多功能心腔内超声导管性能的初步测试

目的 在离体条件下重点测试自行设计研发的多功能心腔内超声导管操控性能、超声辐照换能器工作情况,实时监控心肌内注射的能力。方法 分别运用精密阻抗仪及超声声功率计测试超声辐照换能器的工作频率及声功率,然后将多功能心腔内超声导管送入离体猪心左心室,并在左心室游离壁测试多功能心腔内超声导管在心肌内注射时对实时监控注射针进针深度及指导微泡注射的能力。结果 该10F多功能心腔内超声导管能够实现单向弯曲;集成心腔内超声成像、心肌内注射、超声辐照和电生理标测功能,超声辐照换能器频率和声功率分别为7.2 MHz和0.28 W,能够实时监控进针深度及微泡分布情况。结论 本研究设计的多功能心腔内超声导管可能为经心内膜药物投递提供更为安全、有效的治疗方案。     

超声辐照微泡介导肝细胞生长因子基因逆转大鼠肝纤维化

目的 探讨超声辐照载肝细胞生长因子(hepatocyte growth factor,HGF)基因的超声微泡造影剂逆转大鼠肝纤维化的可行性. 方法 将成模后的40只Wistar大鼠随机分为5组,即(1)超声+载基因超声微泡造影剂组(HGF+ US/MB),(2)超声+单纯质粒组(HGF+ US),(3)质粒+超声微泡造影剂组(HGF+MB),(4)单纯质粒组(HGF),(5)单纯模型组(MA).经股静脉注入超声微泡造影剂,同时超声基因转染治疗仪辐照肝区,辐照条件为300 kHz,2 W/cm2,辐照10 s,间隔10 s,共20 min.于超声辐照后14 d行磁共振弥散加权成像(diffusion weighted imaging,DWI)检查;然后处死各组大鼠,取肝组织HE染色,观察肝纤维化恢复情况;Western Blot检测HGF蛋白在大鼠肝脏中的表达. 结果 HGF+ US/MB组的表观弥散系数(apparent diffusion coefficient,ADC)值明显高于其他各组;相反地,指数表观弥散系数(exponential apparent diffusion coefficient,EADC)低于其他各组;病理组织片可见HGF+ US/MB组汇管区纤维结缔组织增生,但肝小叶结构完整,其余各组纤维组织增生程度强于HGF+US/MB组.同时,HGF+US/MB组的HGF蛋白的表达均高于其他各组(P＜0.05). 结论 超声靶向破坏微泡能够介导HGF基因在肝组织内高效表达,并产生抗纤维化效应,为肝纤维化的基因治疗提供一种新的基因转移途径.     

超声辐照微泡促骨髓间充质干细胞归巢于大鼠肾组织实验研究

目的 观察超声辐照微泡对大鼠骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)归巢于急性肾小管坏死模型肾组织的作用.方法 将制备成功的40只肾小管坏死模型大鼠随机分为5组(8只),即(1)单纯模型组(对照组);(2)0.5 W/cm2超声+微泡组(0.5 US+MB);(3)干细胞组(MSCs); (4) 0.5 W/cm2超声+微泡+干细胞组(0.5 US+ MB+MSCs);(5)1.0 W/cm2超声+微泡+干细胞组(1.0 US+ MB+ MSCs).7d后将各组大鼠处死,取材用于荧光显微镜观察MSCs在肾组织的分布情况,采用荧光定量PCR测定细胞间黏附分子1(ICAM-1)基因表达水平.结果 采用荧光显微镜观察,DAPI标记的MSCs细胞核(细胞核带蓝色荧光),1.0 US+ MB+ MSCs组肾组织骨髓干细胞数量明显多于0.5 US+ MB+ MSCs组及MSCs组(P＜0.05).0.5 US+MB组、0.5 US+ MB+MSCs组及1.0 US+ MB+MSCs组ICAM-1的基因水平明显高于对照组及MSCs组(P＜0.05).结论 1.0 W/cm2超声辐照微泡促进肾组织细胞ICAM-1表达增加,从而促进MSCs归巢于急性肾小管坏死模型的肾组织.     

血管内超声导管联合微泡增强尿激酶溶栓的实验研究

目的探讨EKOS■超声导管联合血栓内注射微泡增强尿激酶体外溶栓治疗效果。方法采用水听器法测量EKOS■超声导管峰值负压。将90份体外牛血血栓样本根据其实验方法随机分为6组,分别为:超声+微泡+尿激酶联合组(联合组)、超声+尿激酶组(US+UK组)、超声+微泡组(US+MB组)、超声组(US组)、尿激酶组(UK组)和对照组,每组15份,称取各组溶栓前后的血栓质量,计算并比较其溶栓率。对溶栓处理后各组血栓行HE染色并于光镜下观察红细胞和纤维蛋白的分布情况。结果EKOS■超声导管的峰值负压在0.4~6.4 MPa,呈无规律动态变化。联合组溶栓率为(41.9±4.5)%,与US+UK组(42.0±3.3)%接近,均显著高于其余各组,差异均有统计学意义(均P<0.05);US+MB组溶栓率为(28.4±3.3)%,UK组为(27.8±3.1)%,两组比较差异无统计学意义,但均高于US组(23.9±3.0)%和对照组(17.5±3.7)%,差异均有统计学意义(均P<0.05)。光镜下见联合组和US+UK组与EKOS■超声导管接触处的血栓较多崩解,红细胞分布较其余各组更稀疏。结论EKOS■超声导管可明显提高尿激酶对体外牛血血栓的溶栓率,在此基础上增加微泡对溶栓率无明显提高。     

超声辐照微泡促进犬骨髓间充质干细胞归巢到心肌缺血部位的实验研究

目的 观察超声辐照微泡对犬骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)归巢到心肌缺血部位的作用.方法 6只健康杂种犬开胸建立心梗模型,随机分成实验组和对照组.1周后,实验组:经胸用频率为1 MHz,声强为1.0W/cm2的脉冲超声辐照,辐照10 min,同时静脉注射2 ml微泡造影剂.辐照完毕后经导管在冠脉口注射5 ml(浓度为1.35×106个/ml)用DAPI标记的MSCs.对照组不经超声辐照微泡单纯注射MSCs.5 d后处死动物,取心肌梗死边缘区组织,进行病理组织HE染色和激光共聚焦观察MSCs归巢到心肌缺血区情况.结果 病理组织HE染色观察到实验组心肌毛细血管外有红细胞漏出,而对照组未见红细胞漏出;激光共聚焦观察到实验组心肌组织内分布的MSCs明显比对照组多.结论 超声辐照微泡可促进MSCs归巢到心肌缺血部位,而对心肌组织无明显损伤.     

超声靶向微泡破裂联合PEI增强小鼠EGFP基因心肌转染

目的探讨超声靶向微泡破裂(UTMD)联合聚乙烯亚胺(PEI)增强BALB/c小鼠心肌绿色荧光蛋白基因(EG-FP)转染的可行性和应用价值。方法实验分为7组:PBS组、裸质粒组、质粒 超声辐照组(P US)、质粒 SonoVue 超声辐照组(P UTMD)、质粒 PEI组(P PEI)、质粒 PEI 超声辐照组(P PEI US)、质粒 PEI SonoVue 超声辐照组(P PEI UTMD)。由BALB/c小鼠尾静脉注入EGFP质粒和SonoVue微泡或PEI的复合物,处理4d后检测心肌基因表达效率及HE染色,并对超声辐照后的质粒完整性进行分析。结果电泳显示超声辐照不会损坏DNA或PEI/DNA复合物。非超声辐照时,EGFP只在心内膜下层表达;而超声辐照时,表达最强的位置为靠近探头的左室前壁;超声联合PEI时,EGFP的分布差异不明显。P PEI UTMD组的转染率最高,荧光强度最强。结论UTMD联合PEI可高效、靶向地将质粒DNA输送至心肌,这种非侵入性的技术在心脏基因治疗上很有前景,有望应用于迅速发展的心脏病基因疗法。     

不同强度超声破坏微泡对犬心肌组织的生物学效应

目的 探讨不同强度的超声破坏微泡对犬心肌组织的生物学效应,优化出影响心肌微环境的最佳辐照条件.方法 9只健康成年杂种犬随机分成3组,每组3只.静脉输入2 ml微泡造影剂,同时采用频率为1 MHz,强度不同的超声辐照(0.5 W/cm2、1.0 W/cm2、2.0 W/cm2)犬心肌组织,辐照时间为5 min.辐照完毕后即刻处死动物,取局部心肌组织.进行病理组织HE染色和透射电镜观察犬心肌细胞及毛细血管内皮细胞等细胞超微结构改变.结果 0.5 W/cm2超声破坏微泡后心肌组织水肿,无出血;1.0 W/cm2超声破坏微泡后心肌组织轻微出血和少量炎症细胞浸润;2.0 W/cm2超声破坏微泡后心肌组织明显出血,炎症细胞一定程度浸润.结论 不同强度超声破坏微泡造影剂能使犬心肌组织产生不同程度的生物学效应;超声强度在1.0～2.0 W/cm2能在使心肌轻度损伤时引起一定程度的炎症反应.     

超声靶向破坏微泡介导骨髓间充质干细胞移植促进大鼠血管新生

目的 探讨超声破坏微泡介导骨髓间充质干细胞(MSCs)移植在大鼠缺血骨骼肌中的作用. 方法 24只Wister大鼠离断右侧股动脉7 d后分为4组:①超声+微泡组(US+MB);②干细胞静脉移植组(MSCs-iv);③超声+微泡+干细胞静脉移植组(US+MB+MSCs-iv);④对照组.处理后第7 d取局部缺血骨骼肌行免疫组化检测. 结果 US+MB+MSCs-iv组缺血骨骼肌可见较多移植的MSCs,其新生血管数量较其他组明显增加. 结论 超声靶向破坏微泡有可能成为一种增强MSCs移植和促进血管新生的新方法 .     

共聚物P85联合超声微泡介导基因转染的体外实验研究

目的 探讨共聚物P85与黏附增强型绿色荧光蛋白(enhanced green fluoresent protein,EGFP)质粒的微泡造影剂(microbubble,MB)结合后联合一定强度的超声(ultrasound,US)辐照,是否增强人肝癌细胞(HepG2)的质粒转染及表达.方法 以人肝癌细胞(HepG2)为研究对象,质粒DNA是可表达绿色荧光蛋白的pEGFP,添加微泡造影剂或共聚物P85后进行脉冲多普勒超声辐照(频率1 MHz,声强1 W/cm2,工作周期20%,时间20 s).24 h后台盼蓝染色评价细胞存活率,荧光显微镜和流式细胞仪评价细胞的基因转染率.结果 有超声辐照组的pEGFP转染率明显高于无超声辐照组(P＜0.01),有超声辐照组中pEGFP+30%MB+P85+US组转染效率(22.14±3.06)%优于单独使用微泡组(11.34±2.2)%或P85组(9.72±1.21)%(P＜0.01).结论 微泡造影剂与共聚物P85结合同时给予超声辐照可增强基因转染效率,在基因治疗上有待于进一步关注和研究.     

超声破坏微泡对大鼠皮肤创面愈合影响的实验研究

目的 探讨超声破坏微泡(声诺维)对大鼠皮肤创面愈合的影响.方法 96只SD大鼠建立皮肤创面模型后随机分成4组:超声破坏微泡组、单纯微泡组、单纯超声组和对照组.超声破坏微泡组经鼠尾静脉注射微泡造影剂0.5 ml,同时用声强度1 MHz、2.0 W/cm2超声辐照3 min单纯微泡组经鼠尾静脉注射微泡造影剂0.5 ml;单纯超声组经鼠尾静脉注射生理盐水0.5 ml,同样条件超声辐照3 min对照组经鼠尾静脉注射生理盐水0.5 ml.于创伤后第1、3、5、7、14、21 d利用HE染色和免疫组化方法 观察各组创面肉芽组织生长及血管内皮生长因子(VEGF)表达的情况.结果 HE染色:伤后第7 d,超声破坏微泡组肉芽组织明显比其他3组厚,新生毛细血管均垂直于创面生长,其他3组毛细血管排列紊乱.免疫组化观察VEGF表达变化:超声破坏微泡组在第3 d形成表达高峰,其他3组表达高峰在第5～7 d.结论 超声破坏微泡可以提高大鼠背部皮肤的创面愈合质量;新生肉芽组织成熟早,创面愈合加速.超声破坏微泡时产生的高温、高压及某些化学效应可以刺激内源性VEGF分泌,促进血管生成,从而促进创面愈合.

Abstract：

Objective To investigate the effect of microbubble(Sono Vue) destruction with ultrasound on wound healing in rats. Methods Total 96 SD rats were accepted one rounded whole-layer skin incision on back each other and randomly divided into four groups:microbubble destruction with ultrasound(US + MB),microbubble(MB), ultrasound(US) and control group. Rats in US + MB group were injected with 0.5 ml microbubble contrast agent via tail vein,and then ultrasound irradiated for 3 minutes immediately. MB group were injected with 0.5 ml microbubble contrast agent. US group were injected with 0.5 ml physiological saline,and then ultrasound irradiated for 3 minutes immediately under the same condition. Control group were injected with 0.5 ml physiological saline. Feed each rat in single cage. On day 1,3,5,7,14 and 21 after wound creation,the excised wound tissues were analyzed by histology and VEGF expression in wounds by immunohistochemistry. Results HE staining: On day 7, wounds of US + MB group displayed the most accumulation of granulation tissue and all new capillaries were perpendicular to the wound surface, but the new capillaries of other 3 groups were disordered. Immunohistochemical examination of VEGF expression:the peak expression appeared on day 3 in US + MB group, other 3 groups were on day 5 to day 7.Conclusions US + MB treatment could improve the quality of wound healing and granulation tissues were maturated earlier than MB, US treatment and control group, which could accelerate wound healing. High temperature,high pressure and some kind of chemistry effecs induced by microbubble destruction with ultrasound can stimulate the secretion of endogenous VEGF, which may be the mechanism of promoting angiogenesis and wound healing.     

多功能心腔内导管移植骨髓干细胞治疗犬心肌梗死

目的观察多功能心腔内导管经心内膜移植骨髓间充质干细胞(MSCs)治疗心肌梗死(MI)的可行性及疗效。方法采用密度梯度离心法获得犬MSCs。结扎犬左冠状动脉前降支建立MI模型,1周后将建模成功的动物随机分成移植组和对照组,每组6只,移植组注射0.2ml MSCs,对照组注射等量的磷酸盐缓冲液。细胞移植4周后,以超声心动图检测心功能变化,之后取心肌组织作石蜡切片,用HE和Masson三色染色法显示MI区的组织结构。结果多功能心腔内导管能显示心腔内解剖结构,并能监控注射针位置。心功能检测和组织学染色显示移植组较对照组左心室射血分数增高,而心肌纤维化程度减低。结论多功能心腔内导管移植MSCs治疗犬MI能改善心功能,减少心肌纤维化。     

超声微泡造影剂对心肌组织的生物学效应及介导VEGF基因转染大鼠心肌的实验研究

目的 探讨超声微泡造影剂对心肌组织的生物学效应及其介导VEGF基因转染大鼠心肌的有效性。方法 18只健康雄性Wistar大鼠，取3只采用超声波在鼠胸壁破坏微泡造影剂，观察对心肌组织显微结构的影响。将另15只急性心肌梗死3天后的雄性Wistar大鼠分为3组，每组5只。第一组采用超声破坏微泡造影剂的方式，将pcDzVEGFm基因转染大鼠心肌至造影剂不再显影(约6min)；第二组尾静脉输入同等剂量携pcD。VEGF。基因的造影剂；第三组为对照。2周后，取缺血心肌组织行VEGF免疫组织化学染色，观察心肌组织血管内皮生长因子(VEGF)蛋白表达情况。结果超声波破坏微泡造影剂能使心肌组织充血，产生大量空泡，并有部分心肌细胞坏死。采用超声微泡造影剂介导的VEGF基因转染，能明显增强大鼠心肌组织VEGF蛋白的表达。结论 超声微泡造影剂能明显增强对组织的空化效应，其介导的VEGF基因治疗是一种无创、新型、高效的基因转移方法。     

低能量脉冲式超声联合微泡对兔VX2肿瘤微循环的阻断作用

目的探讨低能量脉冲式超声联合微泡对兔VX2肿瘤微循环的阻断作用及其病理机制。方法将36只皮下VX2荷瘤兔随机平均分成3组:超声微泡组注入0.2ml/kg体质量微泡5ml,并辅以超声辐照10min;单纯超声组注入生理盐水5ml,辐照10min;单纯微泡组仅注入0.2ml/kg体质量微泡5ml,不进行超声辐照。CEUS观察各组治疗前、治疗后0、30min、60min时血流灌注情况,比较各时间点的灌注面积。治疗后即刻随机选取各组6只荷瘤兔处死,完整切取肿瘤,行病理学检查。结果超声微泡组治疗后即刻肿瘤血流灌注完全消失,灌注面积为0,但30min及60min后灌注有所恢复,各时间点治疗后灌注面积显著大于治疗前(均P<0.05);大体病理检查见肿瘤微血管扩张、管壁结构崩解,弥漫性充血、出血和肿瘤组织水肿,局部血肿,形成血栓等。单纯超声组及单纯微泡组治疗前、后造影剂灌注面积无差异,肿瘤内部未见出血、水肿等。结论低能量超声联合微泡能够阻断肿瘤微循环,可能是由于空化效应导致血管壁损伤,组织水肿对局部肿瘤血液循环产生阻力,从而阻断肿瘤血液循环。     

经多功能导管化学消融犬左心室前组乳头肌

目的 观察利用多功能心腔内超声（ICE）导管化学消融犬左心室前组乳头肌（APM）的可行性。方法 将15只杂交犬随机分均为0.2 ml组、0.4 ml组及0.8 ml组，每组5只。在ICE图像定位和监控下于左心室APM基底部注射不同剂量无水乙醇进行化学消融。于消融前及消融5天后行经胸超声，检测二尖瓣反流面积（MRA）及射流紧缩口宽度（VC）。之后处死动物，观察APM大体及病理变化。结果 ICE图像可清晰显示左心室APM结构，并实时监测进针深度及消融过程。消融5天后0.2 ml及0.4 ml组MRA、VC无明显改变，0.8 ml组MRA及VC较消融前明显增加（P均<0.05）。APM基底部可见中央呈苍白色的消融灶，0.2 ml、0.4 ml及0.8 ml无水乙醇在APM基底部形成的消融灶体积分别为（0.37±0.07）cm²、（0.69±0.08）cm²、（0.96±0.19）cm²，较高剂量组消融灶体积均大于较低剂量组（P均<0.05）。光镜下见消融灶内心肌细胞呈不可逆性坏死改变。结论 采用ICE导管注射低剂量无水乙醇可安全、有效消融左心室APM，有望为治疗左心室APM起源室性心律失常提供新的策略。     

Bioeffects of Ultrasound-Stimulated Microbubbles on Endothelial Cells: Gene Expression Changes Associated with Radiation Enhancement In Vitro

Ultrasound can be used to target endothelial cells in cancer therapy where the destruction of vasculature leads to tumor cell death. Here, we demonstrate ultrasound bioeffects in which the levels of genes in endothelial cells can be significantly altered by ultrasound-stimulated microbubble exposure. These were compared with established effects of radiation on endothelial cells at a gene level. Human-endothelial cells were exposed to ultrasound and microbubbles, radiation or combinations of ultrasound, microbubbles and radiation. Gene expression analyses revealed an up-regulation of genes known to be involved in apoptosis and ceramide-induced apoptotic pathways, including SMPD2, UGT8, COX6B1, Caspase 9 and MAP2K1 with ultrasound-stimulated microbubble exposure but not SMPD1. This was supported by immunohistochemistry and morphologic changes examined with cell microscopy, which showed changes in SMPD1 gene product in cells with microbubble exposure. This supports the hypothesis that ultrasound-stimulated microbubbles can induce significant bioeffect-related changes in gene expression and can affect ceramide signaling pathways in endothelial cells, leading to apoptosis.     

诊断超声介导微泡提高肝纤维化通透性及促进基因传递

目的 探讨诊断超声联合微泡对肝纤维化组织通透性的影响及其介导基因转染肝纤维化大鼠的有效性。方法 采用二甲基亚硝胺(DMN)法建立大鼠肝纤维化模型,80只大鼠在建模第4周末随机分为:模型对照组、单纯微泡组、单纯超声组和诊断超声联合微泡组。分别进行肝纤维化微血管通透性实验和基因转染实验,采用激光共聚焦显微镜观察伊文思蓝(EB)在肝纤维化组织内分布情况,同时定量检测肝纤维化组织内EB的含量,评估不同分组微血管通透性。荧光显微镜下观察含增强型绿色荧光蛋白报告基因的质粒转染大鼠肝纤维化模型的基因表达情况。结果 激光共聚焦显微镜显示诊断超声联合微泡组纤维化肝实质内可见明显的EB红色荧光。诊断超声联合微泡组纤维化肝组织中EB含量明显高于其他3组(P<0.05)。荧光显微镜下观察,相比其余3组,诊断超声联合微泡组增强型绿色荧光蛋白最多,基因转染效率最高。结论 诊断超声联合微泡在提高纤维化肝脏微血管通透性的同时可促进基因传递。     

低频超声联合微泡造影剂增强脂质体介导pEGFP-N1基因转染体外前列腺癌细胞

目的探讨低频超声联合微泡造影剂增强脂质体介导增强型绿色荧光蛋白质粒(pEGFP-N1)转染前列腺癌细胞的可行性,并对超声微泡浓度参数进行优化。方法将前列腺癌PC-3细胞悬液分为空白对照组、超声组、微泡组、微泡+超声组、脂质体组、脂质体+微泡组、脂质体+超声组、脂质体+微泡+超声组,其中脂质体+微泡+超声组根据微泡体积浓度不同分为(0、10%、20%、30%、40%和50%)6个亚组。经超声辐照,24h后用荧光显微镜观察细胞中基因表达情况,并用流式细胞仪检测转染率。结果脂质体+微泡+超声组基因转染效率最高,与其他组比较差异均有统计学意义(P均<0.05);在脂质体+微泡+超声亚组中,微泡浓度为20%亚组基因转染率最高。结论低频超声联合微泡能有效增强脂质体介导pEGFP-N1基因在体外前列腺癌细胞中的转染率,20%是体外基因转染前列腺癌细胞的最佳微泡浓度。     

一种新型载药超声微泡的制备

目的 探讨共价结合与静电吸附法连接超声微泡与乳酸羟基乙酸共聚物(PLGA)纳米微球的效率,制备一种新型载药超声微泡。方法 采用机械振荡法制备正电荷氨基化超声微泡(MB-NH₂)。以双乳化法制备负电荷PLGA纳米微球(NP),并用碳二亚胺法活化NP表面的羧基,得到活性PLGA纳米微球(NP-COOH)。分2组连接超声微泡与纳米微球:静电组(MB-NH₂+NP)、共价静电协同组(MB-NH₂+NP-COOH)。在光镜下不同时间点观察连接效果。结果 48 h后光镜下静电组超声微泡表面光滑,周围未见纳米微球聚集;共价静电协同组超声微泡表面不光滑,周围布满数量不等的小圆形的纳米微球,呈花环状。结论 在共价结合与静电吸附的协同作用下,可成功制备出一种新型载药超声微泡,有望为肿瘤治疗提供一种新思路。