骨髓间充质干细胞减轻体外扩增的脐血造血干细胞衰老的作用

目的 探讨骨髓间充质干细胞(MSC)对脐血造血干细胞体外扩增及抗细胞衰老的作用.方法 从新鲜脐血中分离出CD34+细胞,分别接种在含或不含MSC及细胞因子的培养体系中,取培养10d后的造血干细胞,分别用于细胞计数,集落分析,流式细胞仪检测表面标记,并对培养后的细胞进行β-半乳糖苷酶活性检测,采用实时定量聚合酶链反应(PCR)检测衰老相关基因p16INK4amRNA的表达.结果 体外培养10d后,MSC组、细胞因子组及MSC+细胞因子组对脐血总有核细胞(TNC)、CD34+细胞的体外扩增及克隆形成能力均有支持作用,以MSC+细胞因子组最为明显(P＜0.05),其扩增倍数分别达到(45.3±6.8)倍、(38.4±5.8)倍及(50.2±4.2)倍,但衰老细胞比例及p16INK4amRNA表达倍数则以MSC组最低,MSC+细胞因子组次之,细胞因子组两项指标均为最高(P＜0.05).结论 MSC能更好保护体外扩增的脐血造血干细胞,减少细胞衰老的发生,MSC+细胞因子是有效扩增脐血造血干细胞并保持细胞干性的更理想方法.     

脐血单个核细胞体外扩增的实验研究

目的 探讨含有细胞因子的无血清培养基对脐血单个核细胞(MNC)体外培养后的扩增情况和用于移植的安全性.方法 从新鲜脐血中分离出的MNC,在含细胞因子的无血清培养体系中培养.分别将培养前和培养第10天时的造血细胞进行细胞计数、细胞活力分析、集落分析、流式细胞仪检测表面标记、彗星试验分析DNA的损伤情况、无菌性分析及移植至NOD/SCID小鼠体内等项研究.结果 经过体外短期培养,脐血中MNC、CD34+、CD133+、CD34+CXCR4+及CD34+ VLA-4+细胞扩增倍数均比培养前增高(P<0.05);半固体培养基可支持多系集落的生长;培养前和培养第10天时脐血细胞DNA损伤率均低于5%;无菌性分析提示细胞未受污染.将体外扩增后的脐血造血细胞移植入NOD/SCID小鼠体内,与新鲜脐血移植相比,小鼠的存活时间及植入能力的差异均无统计学意义(P>0.05).结论 脐血造血细胞体外扩增是解决脐血造血细胞数量不足的有效方法.脐血造血细胞经短期培养能为造血干细胞移植提供安全而具植入能力的造血细胞.     

基质细胞联合细胞因子对脐血CD133阳性细胞体外扩增和粘附分子表达的影响

CD133是新近发现的造血干细胞表面标志，众多的实验表明，脐血CD133^＋细胞能在体外得以扩增，我们选用脐血单个核细胞（MNC）作为培养的起始细胞，应用实验室已经建立的胚胎骨髓基质细胞联合细胞因子的造血细胞体外培养体系，研究脐血MNC中CD133^＋细胞在此培养体系的扩增效果，并检测CD133^＋细胞表面粘附分子CD44、CD62L的表达率，评估扩增后的脐血CD133^＋细胞的归巢能力。     

人脐血单个核细胞体外扩增后植入NOD/SCID小鼠重建多系造血

目的探讨人脐血单个核细胞（MNC）体外扩增后植入能力的改变，以及对NOD／SCID小鼠造血重建的影响。方法采用不同细胞因子组合对人脐血MNC进行短期无血清培养扩增，比较扩增后的效果及细胞凋亡的变化；将扩增6d后的人脐血MNC植入经半致死剂量照射的NOD／SCID小鼠体内，观察小鼠6周后的存活率和造血重建情况。结果人脐血MNC在干细胞因子（SCF）、酪氨酸激酶受体3配基（FL）、白细胞介素6（IL-6）和白细胞介素3（IL-3）细胞因子共同作用下，培养6～11）d获得最佳扩增效果，同时细胞表面膜联蛋白V（Annxin V）的表达明显减少；移植6周后有55．6％的小鼠存活，存活小鼠的骨髓、脾和胸腺细胞中均能检测出人类CD45、CD34、CD33、CD3和CDl9抗原，外周血提取的DNA可检测出人特异的Cart—Ⅰ基因和Alu基因。结论SCF＋FL＋IL-6＋IL-3细胞因子协同作用能有效扩增人脐血MNC，MNC扩增6d后可成功植入N（）D／SCID小鼠体内，并帮助小鼠重建多系造血。     

由脐血单个核细胞和富集的CD34+细胞扩增的造血干/祖细胞的生理功能比较

目的 探讨由脐血单个核细胞(MNC)和富集的CD34+细胞起始扩增所得的造血干/祖细胞在体内植入及造血重建的能力.方法 从人脐血中分离出MNC和CD34+细胞,在体外扩增7 d.将非肥胖糖尿病型重症联合免疫缺陷型(NOD/SCID)小鼠分为四组,在接受亚致死剂量铯源照射后,进行细胞移植,实验A组接受由MNC培养得到的CD34+细胞和CD34-细胞;实验B组接受由富集的CD34+细胞培养得到的CD34+细胞和CD34-细胞;阳性对照组接受从脐血新鲜分离的CD34+细胞和CD34-细胞;阴性对照组不接受细胞移植,仅输注相同体积的IMDM培养基.6周后处死存活的小鼠,取其骨髓、脾脏和外周血细胞,分别进行细胞表型分析、集落和人特异性基因的检测.结果 经过体外扩增,以富集的CD34+细胞起始培养者的细胞总扩增倍数为39.8倍,远高于以MNC为起始细胞者的1.88倍.移植6周后,所有接受细胞移植的小鼠均存活,存活小鼠的骨髓和脾脏细胞中均能检测到人源细胞(CD45+细胞)及人源的各系血细胞,实验A组各类细胞的含量稍高于实验B组,且接受细胞移植小鼠的骨髓和脾脏细胞中可检测出人特异的Alu序列.结论 与从脐血中新鲜分离的细胞相比,扩增后的造血干/祖细胞的体内植入能力有所下降,以MNC起始扩增的造血干/祖细胞体内植入能力优于以富集的CD34+细胞起始扩增者,但二者体内造血重建能力的差异不显著.     

人脐血造血干/祖细胞的磁力搅拌悬浮培养及移植实验

目的 探讨磁搅拌大规模培养体系对人脐血造血祖细胞的扩增效果以及扩增的人造血祖细胞植入动物体内后的造血重建情况.方法 从新鲜抗凝脐血中分离出单个核细胞(MNC),以添加干细胞因子、酪氨酸激酶受体3配基及血小板生成素的无血清培养体系进行培养.静态扩增组的细胞置于T25培养瓶中培养,磁搅拌悬浮扩增组(磁搅拌扩增组)的细胞采用Celstir装置进行培养,培养体系为50～100 ml.培养7 d后进行细胞计数、集落培养检测和细胞表面分子表达的测定.以不进行培养者为对照组.非肥胖糖尿病重症联合免疫缺陷(NOD/SCID)小鼠在接受2.5 Gy的亚致死剂量X射线照射后分别从尾静脉输入上述静态扩增组、磁搅拌扩增组和对照组的MNC(5×106个),另设不移植的空白对照组.观察小鼠的存活情况,6周后处死存活小鼠,检测骨髓细胞中CD34+细胞、CD3+细胞、CD19+细胞、CD33+细胞及CD45+细胞的含量以及人特异的Cart-Ⅰ和Alu基因的表达.结果 经过7天的培养,磁搅拌扩增组的造血祖细胞扩增倍数为(2.8±0.45)倍,明显高于静态扩增组的(2.1±0.48)倍(P<0.01).磁搅拌扩增组形成的红系集落、粒-巨噬细胞集落数均明显高于静态扩增组(P<0.05).静态扩增组扩增后的CD34+细胞、CD34+CD38-细胞和CD133+细胞含量均高于磁搅拌扩增组(P<0.05),而CD184+细胞和CD62L+细胞含量低于磁搅拌扩增组(P<0.01).移植后6周,对照组、静态扩增组和磁搅拌扩增组分别有3、4、5只小鼠存活,三组间两两比较,6周存活率的差异无统计学意义(P>0.05).存活6周的小鼠,其骨髓中能检人特异性CD34+细胞,以及CD3+细胞、CD19+细胞、CD33+细胞及CD45+细胞,也检测到人Alu基因和Cart-Ⅰ基因的表达.结论 磁搅拌培养能大规模扩增脐带血造血祖细胞,扩增的细胞能植入x射线照射的NOD/SCID小鼠,并重建其多系造血.     

人脐血造血干/祖细胞的生物反应器大规模扩增及移植实验

目的 利用生物反应器大规模扩增人脐血造血干/祖细胞,并通过动物移植实验检验该方法的有效性.方法 采集抗凝脐血10份,分离出单个核细胞(MNC),分别进行生物反应器扩增培养和静态扩增培养.检测扩增前后细胞表面CD34、CD38、CD133、CD184和CD62L分子的表达,并进行造血干/祖细胞集落的培养.取非肥胖糖尿病重症联合免疫缺陷小鼠,以X射线照射后,分为4组,其中MNC组小鼠注射未经扩增培养的MNC;静态扩增组小鼠注射经过静态扩增培养的细胞;反应器扩增组小鼠注射经过生物反应器扩增培养的细胞;空白对照组小鼠注射生理盐水.移植后6周处死存活小鼠,收集骨髓细胞,检测其中CD45+、CD3+、CD19+和CD33+细胞的含量以及人特异的Cart-Ⅰ和Alu基因的表达.结果 生物反应器扩增前MNC为(1.2～2.8)×108个,扩增后为(3.7～12.6)×108个,扩增后的细胞数明显高于静态扩增培养者(P<0.01).经生物反应器扩增后所形成的红系集落形成单位、粒-巨噬细胞集落形成单位数明显高于经静态扩增者(P<0.05).移植6周后,空白对照组小鼠均死亡,MNC组存活率为35%,静态扩增组存活率为30%,反应器扩增组存活率为62.9%,后者明显高于前二者(P<0.05).各组存活小鼠骨髓细胞中均检测到Alu基因和Cart-Ⅰ基因的表达以及人源CD33+、CD45+、CD3+及CD19+细胞.结论 利用生物反应器可大规模扩增人脐血造血干/祖细胞,所得细胞能植入小鼠体内,并能获得造血功能重建.     

骨髓单个核细胞和骨髓源内皮祖细胞移植促进血流重建的比较研究

目的 比较骨髓单个核细胞(MNCs)和骨髓源内皮祖细胞(EPCs)移植促进血流重建的效果,探讨非内皮祖细胞在血流重建中的作用.方法 获取Lewis大鼠骨髓MNCs,部分MNCs在体外诱导分化为EPCs.采用Lewis大鼠建立单侧后肢缺血模型.建模后3 d,将模型鼠随机分为3组:(1)对照组(n=6),将0.8 mL D-Hank's液注入对照组大鼠缺血侧后肢;(2)MNC组(n=6),将8×10~6个骨髓MNC植入MNC组大鼠缺血侧后肢;(3)EPC组(n=6),将体外培养的8 × 10~6个EPC植入EPC组大鼠缺血侧后肢.细胞移植后3周行大鼠后肢动脉造影,检测缺血侧后肢侧支血管数;切取缺血侧后肢腓肠肌,分别行CD31和α-SMA免疫组化染色,计算毛细血管密度和小动脉密度.结果 MNC组毛细血管密度与EPC组差异无统计学意义[(31.67 ± 7.87)个/HP vs.(32.83±5.38)个/HP,P＞0.05].而均高于对照组(19.67 ± 4.80个/HP)(P＜0.05);MNC组侧支血管数与EPC组差异无统计学意义[(4.17±0.75)个vs.(4.50 4±1.38)个,P＞0.05],但均高于对照组[(2.50 ± 1.5)个](P＜0.05);MNC组小动脉密度与EPC组差异无统计学意义[(4.83 ± 1.47)个vs.(5.50 ± 2.35)个,P＞0.05],亦均高于对照组[(2.17±0.98)个](P＜0.05).结论 在骨髓干细胞移植治疗肢体缺血性疾病中,非内皮祖细胞在血流重建中所起的作用与EPC相似.     

骨髓c-Kit+Lin-细胞移植改善肝纤维化的实验研究

目的:探讨骨髓c-Kit+Lin-(CD117)细胞在体外扩增后移植治疗小鼠肝纤维化的效果。方法:采用免疫磁珠分选法分离小鼠骨髓CD117细胞,将细胞在添加了肝细胞生长因子(HGF),干细胞因子(SCF),FLt-3配基(FL),促血小板生成素(TPO),白血病抑制因子(LIF)的无血清培养基中培养扩增;制备同种小鼠的酒精性肝纤维化模型,成模后的小鼠分别尾静脉注射体外扩增的CD117细胞(移植组)或等体积缓冲液(模型组),同时以正常小鼠为对照(正常组),30 d后观察各组小鼠的肝脏病理改变以及肝功能与肝纤维化指标。结果:添加上述细胞因子的无血清培养基能有效扩增CD117细胞;正常组小鼠肝脏无病理改变,模型组呈明显的肝细胞变性和纤维化改变,移植组较模型组的病变程度明显减轻;与正常组比较,模型组和移植组均有不同程度的血清谷丙转氨酶(ALT),谷草转氨酶(AST),透明质酸(HA),层黏连蛋白(LN)升高和清蛋白(ALB)降低,但移植组上述指标改变较模型组明显减轻,差异均有统计学意义(均P<0.05)。结论:合适剂量的HGF+SCF+FL+TPO+LIF细胞因子组合能有效扩增CD117细胞;CD117细胞移植对小鼠肝纤维化有治疗作用。     

小鼠骨髓源性树突状细胞的体外诱导培养及功能分析

目的:建立小鼠骨髓源性树突状细胞(DCs)体外培养和扩增方法,为以DCs为靶点的免疫治疗研究提供基础。方法:从C57BL/6小鼠股骨和胫骨中提取骨髓细胞,以含重组小鼠粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF,400U/ml)和IL-4(200U/ml)的RPMI 1640(含10%FBS)进行诱导培养,于培养第4天加入脂多糖(LPS)继续培养2d。利用倒置相差显微镜和透射电子显微镜观察细胞生长状态和超微结构,流式细胞术鉴定培养第6天时DCs纯度及免疫表型,流式细胞微球捕获芯片技术检测第2、4、6天培养上清中细胞因子IL-6、IL-10、巨噬细胞趋化因子-1(MCP-1)、干扰素-1(IFN-1)、TNF-α、IL-12p70含量。结果:重组小鼠GM-CSF和IL-4诱导培养小鼠骨髓细胞4d,加入脂多糖(LPS)继续培养2d,近90%细胞高表达DCs特征性标志物CD11c,高表达抗原提呈分子MHC-Ⅱ和共刺激分子CD86、CD80,具有典型的树突状形态学特征和分泌炎症性细胞因子IL-6、IL-10、MCP-1、TNF-α和IL-12p70的功能。结论:小鼠骨髓细胞以重组小鼠GM-CSF和IL-4体外诱导培养的DCs具有较高的纯度,保持了体内的形态学、免疫表型及功能特征。     

脐血CD34+细胞体外诱导肝样细胞的研究

目的 探讨通过细胞因子及其组合体外诱导脐血CD34^＋细胞转分化成肝样细胞的效果。方法 采用密度梯度离心法分离脐血单个核细胞（mononuclear cell，MNC），从MNC中获得富集CD34^＋细胞。选用人白血病抑制因子、制瘤素M、bFGF、aFGF、肝细胞生长因子、EGF及干细胞生长因子7种细胞因子，浓度分别为10、10、10、10、20、20和50ng／mL，设计了49种细胞因子组合，分别采用这些细胞因子组合体外培养脐血CD34^＋细胞，培养周期为28d。以新鲜脐血CD34^＋细胞作为对照。每7天检测诱导后细胞中细胞角蛋白19（cytokemtin19，CK-19）、CK-18、谷氨酰胺合成酶（glutamme synthetase，GS）、人血清白蛋白（albumin，ALB）以及甲胎蛋白（a-fetoprotem，AFP）的mRNA转录情况，并应用免疫荧光法、过碘酸-雪夫（periodic acid-schiff，PAS）染色与吲哚菁绿（indocyanine green，ICG）染色法检测细胞分泌ALB、合成糖原以及解毒能力，以此判断是否存在脐血CD34^＋细胞体外向肝样细胞的转分化。结果 在经细胞因子诱导后的CD34^＋细胞中均可检测到人肝细胞所能表达的CK-19、CK-18和GS的mRNA条带，未能检测出肝细胞特征性的ALB与AFP的mRNA条带；而新鲜脐血CD34^＋细胞中以上5种蛋白的mRNA均未能检出。免疫荧光染色观察示诱导前后的细胞中均未能检测到ALB的表达，且均不能有效吞噬ICG染料。PAS反应检测结果显示，经细胞因子诱导后的细胞紫红色糖原沉积区域较新鲜脐血CD34^＋细胞增大，出现紫红色区域的细胞增多。结论 脐血CD34^＋细胞体外经细胞因子组合诱导后，虽有肝细胞相关蛋白mRNA表达，但未能转分化为肝样细胞。     

CD34+细胞在干细胞旁分泌下向内皮细胞分化的研究

目的 探讨人脐血CD34+细胞在脐带间充质干细胞(UC-MSCs)旁分泌作用下向内皮细胞诱导分化的可行性.方法 收集20份脐血,体积(103.80±19.77)ml.免疫磁珠(MACS)分选CD34+细胞;取脐带用消化贴壁法获得UC-MSC.流式鉴定干细胞表型.实验分单纯培养组、诱导组、共培养组.结果 流式鉴定CD34+细胞纯度(95.02±3.81)%.培养14 d流式检测共培养组表达CD31、CD144、VWF分别为(65.43±5.61)%、(54.40±4.13)%、(47.53±3.96)%(与单纯培养组比较P＜0.05),部分表达CD34,阴性表达CD45,这与诱导组及成熟脐静脉内皮细胞表达率一致.结论 UC-MSCs旁分泌作用与外源性细胞因子都具有促分化作用,均能使脐血CD34+细胞向内皮细胞分化.

Abstract：

Objective To study whether the paracrine action of umbilical cord-derived mesenchymal stem cells (UC-MSC) can induce differentiation of human umbilical cord blood-derived CD34+ cells into endothelial cells in vitro. Methods The 20 fresh umbilical cord blood samples were collected with volume of (103. 80 ± 19. 77) ml. CD34+ cells were isolated from the mononuclear cells by magnetic activated cell sorting system (MACS) , and mesenchymal stem cells (MSCs) were isolated from umbilical cord by collagenase and trypsin digestion. Three groups were set up: CD34+ cells pure culture group, cytokineinduced group and two stem cells co-culture group with noncontact. Results The average purity of enriched CD34+ cells as assessed by FACS was (95. 02 ± 3. 81) %. Freshly isolated CD34+ cells were small and round which suspended in culture medium. Attached cord-like structure cells of CD34+ cells appeared after 7 days coculture with noncontacted MSC, and when the CD34+ cells grew into large number, they formed colonies. These cells expressed endothelial specific markers, including CD144 (54. 40 ±4. 13)% ,vWF (47. 53 ± 3. 96) % , CD31 (65. 43 ± 5. 61) % ( P ＜ 0. 05, as compared with CD34+ cells pure culture group) , partially expressed CD34 and, the leukocyte common antigen CD45 was negatively expressed.Conclusion Human umbilical cord blood-derived CD34+ cells could be induced into endothelial cells under the paracrine action of umbilical cord-derive mesenchymal stem cells which has the same effect of cytokines.     

骨髓基质细胞共培养体系促进人脐血CD133+细胞的体外扩增

目的探讨来自白血病患者骨髓细胞的基质细胞层建立的扩增体系体外扩增人脐带血造血干/祖细胞的可行性。方法应用白血病患者缓解期骨髓基质细胞,结合造血细胞生长因子体外扩增人脐带血CD133 细胞(实验组),对扩增细胞的免疫表型、集落形成能力等生物学特性进行动态观察,并与单独应用造血细胞生长因子的常规扩增(对照组)进行比较。结果基质细胞层上接种的细胞易于收集;实验组在扩增各时间点的有核细胞数(NC)明显高于对照组,而且有核细胞中CD34 细胞、CD133 细胞、CD34 CD38-细胞以及CD34 CD133 细胞的比例也明显高于对照组;实验组扩增各时间点有核细胞各种集落的种植率明显高于对照组,有核细胞、CD34 细胞、CD133 细胞、CD34 CD38-细胞以及细胞集落的扩增倍数明显高于对照组。结论含有基质细胞的扩增培养体系,不仅可以加速人脐带血造血干/祖细胞的体外扩增,而且可以延缓造血干/祖细胞的分化。     

The effect of cryopreservation on clonogenic capacity and in vitro expansion potential of umbilical cord blood progenitor cells

BACKGROUND: Umbilical cord blood progenitor cells have been demonstrated to possess significant advantages over bone marrow in terms of proliferative capacity and immunologic reactivity. But the low number of hematopoeitic stem cells (HSC) is the most important limitation of its use. The ex vivo expansion of cord blood progenitor cells is the current strategy to overcome this problem. Furthermore, among the factors that enable successful cord blood transplantation is the ability to store and subsequently recover a sufficient number of viable cells. Since it would be costly to expand umbilical cord blood (UCB) progenitor cells, it is important to determine the feasibility and reproducibility of progenitor cell expansion after cryopreservation. We evaluated whether cryopreservation procedures might impair the clonogenic capacity and in vitro expansion of UCB. MATERIALS AND METHODS: We evaluated the cell viability, clonogenic capacity, CD34+38- content and in vitro expansion potential of progenitor cells from UCB (n = 10) separated mononuclear cells (MNC), before and after 1 month of cryopreservation by programmed rate freezing. RESULTS: Although cell viability decreased after cryopreservation (P < .05), there was no significant difference in CD34+ or CD34+38- absolute count, colonogenic capacity and in vitro expansion potential of cord blood progenitor cells (P > .05). CONCLUSIONS: Since the survival of CD34+ cells was greater than other elements, CD34+ cells seem more tolerant to cryopreservation than the other nucleated populations. Moreover in vitro expansion of UCB progenitor cells may be obtained following cryopreservation. Our results suggest that cryopreservation procedures do not impair the clonogenic capacity and in vitro expansion potential of cord blood stem/progenitor cells.     

Ex vivo expansion and transplantation of hematopoietic stem/progenitor cells supported by mesenchymal stem cells from human umbilical cord blood

Human mesenchymal stem cells (MSCs) are multipotential and are detected in bone marrow (BM), adipose tissue, placenta, and umbilical cord blood (UCB). In this study, we examined the ability of UCB-derived MSCs (UCB-MSCs) to support ex vivo expansion of hematopoietic stem/progenitor cells (HSPCs) from UCB and the engraftment of expanded HSPCs in NOD/SCID mice. The result showed that UCB-MSCs supported the proliferation and differentiation of CD34+ cells in vitro. The number of expanded total nucleated cells (TNCs) in MSC-based culture was twofold higher than cultures without MSC (control cultures). UCB-MSCs increased the expansion capabilities of CD34+ cells, long-term culture-initiating cells (LTC-ICs), granulocyte-macrophage colony-forming cells (GM-CFCs), and high proliferative potential colony-forming cells (HPP-CFCs) compared to control cultures. The expanded HSPCs were transplanted into lethally irradiated NOD/SCID mice to assess the effects of expanded cells on hematopoietic recovery. The number of white blood cells (WBCs) in the peripheral blood of mice transplanted with expanded cells from both the MSC-based and control cultures returned to pretreatment levels at day 25 posttransplant and then decreased. The WBC levels returned to pretreatment levels again at days 45-55 posttransplant. The level of human CD45+ cell engraftment in primary recipients transplanted with expanded cells from the MSC-based cultures was significantly higher than recipients transplanted with cells from the control cultures. Serial transplantation demonstrated that the expanded cells could establish long-term engraftment of hematopoietic cells. UCB-MSCs similar to those derived from adult bone marrow may provide novel targets for cellular and gene therapy.     

MSCs与CD34~+单核细胞共培养联合脱细胞支架植入体内构建兔阴茎海绵体

目的研究将异体骨髓间充质干细胞(MSCs)和CD34~+单核细胞(MNCs)共培养体系种植于脱细胞海绵体支架上在兔体内构建阴茎海绵体组织的可行性。方法分别从兔骨髓与兔外周血中提取并鉴定MSCs与CD34~+MNCs,将两种细胞组分以107/mL的密度种植于制备好的兔阴茎海绵体脱细胞胶原支架上,同时将相同密度的MSCs、CD34~+MNCs分别种植于支架上,培养4天后植入一种兔阴茎海绵体缺损模型中。3个月后对工程化组织进行取材,行HE及Masson三色染色等组织学检测。结果 MSCs和CD34~+MNCs共培养组近白膜处的海绵体保留了正常海绵体结构,而MSCs组、CD34+单核细胞组及空白支架组以疤痕增生为主,尽管较之CD34~+单核细胞组及空白支架组,间充质干细胞组疤痕组织中的血管数目较多(P0.05)。结论我们的研究证明了将MSCs和CD34~+MNCs的共培养体系种植于脱细胞支架上植入兔体内可以构建出一段组织学上与原生海绵体相似的组织;CD34~+MNCs在体内主要通过协同MSCs而非单独发挥其促血管化的生物学效应。     

人脐血细胞体外扩增的实验研究和意义

目的：了解脐血造血干细胞在体外扩增培养过程中的生长分化特点,探讨脐血干细胞与体外扩增后的祖细胞混合移植的可行性以及合适的移植时机。方法：按种脐血单个核细胞（MNC）于含体积浓度为20％胎牛血清（FCS）的IMDM悬浮培养体系中,加入干细胞因子（SCF）、Flt-3配基（FL）、粒－单细胞集落刺激因子（GM－CSF）、白细胞介素－3（IL－3）、白细胞介素－6（IL－6） ,培养21d,每周半量换液,同时进行细胞计数,涂片形态学观察,粒－单系祖细胞（CFU－GM）、红细祖细胞（BFU－E）集落培养,细胞表面CD34^ 、CD33^ 、CD3^＋、CD19^＋标记和细胞增周期的动态观察。结果 培养7d时的脐血细胞,CFU－GM、BFU－E集落形成最多,之后逐渐减少,21d时已低于培养前水平。CD34^ 细胞比例在培养后7d达高峰,14d开始下降;CD33^＋细胞比例在培养后7－14d达高峰,21d时开始下降;CD3^ 、C CD19^ 细胞比例均在培养第7d时显著下降,并持续低水平至21d。培养7d后G0期细胞比例明显减少,S期细胞快速增高,至21d时仍有较高比例。培养第21d的细胞涂片见少量中、晚幼粒细胞。结论：理论上脐血干细胞与扩增后的祖细胞混合移植用于成人具有可行性,体外扩增培养7d左右是混合移植的最佳时机。