.     

不明复发性流产封闭抗体及淋巴细胞免疫表型检测对淋巴细胞主动免疫治疗效果的评估价值

目的 探讨不明复发性流产(URSA)封闭抗体(BA)及淋巴细胞免疫表型检测对淋巴细胞主动免疫治疗效果的评估价值.方法 选择100例接受淋巴细胞主动免疫治疗的URSA患者,治疗前后分别采用ELISE法检测外周血BA情况,采用流式细胞术检测外周血T淋巴细胞、B淋巴细胞、Treg细胞及NK细胞免疫表型,观察妊娠结局.结果 治疗前BA阳性率差异有统计学意义(P<0.05).治疗后BA阴性者与BA阳性者的妊娠成功率差异有统计学意义(P<0.05).治疗后CD3+T、CD4+T、CD3-CD56+NK明显变化(P<0.05),CD8+T、CD4+T/CD8+T、CD3+THLA-DR+/CD3+、CD8+THLA-DR+/CD8+、CD4+T CD25+ CD127dimTreg、CD19+B、CD5+CD19+B、CD5-CD19+B、CD3+CD56+NK、CD56+CD69+NK无明显变化(P>0.05).妊娠成功者与失败者的CD3+T、CD4+T、CD4+THLA-DR+/CD4+、CD3-CD56+NK比较差异有统计学意义(P<0.05).结论 淋巴细胞主动免疫治疗能够提高BA阳性率,改善外周血T细胞、NK细胞的比例,BA和淋巴细胞免疫表型可作为评估主动免疫疗效的指标.     

当归多糖硫酸酯抗小鼠L6565逆转录病毒的作用

目的　观察当归多糖硫酸酯(APS)抗小鼠L65 65逆转录病毒的作用,以探讨其治疗艾滋病的可能性。方法　用小鼠L65 65病毒感染出生2 4h内的乳鼠建立模型;以RT PCR法测定血浆病毒载量;流式细胞术测定CD4 +,CD8+细胞的百分数,计算CD4 +/CD8+细胞的比值;镜检计数外周血白细胞、红细胞和骨髓有核细胞数;测定脾脏、胸腺的重量并计算脏体系数。结果　与正常对照组相比,模型组小鼠血浆病毒载量较高( 4 1 65±1 98) ,CD4 +细胞百分率( 1 8.2±4 .9)、红细胞、骨髓有核细胞数及胸腺系数显著降低,而白细胞数和脾脏系数显著升高(P <0 .0 5或P <0 .0 1 ,n =1 0 ) ;与模型组相比,APS在1 0和3 0mg·kg- 1 剂量下血浆病毒载量显著降低( 3 3 2 8±1 0 3和3 3 94±1 71 ) ,CD4 +细胞百分率( 5 2 .6±5 .8和5 7.0±5 .5 ) ,CD4 +/CD8+比值( 3 .6±0 .6和3 .4±0 .5 )、红细胞、骨髓有核细胞数及胸腺系数显著升高,白细胞数和脾脏系数显著降低(P <0 .0 5或P <0 .0 1 ,n =1 0 )。结论　APS不仅具有一定的抗病毒作用,而且对免疫功能有一定的调节作用,提示其对艾滋病可能有一定的治疗作用     

慢性乙型肝炎患者外周血淋巴细胞亚群及NK细胞检测的临床意义

目的 研究慢性乙型肝炎及肝炎肝硬化患者外周血淋巴细胞亚群及自然杀伤(NK)细胞的变化.方法 应用流式细胞术检测对照组、慢性乙型肝炎(慢乙肝组)及肝炎肝硬化(肝硬化组)患者外周血淋巴细胞亚群CD3+、CD3+CD4+、CD3+CD18+、NK细胞、CD19+(B细胞)表达百分比.结果 慢乙肝组患者CD3+CD4+及NK细胞百分比降低,B细胞百分比增加,与对照组相比差异有统计学意义.肝硬化组患者CD3+、CD3+CD4+、CD3+CD8+及NK细胞百分比均明显下降,B细胞百分比及CD4+/CD8+增高,与对照组相比差异有统计学意义.结论 慢性乙型肝炎患者体内存在体液免疫和细胞免疫功能紊乱.外周血淋巴细胞免疫分型检测对于了解患者免疫状态,判别病情及预后有一定临床意义.     

西洋参茎叶皂苷对CPHD患者细胞免疫功能的影响

目的　通过观察西洋参茎叶皂苷对慢性肺原性心脏病 (CPHD)患者细胞免疫功能的影响 ,探讨CPHD患者的发病与机体免疫的关系。方法　采用流式细胞术检测 2 0例CPHD患者外周血T淋巴细胞亚群和NK(CD3-/CD16 +5 6 + )细胞 ;RT PCR方法检测IL 2、IFNγmRNA的表达。结果　CPHD患者CD3+ 、CD4 + 、和CD4 /CD8比值明显低于对照组并差异有显著性 ,而CD8+ 细胞高于对照组 (P <0 0 1)。PQS治疗后CD3+ 、CD4 + 、CD3-/CD16 +5 6 + 细胞和CD4 /CD8比值都升高 ,其中CD4 + 、CD3+ 细胞与治疗前比较呈显著性差异 (P <0 0 5 ) ,而CD8+ 细胞与治疗前比较降低 (P <0 0 5 )。西洋参茎叶皂苷 (PQS)能促进T细胞分泌细胞因子IL 2、IFNγmRNA的表达。结论　当CPHD患者免疫功能低下时 ,选用PQS治疗能够提高机体的细胞免疫功能     

淫羊藿总黄酮对环磷酰胺致免疫低下小鼠的免疫调节作用

目的:研究淫羊藿总黄酮(TFE)对环磷酰胺致免疫低下小鼠的免疫调节作用.方法:Balb/C小鼠40只,雌雄各半,随机分为空白组、模型组、TFE低、中、高剂量组,每组8只.空白组腹腔注射生理盐水,其余各组连续5 d腹腔注射环磷酰胺建立免疫低下模型.空白组和模型组灌胃生理盐水,TFE低、中、高剂量组分别按200、400及800 mg/kg剂量灌胃TFE.给药35 d后测定各组体质量、脾质量、脾细胞绝对数量、相对数量、骨髓有核细胞数量及脾脏中CD3+、CD4+、CD8+、CD19+、NK细胞数量.结果:造模结束后,模型组脾细胞绝对数量、相对数量、骨髓有核细胞数量及脾脏中CD3+、CD4+、CD8+、CD19+、NK细胞的数量低于空白组;TFE低剂量组脾脏中CD3+、CD4+、CD8+、NK细胞及骨髓有核细胞数量高于模型组;TFE中剂量组和高剂量组的脾细胞绝对数量、骨髓有核细胞数量及脾脏中CD3+、CD8+、CD19+、NK细胞数量高于模型组;而且TFE高剂量组睥细胞相对数量和CD4+也高于模型组;差异均有统计学意义(P＜0.01或P＜0.05).结论:TFE可显著增强环磷酰胺所致免疫低下小鼠的免疫功能,其部分机制在于增加脾细胞绝对数量和相对数量,调节脾脏中T细胞亚群、B淋巴细胞、NK细胞数量,并促进骨髓有核细胞的增殖.     

严重急性呼吸道综合征患者外周血T淋巴细胞亚群的变化及临床意义

目的　了解严重急性呼吸道综合征 (SARS)患者外周血 T淋巴细胞亚群的变化。方法　采用免疫细胞化学的方法对确诊为 SARS的 6 0例患者及 6 2例健康体检者外周血 T淋巴细胞亚群进行检测。结果　健康体检者外周血 CD3+、CD4 +、CD8+分别为 (6 4± 8) % ,(4 4± 6 ) % ,(2 7± 7) % ,发病期 SARS患者分别为 (5 7±13) % ,(39± 10 ) % ,(2 8± 10 ) % ,CD3+ 、CD4 + 均有不同程度的下降 ,33例恢复期 SARS患者 CD3+ 、CD4 + 多数恢复正常。结论　 SARS患者在发病期细胞免疫有损伤 ,短期使用激素和胸腺肽对细胞免疫影响不明显     

肌肉注射白介素-10质粒DNA预防小鼠自身免疫性糖尿病

目的:研究编码白介素-10(IL-10)质粒DNA对由多次、低剂量链脲佐菌素(STZ)诱发的自身免疫性糖尿病小鼠的作用。方法:连续5天将STZ(每次40 mg/kg)腹腔注射入小鼠体内,于第1、14天将100 mg表达人IL-10-pcDNA3质粒(IL-10处理组)或pcDNA3质粒(对照组)注射入骨骼肌内。测定小鼠血糖水平。第28天处死小鼠,检测小鼠血清干扰素-γ(IFN-γ)水平、胰腺IL 1β和TNF-α mRNA表达,测定脾CD4~+和CD8~+淋巴细胞的数量,同时进行胰腺组织学检查。结果:IL-10质粒DNA注射后,骨骼肌有IL-10 mRNA的持久表达,血浆IL-10水平明显升高,而且对迟发性超敏反应具抑制作用。IL-10处理组,在14、21和28天小鼠血糖显著降低,在21、28天时糖尿病发病率分别为33.3％和40.0％,显著低于对照组(P<0.05);胰腺IL-1β和TNF-αmRNA表达、血清IFN-γ水平,以及脾CD4~+和CD8~+淋巴细胞数量均低于对照组,胰岛炎症程度也明显轻于对照组(P<0.01)。结论:IL-10基因治疗能减轻实验性自身免疫性糖尿病小鼠 的胰岛炎症,降低糖尿病发生的机率。     

弓形体RH株抗原基因SAG1的扩增克隆及鉴定

目的 :体外扩增弓形体主要表面抗原 SAG1基因 ,构建 pc DNA3- SAG1真核表达质粒 ,为研制弓形体疫苗奠定基础。方法 :采用 PCR技术 ,自行设计一对寡核酸引物 (P1,P2 ) ,从弓形体 RH株基因组 DNA中特异扩增出编码SAG1抗原的基因片段。扩增的目的片段经纯化后用 Eco R1和 Hind 双酶切后 ,克隆到真核表达质粒 pc DNA3中 ,转化入大肠杆菌 TG1,用氨苄青霉素和 PCR初筛 ,将 PCR扩增阳性的重组子分别用 Sac1单酶切、Eco R1和 Hind 双酶切鉴定。结果成功地构建真核型表达质粒 pc DNA 3- SAG1,从而为进一步 SAG1重组抗原的体外表达创造有利条件。结果 :从 RH株基因组 DNA中特异扩增出编码 SAG1的全基因序列 ,扩增目的基因片段大小与预期长度(10 2 5 bp) ,相符 ;将分离、纯化的目的基因片段 SAG1插入 pc DNA3质粒 Hind 和 Eco R1位点 ,构建重组质粒pc DNA3- SAG1。结论 :成功构建重组质粒 pc DNA3- SAG1     

弓形虫SAG1基因在HeLa细胞表达的研究

目的 :研究弓形虫 SAG1基因在 He L a细胞中的表达 ,为研制弓形虫疫苗奠定基础。方法 :采用磷酸钙 -DNA共沉淀转化法将重组质粒 pc DNA3- SAG1导入 He L a细胞 ,用 G418进行选择培养 ,筛选出表达阳性的细胞克隆 ,再通过培养和加压 ,建立稳定分泌 SAG1抗原的阳性 He L a细胞克隆株 ,分离表达产物 ,进行 SDS- PAGE、Western blot分析。结果 :采用钙沉淀法成功地将重组质粒 SAG1导入 He L a细胞 ,通过 G418选择和加压培养 ,获得稳定分泌 SAG1抗原的阳性 He L a细胞 ,表达的蛋白经 SDS- PAGE、Western blot分析 ,显示其分子量 30 k Da蛋白 ,与理论值相符。结论 :成功构建重组质粒 pc DNA3- SAG1,建立稳定分泌 SAG1抗原的阳性 He L a细胞克隆株     

白细胞介素-2对狂犬疫苗细胞免疫应答增强作用的研究

为证实白细胞介素－2（IL－2）能否作为佐剂增强狂犬病毒灭活疫苗在小鼠体内的免疫应答，将CBA／J（H－2K）纯系鼠分为3组，分别注射IL－2＋狂犬病毒灭活疫苗、狂犬病毒灭活疫苗、生理盐水（正常对照）。结果表明，IL－2能够提高CBA／J（H－2k）纯系鼠对狂犬病毒灭活疫苗的免疫反应，加入IL－2后，小鼠体内NK细胞杀伤活性显著提高，达51，3±6．7％（P＜0．01），特异性细胞毒性T细胞（CTL）活性的二次反应达29．1±3．0％（P＜0.01）。     

单纯疱疹病毒Ⅱ型gD糖蛋白核酸疫苗的构建及免疫观察

目的：构建用于防治单纯疱疹病毒Ⅱ型（HSV-Ⅱ）引起的生殖器疱疹的DNA疫苗。并探讨其免疫保护作用。方法：利用PCR法从HSV-Ⅱ Say株中扩增出gD糖蛋白基因的全部编码序列，将其插入pcDNA3中，构建HSV-Ⅱ gD核酸疫苗，用PCR法、酶切法和测序法进行鉴定；将重组质粒转染COS-7细胞，用原位ELISA检测表达产物；对BALB／c小鼠进行肌肉免疫，用微量细胞中和试验、ELISA、脾T淋巴细胞增殖反应和病毒攻击试验检测免疫效果。结果：构建的HSV-Ⅱ gD核酸疫苗具有良好的免疫原性，对小鼠具有保护作用。结论：本实验成功构建出了具有免疫防御效应的HSV-Ⅱ gD核酸疫苗。     

CpG ODN纳米粒增强免疫抑制小鼠对重组乙肝疫苗的免疫应答

目的：探讨CpG ODN壳聚糖纳米粒联合重组乙肝疫苗对免疫抑制小鼠的免疫增强作用。方法：选月环磷酰胺建立免疫抑制模型小鼠。将乙肝疫苗单独或和CpG ODN或CpG ODN纳米粒经后腿胫骨前肌注射到小鼠体内，ELISA方法检测抗HBsAg IgG抗体、IL-12水平；流式细胞仪检测外周血CD4^＋、CD8^＋T淋巴细胞亚群。结果：CpG ODN纳米粒联合疫苗组的CD4^＋细胞百分数，IL-12水平及抗HBsAg IgG抗体的含量显著高于CpG ODN联合疫苗组（P〈0．05）。结论：包裹在壳聚糖纳米粒中的CpG ODN较相同剂量的CpG ODN更能增强免疫抑制小鼠对乙肝疫苗的免疫应答。     

PI3K-Akt-mTOR信号通路对Foxp3基因表达的影响

目的研究PI3K-Akt-mTOR信号通路对Foxp3基因表达的影响。方法将SPF级昆明系小鼠60只随机分为对照组(A)和实验组(B、C、D),B、C、D三组分别灌胃雷帕霉素0.2、0.4、0.6 mg.d-1,A组每天予以无菌水灌胃,共3周。3周后,无菌条件下心脏采血,EDTA抗凝,分离脾脏,制备单细胞悬液,采用流式细胞仪检测小鼠外周血和脾脏中CD4+CD25+调节性T细胞水平(CD4+CD25+Treg细胞占CD4+T细胞的百分比),RT-PCR检测小鼠脾细胞Foxp3mRNA的表达,免疫组织化学SP法染色观察小鼠脾脏中p-mTOR蛋白表达的变化,并利用计算机图像分析技术测量各实验组及对照组中p-mTOR蛋白表达的平均光密度。结果 Foxp3 mRNA在实验组(B、C、D)小鼠脾脏中表达的程度分别为(0.4853±0.0574、0.7886±0.1085、0.9639±0.2015),明显高于对照组A(0.1345±0.0271)(P<0.05);实验组(B、C、D)小鼠脾脏中p-mTOR蛋白表达的平均光密度分别为(0.2326±0.0431、0.1156±0.0223、0.0556±0.0041),明显低于对照组A(0.4223±0.0534)(P<0.05);两指标经pearson相关分析,小鼠脾脏中Foxp3mRNA的表达与p-mTOR蛋白表达呈负相关。结论抑制PI3K-Akt-mTOR信号通路会促使Foxp3的表达增强;PI3K-Akt-mTOR信号通路的激活程度与Foxp3的表达程度呈负相关。     

含CpG免疫刺激序列的乙型肝炎DNA疫苗的体液免疫效果

目的构建含CpG免疫刺激序列的乙型肝炎DNA疫苗 ,评价其体液免疫效果。方法通过PCR方法从重组真核表达质粒pcDNA S2 S扩增出含CpG免疫刺激序列的乙型肝炎病毒 (HBV)表面抗原中蛋白 (preS2 +S)基因片段 ,将其亚克隆于含卡那霉素抗性基因的pVAX1真核质粒表达载体中 ,构建出重组真核表达质粒pVAX S2 S ,并按不同剂量一次性肌肉注射免疫BALB c小鼠。结果pVAX S2 S高、中、低 3个剂量组均能在 2周诱导抗 HBs产生 ,抗体效价随时间延长而增加。血清抗体水平比较 ,高剂量组 [(131.2 7± 2 5 .4 9)mIU ml]较中剂量组 [(5 6 .17± 12 .0 6 )mIU ml]、低剂量组 [(2 1.38± 7.73)mIU ml]高 ,差异均具非常显著性 (P <0 .0 1) ,以后第 4周高、中剂量组间差异依然非常显著 (P <0 .0 1) ,在第 8周高、中剂量间差别缩小 ,但两者较低剂量组差异均具非常显著性 (P <0 .0 1)。结论pVAX S2 S能有效诱导正常小鼠产生体液免疫应答