实时荧光定量PCR检测布鲁杆菌方法的应用

目的 探讨实时荧光定量PCR(FQ-PCR)用于布鲁杆菌检测的可行性.方法 根据布鲁杆菌BCSP31基因设计合成1对引物和TaqMan探针,以克隆有布鲁杆菌基因片段的PMD18-T质粒作为标准品DNA模板,进行FQ-PCR检测,绘制标准曲线;对所应用的方法分别进行敏感性、特异性及重复性分析;并对临床血液标本进行FQ-PCR,与临床诊断进行比较.结果 用标准品DNA建立的定量标准曲线的循环阈值(Ct)与模板拷贝数呈良好的线性关系(r=0.999);FQ-PCR检测的灵敏度拷贝数为5个/μl,普通PCR为5×102个/μl,FQ-PCR是普通PCR的100倍;用FQ-PCR检测6株布鲁杆菌菌株及5株非布鲁杆菌菌株,布鲁杆菌均检出较强荧光信号,非布鲁杆菌未检出;5×103个拷贝/μl标准品DNA检测后,Ct值批内变异系数(CV)为0.71%,批间CV为7.23%;用FQ-PCR检测临床确诊阳性血标本24份,检出阳性19份,符合率为79%(19/24),阴性对照血标本31份,全部阴性,阴性符合率为100%(31/31),临床症状可疑标本30份,检出阳性2份.结论 用FQ-PCR方法检测布鲁杆菌具有高度敏感性、特异性及良好的重复性,与临床阳性及阴性标本的符合率较高,可用于快速检测各种样本中的微量布鲁杆菌以及作为布鲁杆菌感染的实验室检测方法.     

2009-2012年宁夏人群感染布鲁氏菌种型分布特征

目的鉴定2009—2012年宁夏分离的布鲁氏菌,掌握感染人群的主要布鲁氏菌种型。方法采用血培养瓶从试管凝集试验（SAT）抗体阳性的病人血液中分离布鲁氏菌,利用传统生物学特性鉴定方法结合聚合酶链式反应（PCR）和A,M,O,S-聚合酶链式反应（AMOS-PCR）方法进行种型鉴定。结果从目标人群中共分离22株菌,PCR检测均扩增出223bp的特异性条带,鉴定为布鲁氏菌。AMOS-PCR中均扩增出178bp和731bp的特异性条带,鉴定为羊种布鲁氏菌,结合染料抑菌试验、噬菌体裂解和特异性血清凝集试验结果,22株菌均为羊种3型布鲁氏菌。结论2009—2012年宁夏人群感染布鲁氏菌主要为羊种3型布鲁氏菌,PCR和AMOS-PCR可作为布鲁氏菌分离鉴定的辅助方法推广使用。     

贵州省首次从山羊分离到布鲁氏菌及其种型鉴定

目的从贵州布鲁氏菌抗体阳性的山羊血液分离布鲁氏菌病原体并对其进行种型鉴定。方法采用血培养法对经试管凝集试验检测为布鲁氏菌抗体阳性的山羊血血液进行细菌分离培养,并应用传统方法和和分子生物学方法对可疑菌落进行种型鉴定。结果11份（GZB 01—11）抗体阳性的山羊血标本中有4份（GZB03、GZB04、GZB09、GZB11）经血培养瓶培养出布鲁氏菌可疑菌落,可疑菌落经传统方法鉴定为羊种生物3型布鲁氏菌,4株菌进一步采用布鲁氏菌属特异性PCR（BCSP31-PCR）鉴定为布鲁氏菌属细菌,GZB03,GZB04,GZB11经种／型特异性PCR（AMOS-PCR）将其定为羊种布鲁氏菌,而GZB09采用该方法不能定种。结论从11份贵州省布鲁氏菌抗体阳性山羊血样中分离到4株羊种布鲁氏菌,首次证实贵州省存在羊种布鲁氏菌。     

布鲁杆菌鉴定及抗菌药物体外药物敏感性分析CSCD

目的细菌学鉴定和PCR鉴定布鲁杆菌,并测定布鲁杆菌对8种抗菌药物体外敏感性,了解布鲁杆菌的药物敏感情况。 方法对定为布鲁杆菌菌株按布鲁杆菌标准鉴定方法采用传统的阳性血清、单相特异性血清（A、M和R）凝集试验、布鲁杆菌噬菌体裂解试验（Tb、BK2）,进行种、型鉴定,以参考菌株对照。布鲁杆菌表面蛋白-31（brucella surface protein-31,BCSP-31）-PCR和牛种、羊种、绵羊附睾和猪种布鲁菌（abortus melitensis ovis suis, AMOS）-PCR鉴定分型。用微量肉汤稀释法对来自血培养分离的27株布鲁杆菌测定8种抗菌药物（阿奇霉素、环丙沙星、左氧氟沙星、多西环素、利福平、庆大霉素、四环素、链霉素）的最低抑菌浓度（minimun inhibitory concentration,MIC）。 结果27株菌经细菌学鉴定为布鲁杆菌羊种,其中21株为羊种Ⅲ型,6株为羊种Ⅰ型。BCSP-31-PCR鉴定27株菌为布鲁杆菌;AMOS-PCR方法鉴定为羊种布鲁杆菌。27株布鲁杆菌对环丙沙星、左氧氟沙星、多西环素、庆大霉素、四环素、链霉素均敏感,其中多西环素MIC90为0.064 mg/L,有3株布鲁杆菌对利福平中等敏感（MIC 2 mg/L）。 结论布鲁杆菌分离株对WHO推荐的治疗布鲁菌病的抗菌药物体外实验普遍敏感。定期评估布鲁杆菌对抗菌药物的敏感性有助于进行流行病学调查及抗菌药物耐药性监测。     

应用多重聚合酶链式反应鉴别布鲁杆菌

目的 探讨应用多重聚合酶链式反应(Muhiple-PCR)进行布鲁杆菌株种型的鉴别.方法 以6株布鲁杆菌标准菌株(牛种、羊种、猪种、犬种、绵羊附睾种、沙林鼠种布鲁杆菌标准菌株)作为阳性对照,以大肠埃希菌O∶157和小肠结肠炎耶尔森菌O∶9作为阴性对照,待测布鲁杆菌株29株.先用布鲁杆菌属特异性聚合酶链式反应(BCSP31-PCR)扩增上述待测布鲁杆菌株,扩增结果为阳性的菌株再用Muhiple-PCR方法进行布鲁杆菌种型鉴别.结果 29株待测布鲁杆菌株BCSP31-PCR方法扩增均为阳性,进一步Multiple-PCR方法扩增均为阳性,其中有20株鉴定为羊种菌,5株鉴定为猪种菌、3株鉴定为牛种菌、1株鉴定为犬种菌.结论 Multiple-PCR方法是一种快速、特异、简便、低风险的布鲁杆菌种型鉴定方法.     

PCR技术鉴定布氏菌

目的用PCR技术检测鉴定羊种布氏菌和牛种布氏菌1、2、4型。方法根据文献发表的3对引物(简称B、M、A),用PCR技术对细菌DNA进行扩增,在属和种的水平上鉴定布氏菌。结果用B引物进行PCR扩增可以在属的水平上鉴别布氏菌,M引物可以鉴别羊种布氏菌,A引物可以鉴别牛种布氏菌1、2、4型和沙林鼠种。B、M、A 3对引物PCR鉴别结果与常规方法鉴定结果相符率分别为100%、92.0%和87.5%。结论PCR技术对细菌DNA进行扩增,可以在属和种的水平上鉴别布氏菌。布氏菌牛种9型的PCR扩增产物与布氏菌其他生物型有差异,说明牛种9型布氏菌在基因上不同于其他布氏菌。目前所用的表型分型技术存在着与本试验所用基因分型方法的不一致性。     

感染性心内膜炎患者血液中分离到羊种布鲁菌

目的从患者血液中分离出的病原菌进行生物学性状研究和种及型的临床鉴定;探讨布鲁菌病在热带海岛海南的流行特点。方法按布鲁菌标准鉴定方法进行细菌学实验(包括形态学、培养特性、生化特征、血清学试验和噬菌体试验等),并对患者的流行病学、临床资料、实验室资料进行系统分析。结果患者血液中病原微生物的形态学、培养特性、生化特征、血清学诊断和噬菌体诊断结果均符合羊种布鲁菌生物2型;与我国近几年分离到的羊种布鲁菌生物1型和3型相比明显不同;羊种布鲁菌尿素酶试验为不定(V),也没有强阳性的报告,而海南分离株为强阳性。结论海南省首次发现人布鲁菌病,由羊种布鲁菌2型引起。该病在海南省存在分散的点状流行,应引起医务人员及有关部门的重视。     

贵州省两株山羊源羊种布鲁菌MLST分析

目的了解贵州省2010年分离自山羊的两株羊种布鲁菌的等位基因序列型(Sequence type, ST)及遗传学特征,为动物间和人间布病疫情的预防和控制提供科学依据。方法应用布鲁菌属特异性PCR(BCSP31-PCR)和种/型特异性PCR(AMOS-PCR)对2010年分离自山羊的两株布鲁菌进行鉴定,采用多位点序列分型(Multiple locus sequence typing, MLST)技术对两株布鲁菌菌株的7个管家基因、1个外膜蛋白基因及1个基因间区的序列进行测定,将各个基因的序列与参考菌株的等位基因型进行比对,确定其等位基因谱及序列型(STs),分析与两株菌ST型与各种型布鲁菌代表菌株的遗传进化关系。结果来自贵州省山羊的两株布鲁菌株经BCSP31-PCR鉴定为布鲁菌属细菌,AMOS-PCR将其鉴定为羊种布鲁菌。MLST分析显示,两株菌的9个等位基因序列型为ST8型,与同属羊种布鲁菌的ST7、ST9~ST12、ST34和ST35遗传关系最近。结论贵州省2010年分离的2株布鲁菌分离株均为ST8型布鲁菌,与同属羊种布鲁菌的ST型遗传关系最近,结果为贵州省人间和动物间布病疫情的预防和控制提供了科学依据。     

内蒙古乌兰察布布氏菌分离株种型鉴定及流行病学特征分析

目的 鉴定临床分离布氏菌种型,并分析患者的流行病学特征。方法 以牛种、羊种、猪种标准参考菌株为试验对照,采用经典方法和VITEK2.0进行初步鉴定,用AMOS-PCR进行确证,并分析患者的流行病学特征。结果 经典鉴定115株均为羊种菌,羊3型93株,羊1型22株;115株菌ProA、TyrA、URE和GlyA全部阳性;91株ELLM阳性、14株APPA阳性,提示均为布氏菌,其中羊种菌91株,猪种菌14株。与经典实验的鉴定符合率比较鉴定布氏菌属100%,鉴定布氏菌种为79%(91/115);AMOS-PCR均获得了约731 bp的特异性扩增条带,证实全部为羊种菌。初诊患者84例,构成比为73%;临床表现以疼痛、发热、乏力、多汗居多;88例患者就诊前无用药史,2例有布病治疗史。结论 VITEK2.0是一种高效的布氏菌鉴定方法,但不能替代经典方法;羊种3型菌为该地区的主要流行菌种,再感染可能是慢性患者或有布病治疗史患者分离到布氏菌的主要因素,初诊、未用抗生素且症状典型是分离布氏菌的重要指标。     

内蒙古兴安盟地区蒙古族与汉族人群布鲁菌株分型及药敏对比研究

目的对蒙古族与汉族人群布鲁菌型和体外药物敏感性进行差异性分析。方法采集和培养蒙古族、汉族布病患者样本各24份,并用全自动细菌生化鉴定仪、H2S试验、噬菌体试验、抑菌试验及AMR凝集试验等方法进行种型鉴定,再用肉汤微量稀释法对48株布鲁菌进行11种药敏试验检测。结果内蒙古兴安盟地区主要流行布鲁菌种型为羊种3型,占67%(32/48),其次是羊种1型,占33%(8/24),其中蒙古族人群羊种3型株较多,占63%(20/48),而汉族人群羊种1型较多,占62%(10/16)。所有菌株均对多西环素等药物敏感,而对阿奇霉素耐药,复方新诺明部分耐药,且汉族患者人群耐药率33%(4/12)略高于蒙古族人群25%(3/12),对利福平、头孢曲松耐药率介于敏感与中介之间,不同族群间无明显差异。结论兴安盟地区主要流行羊种型布鲁氏菌,蒙古族与汉族人群体外药物敏感性无差异性。     

牛羊猪种布鲁氏菌快速鉴别PCR方法的建立及评价

目的 建立一种可在一个反应体系中同时鉴别布鲁氏菌及牛羊猪种布鲁氏菌的快速PCR鉴别方法。方法 将布鲁氏菌及牛羊猪种布鲁氏菌的扩增引物进行优化组合,建立全新的BAMS-PCR方法;随后对该方法的特异性和灵敏度进行评价,并对现场分离的219株布鲁氏菌进行鉴别,评价其在布鲁氏菌鉴别中的应用价值。最后,用该方法对临床标本中布鲁氏菌的DNA进行扩增,评价其在临床诊断中的实用性。结果 BAMS-PCR方法可在同一反应中同时鉴别布鲁氏菌及牛种(1,2,4型),羊种(1,2和3型)和猪种(1型)布鲁氏菌,并有较好的特异性和敏感性。布鲁氏菌属,牛种,猪种和羊种布鲁氏菌引物的检测灵敏度分别为10 pg/μL,100 pg/μL, 10 pg/μL和100 pg/μL。BAMS-PCR对219株临床分离菌株的鉴定结果和常规生物分型方法的鉴定符合率为100%。经BAMS-PCR检测,97份临床血清样本仅6份为阳性,全血和组织(羊脾)样本全部为阴性。结论 BAMS-PCR是一种简便、快速、高效、准确的布鲁氏菌鉴别方法,可作为临床分离菌株的首选鉴别方法。     

基于PGMY09/11引物的PCR法检测高危型HPV的效果观察

目的评估基于PGMY09/11引物的PCR法检测高危型人乳头瘤病毒（HPV）效果。方法采用HC II试剂盒和基于PGMY09/11引物的PCR技术检测感染HPV16的50份样品和感染HPV18的50份样品,样品模板DNA分别按照1∶1、1∶2、1∶4、1∶8和1∶16倍比稀释,比较2种方法检测的敏感性和一致性。同时采用HC II试剂盒和基于PGMY09/11引物的PCR技术检测感染单纯疱疹病毒（HSV）和沙眼衣原体（CT）的20份样品及单一感染HPV16和HPV18的10份样品,评估基于PGMY09/11引物的PCR检测HPV的特异性。结果 HC II试剂盒和基于PGMY09/11引物的PCR对1∶1、1∶2稀释的HPV16和HPV18的检出率均为100%;HC II对1∶4稀释的HPV16和HPV18的检出率为36%和46%,但不能检出1∶8和1∶16稀释的HPV16和HPV18样品;基于PGMY09/11引物的PCR对1∶4、1∶8和1∶16稀释的HPV16检出率分别为100%、90%和32%,对1∶4、1∶8和1∶16稀释的HPV18样品检出率分别为100%、86%和40%。HC II试剂盒和基于PGMY09/11引物的PCR对HPV16检测的整体一致性为84.1%（Kappa值为0.674）,对HPV18检测的整体一致性为81.7%（Kappa值为0.598）。基于PGMY09/11为引物的PCR方法不能检测HSV和CT合并感染。结论基于PGMY09/11为引物的PCR方法检测出高危型HPV具有较高的敏感性和特异性,与市售HC II试剂盒检测结果具有较高一致性,可用于HPV感染诊断。     

宁夏地区布鲁氏菌临床分离株OMP25基因序列特征分析

目的采用PCR法扩增宁夏地区布鲁氏菌临床分离株OMP25基因并测序,分析OMP25基因序列特征,为布鲁氏菌鉴定以及基因克降与表达研究提供参考。方法参考GenBank公布的布鲁氏菌外膜蛋白OMP25基因序列设计1对引物,采用PCR法从宁夏地区分离株布鲁氏菌基因组中扩增OMP25基因并进行双向测序,测序结果用Contig Express软件拼接,采用DNAstar软件进行分析。结果经鉴定,两分离株布鲁氏菌均为羊种3型,测序获得OMP25基因全长序列为638bp,编码212个氨基酸,核苷酸序列与GenBank公布羊种布鲁氏菌OMP25基因同源性为99．9％,氨基酸序列同源性为99．7%。系统进化树显示,分离株与参考株布鲁氏菌亲缘关系相近,与羊种布鲁氏菌为同一个分枝。结论宁夏地区布鲁氏菌分离株OMP25基因序列与参考菌株序列同源性高,且与羊种布鲁氏菌存同一分枝,表明OMP25基因序列是一个保守序列。该研究结果可为布鲁氏菌的分子生物学鉴定和诊断试剂的研制提供参考。     

山西省HBV基因型及亚型分布调查

目的了解山西省乙型肝炎病毒(HBV)的基因型及亚型分布情况。方法对136例乙型肝炎表面抗原(HBsAg)阳性者血清采用PCR-PFLP结合基因型特异性引物-PCR法进行HBV基因型及亚型检测。结果 136例HBV感染者的血清标本经PCR-PFLP分析,B基因型18例,均为Ba亚型,占13.2%;C基因型113例,占83.1%,除4例未分型外均为Ce亚型;D基因型5例,占3.7%。经型特异性引物-PCR分析,18例HBV B基因型中有4例为B/C基因型混合感染;5例经PCR-PFLP确定的D基因型病毒经型特异性引物法分析有2例扩增出E基因型条带。C、B基因型病毒感染者的平均年龄分别为(39.5±13.1)岁和(30.5±14.1)岁,差异有统计学意义(P<0.05);与B基因型相比,C基因型病毒感染者的HBeAg阴转率减慢。结论山西省HBV基因型主要为C(Ce),有少量的B(Ba)和D基因型,且存在B/C混合基因型,且可能存在D和E基因型病毒的重组体;与B基因型比较,感染C基因型病毒更难被机体清除,疾病更易慢性化。     

多重PCR快速检测恶性疟和间日疟的研究

目的 建立一种简便快速、能同时检测恶性疟和间日疟的核酸检测方法。方法 针对两种疟原虫18S rRNA基因设计2对(3条引物),优化引物浓度与退火温度,建立可扩增出两种疟原虫基因片段的多重PCR。并进行最低检测限确定和临床标本检测,以镜检法为金标准分析灵敏度和特异度等指标。结果 该方法可扩增出431 bp(恶性疟原虫)和341 bp(间日疟原虫)基因片段,最低检测限为10²copies/反应,检测临床标本的结果与镜检法无差别(P＞0.05),敏感度为93.55%,特异度为70.83%,阳性预测值为89.23%,阴性预测值为80.95%。结论 所建立的多重PCR方法可快速检测疟疾感染并鉴别分型,灵敏度高,值得推广。     

Leptospira DNA detection for the diagnosis of human leptospirosis

This study aims to analyse PCR applicability to the diagnosis of human leptospirosis and to compare the sensitivity of two primer pairs in urine and blood samples. PCR with G1/G2 and LP1/LP2 primers was specific and able to detect 10pg of DNA by agarose gel and 1pg by hybridization. Twenty-one serovars, representing 20 serogroups of pathogenic leptospires, were amplified with G1/G2 primers. DNA from two non-pathogenic serovars, Andamana and Patoc, was not amplified. For hybridization, one probe employing DNA from most prevalent leptospires (serovars Icterohaemorrhagiae, Copenhageni, and Autumnalis) was chosen in accordance with the microagglutination titres in patient samples. It was observed that not all serovars hybridized with the PCR products of G1/G2 and LP1/LP2 primer amplification, suggesting heterogeneity in the sequence amplified by these primers. G1/G2-primed amplifications of blood and/or urine samples were shown to be significantly more sensitive (57.6%) than the LP1/LP2 primers (33.3%), P=0.04, when positivity of patients is considered. When each primer pair and only urine samples were considered, PCR positivity was higher for G1/G2 primers than for LP1/LP2 (P=0.007). G1/G2 presented greater sensitivity in urine than in blood, and LP1/LP2 presented greater sensitivity in blood than in urine, although these differences were not statistically significant. The positivity of PCR per patient using both primers in blood and/or urine samples was 63.6%, with 84.4% efficiency. PCR was useful for patients without microagglutination detectable antibodies, for whom it was able to diagnose nine out of 11 patients (81.8%).     

快速检测牛羊猪种布鲁杆菌多重PCR的建立

目的 建立一种能同时快速检测并能鉴别牛、羊、猪种布鲁杆菌的多重PCR方法.方法 根据IS711插入序列设计1条公共引物和3条牛、羊、猪种布鲁杆菌(544A、16M、1330S)特有序列引物,进行多重PCR反应;选择耶尔森菌O:9、大肠埃希菌O157:H7、鼠伤寒沙门菌47729进行多重PCR反应的特异性检测;倍比稀释定量法观察牛种布鲁杆菌多重PCR反应的敏感性.结果 牛、羊、猪种布鲁杆菌多重PCR反应扩增片段产物长度分别为485、731、248 bp;耶尔森菌O:9、大肠埃希菌O157:H7、鼠伤寒沙门菌47729加入布鲁杆菌中进行多重PCR反应.扩增结果呈阴性;牛种布鲁杆菌多重PCR反应敏感性为0.0967 Pg.结论 成功建立快速检测牛、羊、猪种布鲁杆菌多重PCR扩增反应方法,且其特异性、敏感性较好.     

江西乙型肝炎病毒基因型分布及其与临床的相关性

目的了解江西慢性乙型肝炎患者血清乙型肝炎病毒（HBV）基因型的分布情况及HBV基因型与临床的关系。方法选择HBV DNA阳性的慢性乙型肝炎患者血清150份,患者分别诊断为慢性HBV携带者、慢性肝炎轻度、中度、重度和慢性重型肝炎,每组30例,采用多对型特异性引物巢式PCR法检测HBV基因型。结果本组慢性乙型肝炎患者HBV基因分型结果为B型118例（78．7％）,C型31例（20．7％）,D型1例（0．6％）;在上述5组患者中C型比例分别为0％,16．7％,26．7％,30．0％和30．0％,其中慢性HBV携带者与其他组比,差异有统计学意义（P〈0．05）;B、C两基因型患者HBeAg阳性率分别为83．9％（99／118）和90．3％（28／31）,HBeAb阳性率分别为16．1％（19／118）和9．7％（3／31）,差异均无统计学意义（P〉0．05）。结论江西地区HBV优势基因型以B型为主,C型次之,有少量的D型感染者。     

Novel PCR primers to diagnose visceral Leishmaniasis using peripheral blood,spleen or bone marrow aspirates

Objective: To establish a suitable method of diagnosis of visceral Leishmania sis(VL) using peripheral blood, spleen or bone marrow aspirates. Methods: Peripheral blood, bone marrow and spleen aspirate samples were collected from clinically suspected VL patients(n=26). A new PCR primer pair(MK1F/R) was designed targeting kinetoplast mini circle DNA sequences of Leishmania donovani, and Leishmania infantum, and was used to diagnose VL along with some other established primers for VL in polymerase chain reactions. Test was validated by comparing with several other diagnostic methods. Results: The designed primer set showed 100% specificity and 98% sensitivity in detecting VL using blood samples, when compared with more invasive samples: bone marrow or spleen aspirates. Conclusions: The newly designed primer MK1F/R could be a better alternative for PCR based diagnosis of VL using less invasive sample, peripheral blood instead of bone marrow or spleen aspirates.