肝细胞生长因子原核表达载体PUC18-HGF的构建及鉴定

目的　构建人肝细胞生长因子 (hHGF)的原核表达载体。方法　利用基因重组技术 ,将人肝细胞生长因子cDNA全长序列 ,定向克隆于表达型载体PUC18质粒的多克隆位点中 ,限制性内切酶酶切鉴定。结果　重组PUC18-HGF原核表达载体经限制性内切酶电泳分析 ,与理论值相符。结论　本实验成功将人肝细胞生长因子cDNA全长序列插入表达型载体PUC18多克隆位点BamHI和Xbal限制性内切酶位点之间 ,为通过基因工程获得外源性HGF提供实验依据     

人巨细胞病毒B基因克隆的构建及其DNA限制性位点的微机系统分析

作者以pBR322为载体,成功地构建了人巨细胞病毒(HCMV)B基因克隆,并用微机处理系统分析了B基因核苷酸序列的限制性位点。用BamHI酶解重组抽粒PAT153,电泳分离8.5kb片段,与经BamHI酶解、小牛肠碱性磷酸酶处理后的载体pBR322连接形成重组质粒pB_1。然后再用BamHI和HindⅢ双酶酶解pB_1,电泳分离5.1kb片段,与经双酶酶解后的载体pBR322连接构成HCMV B基因的pBH_1次级克隆。B基因核苷酸序列中存在13种限制性内切酶位点,片段大小在22bp至2.9kb之间。     

恒河猴高重复顺序DNA的分子克隆(摘要)

哺乳动物基因组中高重复顺序可用限制性内切酶消化DNA经用电泳分离获得,本文用限制性内切酶BamHI消化恒河猴DNA分离得到一系列高重复片段。用其中最小片段与质粒pBR322共价连接,转化到大肠杆菌后得到3个带有重组子的克隆.其中PMBI克隆用BamHI,Pstl酶解,杂交鉴定,证明此克隆是含有重组的恒河猴高重复片段,此片段大小约为340碱基对.     

人TAT-PDX-1融合蛋白原核表达载体的构建

目的构建人TAT-PDX-1融合蛋白原核表达载体。方法以人胰腺癌(PANC)-1细胞株cDNA为模板,采用反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)扩增胰腺十二指肠同源异型盒基因-1(PDX-1)蛋白编码的全部序列,克隆入原核表达载体pET28a中,经限制性内切酶HindIII和BamHI双酶切及DNA序列分析重组质粒的目的基因。结果 RT-PCR扩增产物的特异性片段长度为885 bp,以此构建的重组质粒pET28a-TAT-PDX-1经HindIII和BamHI双酶切后显示5 900 bp和885 bp左右的2条片段,测序结果与Genbank中的人PDX-1基因cDNA序列一致。结论成功构建了人TAT-PDX-1融合蛋白原核表达载体。     

绿色荧光蛋白表达质粒的构建及鉴定

目的构建能表达绿色荧光蛋白的载体———pCDNA3.1-GFP。方法使用基因重组方法从质粒pGreenlantern中获取绿色荧光蛋白基因片段,克隆入PCDNA3.1的多克隆区,构建成PCDNA3.1-GFP,通过限制性核酸内切酶NotI与BamHI对所建质粒进行分析后,转染HepG2细胞并观察绿色荧光蛋白表达。结果经限制性内切酶及转染HepG2细胞表达鉴定,证实成功构建了PCDNA3.1-GFP。结论成功构建成携有绿色荧光蛋白报告基因哺乳动物表达载体,该质粒可用于融合表达目的蛋白,并将目的蛋白表达定位。     

重组人B淋巴细胞刺激因子基因原核表达载体的构建及鉴定

目的构建人BLyS基因原核表达载体。方法采用RT-PCR方法,从人外周血淋巴细胞的总cDNA中扩增得到474bp的人BLySDNA片段,再用BamHI和EcoRI双酶切后,克隆到原核表达载体pGEX-5X-3中,用限制性内切酶酶切分析和DNA序列分析鉴定重组质粒。结果BLyScDNA已经正确克隆到原核表达载体pGEX-5X-3中。结论本实验为研制抗人BLyS单克隆抗体来研究人BLyS与自身免疫性疾病的关系奠定了基础。     

原核细胞中人神经生长因子基因的克隆

目的：克隆人神经生长因子cDNA，为神经生长因子cDNA的表达作准备。方法：采用大赐杆菌JMl09菌株作为宿主菌，以pUCll8作为克隆载体，使用限制性内切酶BamHI，PstI酶DNA片段，采用磷酸钙转染法转化细菌，α互补和限制性酶切图好鉴定转化细菌。结果：βNCF cDNA经BamHI和PstI双酶切后，经过重组，与裁体连接在于起，转化大赐杆菌后，形成了克隆。结论：应用JMl09作为宿主，pUCll8为克隆裁体，成功克隆了人神经生长因子cDNA。     

E.coli中的alkA基因启动子分离纯化

含有alkA基因启动子的质粒pMCP1000经用限制性内切酶EcoRI酶切、酶Ba131修饰和T_4DNA连接酶连接,重组成新质粒,命名为pAY系列。EMB琼脂板培养筛选,限制性内切酶EcoRI、SalI和BamHI酶切和聚丙烯酰胺凝胶电泳分离出最短的有活性的alkA基因启动子,pAY108。DNA序列分析证明在启动子上游区-49到起始密码区与1984年Nakabeppu报道的alkA基因启动子序列一致。β-半乳糖苷酶试验证明与野生型活性近似。     

HBV X基因及其调控序列的克隆

目的 构建一个含有ＨＢＶ Ｘ（ＨＢｘ）基因和它的调控序列的重组质粒。方法 通过ＰＣＲ法获取目的基因,将目的基因与ｐＧＥＭ－５ｚｆ（＋）Ｔ载体相连组成重组质粒,转入大肠杆菌ＪＭ１０９株后获得重组克隆。并分别通过ＰＣＲ、限制性内切酶酶切图谱和序列分析３种方法对重组质粒进行鉴定。结果 ＰＣＲ、限制性内切酶酶切图谱和序列分析均证实所获重组质粒中含有目的基因。结论 得到了含有ＨＢｘ结构基因及其上游调控序列的     

嗜肺军团菌mip基因重组质粒GFP-mip的构建及表达

目的构建嗜肺军团菌mip基因的真核重组质粒GFP-mip,并观察其在NIH3T3细胞中的表达。方法以嗜肺军团菌DNA为模版,通过PCR扩增获得mip基因,将其定向克隆到绿色荧光质粒pEGFP-C1中,构建真核重组质粒GFP-mip。经限制性核酸内切酶XhoI和BamHI酶切鉴定、PCR和核酸序列分析后,通过脂质体法转染到NIH3T3细胞中,利用荧光显微镜观察重组质粒的稳定表达。结果扩增出了702bpmip基因,在细胞质和细胞膜观察到较强绿色荧光。结论成功构建了真核重组质粒GFP-mip,并在NIH3T3细胞中得到了表达。     

嗜肺军团菌mip基因重组质粒GFP-mip的构建及表达

目的构建嗜肺军团菌mip基因的真核重组质粒GFP-mip,并观察其在NIH3T3细胞中的表达。方法以嗜肺军团菌DNA为模版,通过PCR扩增获得mip基因,将其定向克隆到绿色荧光质粒pEGFP-C1中,构建真核重组质粒GFP-mip。经限制性核酸内切酶XhoI和BamHI酶切鉴定、PCR和核酸序列分析后,通过脂质体法转染到NIH3T3细胞中,利用荧光显微镜观察重组质粒的稳定表达。结果扩增出了702bpmip基因,在细胞质和细胞膜观察到较强绿色荧光。结论成功构建了真核重组质粒GFP-mip,并在NIH3T3细胞中得到了表达。     

Panton-Valentine杀白细胞毒素(PVL)lukS-PV基因的克隆、原核表达及初步鉴定

目的构建Panton-Valentine杀白细胞毒素(PVL)lukS-PV基因表达载体,并在大肠杆菌中表达相应蛋白。方法提取PVL阳性金黄色葡萄球菌的基因,PCR方法扩增lukS-PV,A-T克隆至pGEM-T载体上,经PCR、双酶切和测序鉴定后,亚克隆到pET28a( )表达载体上,鉴定并转化至Rosetta(DE3)plys表达宿主菌中,用IPTG诱导表达,并用SDS-PAGE电泳分析和Western blot鉴定。结果构建了lukS-PV-pGEM-T和lukS-PV-pET28a( )重组质粒,经PCR扩增和限制性内切酶BamHI和XhoI双酶切均得到939bp的目的片段,基因测序与GENEBANK中的PVL的序列一致,宿主菌表达带HIS标签的重组LukS-PV蛋白。结论成功克隆lukS-PV基因和构建重组表达质粒,并在宿主菌中成功表达重组LukS-PV蛋白,为PVL免疫学检测方法的建立奠定基础。     

HCMV即刻早期基因原核表达克隆的构建

目的构建人类巨细胞病毒ＡＤ１６９株即刻早期基因ＵＬ３７＊１基因片段的原核表达克隆。方法通过聚合酶链反应扩增目的的基因，然后用限制性内切酶将目的基因与原核表达载体ＰＢＶ２２０定向连接。（３）结果获得了重组的原核表达质粒。结论用限制性内切酶鉴定原核重组表达质粒构建成功。     

人TAT-Survivin融合蛋白原核表达载体的构建

目的:构建人TAT-Survivin融合蛋白原核表达载体。方法:以人胸腺细胞瘤cDNA为模板,采用RT-PCR扩增survivin基因成熟蛋白编码的全部序列,克隆入原核表达载体pET28a(+)中,经限制性内切酶双酶切及DNA序列分析鉴定目的基因。结果:PCR扩增的特异性片段长度为462bp,以此构建的重组质粒pET28a-TAT-survivin,经HindIII和BamHI双酶切后显示5.9kb和462bp左右的两条片段,测序结果与Genbank中的人survivin基因cDNA(Genbank序列号)序列一致。证明人survivin已成功克隆到了原核细胞表达载体pET28a(+)中。结论:成功构建了pET28a-TAT-survivin重组原核表达载体。     

HCMV即刻早期基因原核表达克隆的构建

①目的构建人类巨细胞病毒ＡＤ１６９株即刻早期基因ＵＬ３７×１基因片段的原核表达克隆。②方法通过聚合酶链反应（ＰＣＲ）扩增目的基因，然后用限制性内切酶将目的基因与原核表达载体ｐＢＶ２２０定向连接。③结果获得了重组的原核表达质粒。④结论用限制性内切酶鉴定原核重组表达质粒构建成功     

胰腺癌反义K-ras癌基因片段的分离和克隆

目的：分离及克隆胰腺癌基因组中K—ras基因片段，构建重组反义K—ras癌基因逆转录病毒载体，并探讨其意义。方法：设计2对PCR引物，分别在上下游引物中引进BamHI和EoRI位点，以胰腺癌细胞株BxPC-3基因组DNA为模板扩增K—ras基因外显子1及侧翼序列，并采用重组DNA技术将目的基因插入逆转录病毒载体LZRSpBMN—Z中，并经菌液PCR和限制性内切酶酶切鉴定。结果：K—ras基因外显子1及侧翼序列已成功地克隆入LZRSpBMN—Z中。结论：LZRSpBMN—Z是胰腺癌反义基因治疗中新型候选载体之一。应用PCR方法获取反义K—raS目的基因外显子1方便可行，可用于重组反义K—ras癌基因逆转录病毒载体的构建。     

淋球菌主要外膜蛋白PIA原核重组质粒的构建及序列分析

目的：构建携带淋球菌主要外膜蛋白PIA基因的pET重组质粒，分析其编码序列。方法：根据PIA已知序列设计——对引物，用PCR技术从淋球菌捷克标准株中扩增PIA；将目的基因PCR产物和质粒pET28a( )同时用BamHI和Hind Ⅲ限制性内切酶进行双酶切，纯化回收后将其连接并将重组质粒转化大肠杆菌DH5α。将构建的重组质粒pET28a( )-PIA通过PCR、质粒双酶切、DNA测序证实获得正确的重组克隆。结果：成功构建PIA基因原核重组质粒pET28a( )-PIA。序列分析表明，其携带的PIA基因序列与GenBank中公布的淋球菌(AF090818)的PIA序列具有很高的同源性，其同源性达到99．9％。结论：成功构建携带淋球菌主要外膜蛋白PIA基因重组表达载体，有助于更深入地分析其基因功能，为后期淋球菌的临床检测和基因疫苗研制打下基础。     

人TAT—Survivin融合蛋白原核表达载体的构建

目的：构建人TAT—Survivin融合蛋白原核表达载体。方法：以人胸腺细胞瘤cDNA为模板,采用RT--PCR扩增survivin基因成熟蛋白编码的全部序列,克隆入原核表达载体pET28a（＋）中,经限制性内切酶双酶切及DNA序列分析鉴定目的基因。结果：PCR扩增的特异性片段长度为462bp,以此构建的重组质粒pET28a—TAT—survivin,经HindIII和BamHI双酶切后显示5．9kb和462bp左右的两条片段,测序结果与Genbank中的人survivin基因cDNA（Genbank序列号）序列一致。证明人survivin已成功克隆到了原核细胞表达载体pET28a（＋）中。结论：成功构建了pET28a—TAT—survivin重组原核表达载体。     

介导人血红素加氧酶-1基因的重组腺相关病毒载体的构建

目的:构建含人血红素加氧酶-1(hHO-1)基因的重组腺相关病毒(AAV)载体并进行鉴定。方法:利用基因重组技术,采用限制性内切酶HindⅢ从质粒XM-6/hHO-1中将目的基因hHO-1基因片段切出,克隆到质粒PAAV-MCS的HindⅢ位点中,构建重组质粒pAAV-hHO-1,采用限制性内切酶酶切,PCR和DNA测序鉴定。结果:PCR扩增出1 317 bp大小的片段,酶切鉴定证实插入位点及方向与预期的完全一致;测序证实hHO-1与Gene Bank提供的原始序列完全一致。结论:成功构建了含hHO-1基因的重组腺相关病毒载体,为缺血性疾病基因治疗的研究奠定了基础。     

肺炎支原体P1蛋白结构基因的克隆与鉴定

目的：在大肠杆菌中克隆肺炎支原体P1蛋白结构基因,为实现肺炎支原体P1蛋白结构基因的大量扩增及表达奠定基础。方法：PCR方法获取肺炎支原体P1蛋白结构基因,并与pUC19载体DNA连接,转入大肠杆菌JM109菌株,X-Gal平板筛选转化子,用PCR方法和限制性核酸内切酶酶切图谱分析方法鉴定重组克隆。结果：PCR和限制性核酸内切酶图谱分析均证实所获重组质粒中含有P1蛋白基因。结论：获得了含有肺炎支原体P1蛋白结构基因的克隆菌株。