多参数流式细胞术在儿童急性B淋巴细胞白血病微量残留病检测中的应用

目的:探讨多参数流式细胞术在儿童急性B淋巴细胞白血病微量残留病检测中的应用价值。方法:基于初诊儿童急性B淋巴细胞白血病相关的免疫表型,采用四色流式细胞术、CD45/SSC和CD45/CD19双参数散点图设门,以CD19-APC/CD45-PerCP/CD10-FITC/CD34-PE为主的抗体组合检测53例68份完全缓解后儿童急性B淋巴细胞白血病的微量残留病细胞。结果:53例初发儿童急性B淋巴细胞白血病检测出18种白血病相关的免疫表型,98.11%患儿存在CD45、CD10、CD19、CD34表达量的异常。12例存在0.012%～0.55%的白血病细胞,为微量残留病阳性,5例保持初诊时的免疫表型异常,7例发生免疫表型变化,占58.33%,只用CD19-APC/CD45-PerCP/CD10-FITC/CD34-PE一组抗体组合发现10例微量残留病阳性(83.33%)。结论:根据儿童急性B淋巴细胞白血病初诊白血病相关的免疫表型,用CD19/CD45/CD10/CD34为主的抗体组合能够有效监测微量残留病。     

四色流式细胞术检测急性B淋巴细胞白血病残留细胞

目的探讨利用多参数流式细胞术检测急性B淋巴细胞白血病(BALL)残留细胞的方法和意义。方法采用四色流式细胞术,以4～6组四色抗体组合检测213例BALL患者免疫分型;以CD34、CD10、CD45、CD19为主的2种四色荧光标记抗体组合监测50例297份BALL患者骨髓标本微量残留白血病细胞,同时检测分析26份化疗后处于再生期骨髓标本中B祖细胞的免疫表型特点,并以相对定量方法比较了再生期B祖细胞与B系白血病细胞CD10、CD19和CD34表达量的差异。结果213例BALL患者中,71.8%患者存在CD45、CD34、CD19、CD10表达量的异常,只存在CD38弱阳性及髓系标志患者占8.1%。微量残留白血病细胞监测的50例患者中,12例患者存在0.06%～7.73%的白血病细胞,其中11例残留白血病细胞以CD45、CD34、CD19、CD10异常表达为主。50例患者中5例临床复发,4例在复发前7～17周微量残留病(MRD)检测阳性,且均>0.1%,1例MRD检测阴性。再生期B祖细胞依据CD45、CD34、CD19、CD10、CD22和CD20表达不同可分为3期。结论多参数流式细胞术检测MRD具有快速、敏感可定量的优势,对白血病复发有更强的预测性。     

急性B细胞性白血性CD45阴性细胞的检测

目的 探讨细胞表面分化抗原４５阴性（ＣＤ４５）白血病细胞在急性Ｂ细胞性白血病微小残存病变监测中的意义。方法 利用３种不同荧光标记的单克隆抗体染凶及流式细胞仪检测２０例急性Ｂ淋巴细胞性白血病患儿和８名正常人骨骨ＣＤ１０和ＣＤ２２均阳性,ＣＤ阴性或弱阳性表现型细胞。结果 在２０例急性Ｂ细胞性白血病患儿中,均可检测到ＣＤ１０－Ｃ ８名正常人的ＣＤ１０－ＣＤ２２－ＣＤ４５表现型细胞表现频度均在０．００１％     

多参数流式细胞术对急性白血病微小残留病变的研究

目的探讨多参数流式细胞术检测外周血造血前体细胞的方法及其在急性白血病微小残留病变中的应用价值.方法单克隆抗体直接免疫荧光标记法和流式细胞仪多参数分析技术.结果淋巴细胞设门内各种造血前体细胞的参考值(1)CD34+总干祖细胞占0.16%±0.14 %,(2)髓系前体细胞CD34+/CD33+0.08%±0.06%、CD33+1.32%±1.28%、MPO+0 67%±0.88%,(3)淋巴系前体细胞CD45dim/CD19+0.75%±0.62%,CD45dim/CD10+0.45%±0.11%;CD45dim/CD7+0.24%±0.14%,CD45dim-/CD2+0.22%±0.13%.鉴别异常细胞的敏感度可达10-3,发现1例完全缓解期髓细胞性白血病患者外周血中髓系前体细胞有异常,3个月后临床证实复发.结论流式细胞术对正常人外周血中各系造血前体细胞的定性定量检测有可能用于急性白血病微小残留病变的检出和早期诊断复发.     

多参数流式细胞术分析415例成人和儿童B-ALL白血病相关免疫表型

为了探讨FCM在微量残留病（MRD）检测中的意义，利用4—6组4色抗体组合，以CD45／SSC设门法对273例成人和142例儿童B系急性淋巴细胞白血病（B—ALL）患者进行了多参数流式细胞术（FCM）免疫分型检测和白血病相关免疫表型（leukemia associated immunophenotyping，LAIP）分析。结果表明：根据CD34和CD10的表达特点，可将B—ALL患者分为Ⅰ型（CD34^＋CD10^-）；Ⅱ型（CD34^＋CD10^＋）；Ⅲ型（CD34-CD10^＋）；Ⅳ型（CD34^-CD10^-）。Ⅰ型和Ⅱ型患者LAIP的阳性比例分别为100％和92％，但Ⅲ型患者LAIP阳性率只有79．2％，显著低于Ⅰ型和Ⅱ型患者。总体B—ALL患者LAIP的检出率为90％，成人与儿童组无明显差异。而利用CD34／CD10／CD19／CD45一组抗体，LAIP检出率达到77．6％。结论：90％成人和儿童B-ALL白血病患者具有LAIP，因此对这类患者适宜用多参数流式细胞术进行MRD监测。     

恶性原始髓细胞CD34/CD56(N-CAM)表达对急性髓细胞白血病有检测微量残留病的意义

CD34/CD56是至今尚未研究的标记复合物。N-CAM是神经细胞粘附分子,有CD56抗原,正常时其出现于外周血中具有自然杀伤细胞活性的淋巴细胞上。已知一些急性髓细胞白血病细胞和未成熟白血病细胞系有CD56抗原,未发现CD34正常造血祖细胞有CD56抗原。 作者用免疫荧光双标记CD34和CD56,经流式细胞仪检测急性髓细胞白血病(AML)的微量残留病(MRD),发现此双标记表达于约20％的儿童AML白血病细胞,且与伴t(8;21)(q22;q22)核型     

白血病患儿骨髓及分离培养MSC的IL-6水平

目的研究不同白血病患儿骨髓上清的白介素-(IL-6)含量研究其在白血病患者中的分布特点,研究不同患者MSCs培养液上清IL-6的含量研究不同患者MSCs上清的分泌特点。方法白血病患儿骨髓中分离单个核细胞,体外培养间充质干细胞,用流式细胞仪鉴定MSC表面CD105、CD73、CD90、CD45、CD34、CD14、CD19、HLA-DR抗原鉴定,酶联免疫法检测非白血病和白血病儿童骨髓上清及骨髓分离培养的MSC上清中IL-6的含量。结果 MSC阳性表达CD90、CD105、CD73,而CD34、CD45、HLA-DR、CD14、CD19、CD79a、CD11b则呈阴性。不同性别、年龄儿童骨髓上清IL-6水平的差异无统计学意义;非白血病患儿与处于完全缓解期的白血病患儿骨髓IL-6水平的差异无显著性;初诊及骨髓未完全缓解的白血病患儿骨髓上清IL-6水平明显高于非白血病组及化疗后处于完全缓解期的白血病患儿(P0.05);初诊及骨髓未达完全缓解白血病患儿中急性髓细胞白血病患儿骨髓IL-6水平高于急性淋巴细胞白血病患儿(P0.05)。处于完全缓解期的不同类型白血病患儿骨髓IL-6水平无显著差异,骨髓缓解及未缓解的低、中、高危患儿IL-6水平均无统计学差异。结论急性白血病患儿的骨髓IL-6异常升高,与其白血病类型及肿瘤负荷有关联。     

急性淋巴细胞白血病的免疫分型及CD4+CD25+T调节细胞检测

背景:在急性淋巴细胞白血病发病过程中,CD4+CD25+T调节细胞对机体免疫反应可能起着一定的调节作用.目的:观察急性淋巴细胞白血病患者的免疫分型及外周血CD4+CD25+T调节细胞的变化情况.方法:采用流式细胞仪对35例急性淋巴细胞白血病患者进行免疫分型,并检测外周血CD4+CD25+T调节细胞的数目,与18名健康对照作比较.结果与结论:急性B细胞淋巴细胞白血病22例,急性T细胞淋巴细胞白血病13例;22例急性B细胞淋巴细胞白血病中CD19的阳性表达率最高(100%),而13例急性T细胞淋巴细胞白血病中CD7阳性表达率最高(100%).急性B细胞淋巴细胞白血病患者外周血CD4+CD25+T调节细胞和急性T细胞淋巴细胞白血病患者差异无显著性意义(P > 0.05),但均高于健康对照(P < 0.05).表明急性B细胞淋巴细胞白血病中CD19阳性表达率最高,急性T细胞淋巴细胞白血病中CD7阳性表达率最高,同时急性淋巴细胞白血病患者外周血CD4+CD25+T调节细胞水平显著增高.     

急性淋巴细胞白血病的免疫分型及CD4＋CD25＋T调节细胞检测

背景：在急性淋巴细胞白血病发病过程中,CD4＋CD25＋T调节细胞对机体免疫反应可能起着一定的调节作用。目的：观察急性淋巴细胞白血病患者的免疫分型及外周血CD4＋CD25＋T调节细胞的变化情况。方法：采用流式细胞仪对35例急性淋巴细胞白血病患者进行免疫分型,并检测外周血CD4＋CD25＋T调节细胞的数目,与18名健康对照作比较。结果与结论：急性B细胞淋巴细胞白血病22例,急性T细胞淋巴细胞白血病13例;22例急性B细胞淋巴细胞白血病中CD19的阳性表达率最高（100%）,而13例急性T细胞淋巴细胞白血病中CD7阳性表达率最高（100%）。急性B细胞淋巴细胞白血病患者外周血CD4＋CD25＋T调节细胞和急性T细胞淋巴细胞白血病患者差异无显著性意义（P〉0.05）,但均高于健康对照（P〈0.05）。表明急性B细胞淋巴细胞白血病中CD19阳性表达率最高,急性T细胞淋巴细胞白血病中CD7阳性表达率最高,同时急性淋巴细胞白血病患者外周血CD4＋CD25＋T调节细胞水平显著增高。     

哮喘患儿外周血淋巴细胞亚群的变化及其意义

目的探讨流式细胞仪检测哮喘患儿淋巴细胞亚群的变化及意义。方法采用三色免疫荧光标记法,应用流式细胞仪检测54例哮喘患儿及15名健康儿童外周血CD4^＋、CD8^＋、γ/δTCR^＋T细胞和CD19＋B淋巴细胞的比例,计算CD4^＋/CD8^＋比值,并进一步检测患者辅助性淋巴细胞（Th）1和Th2亚型的变化。结果与对照组相比,哮喘患儿CD4^＋T细胞比例、CD4^＋/CD8^＋比值均明显升高（P均〈0.05）;γ/δTCR^＋T细胞则明显降低（P〈0.01）;Th1细胞比例减少（P〈0.05）,Th2细胞增多（P〈0.01）。结论哮喘患儿外周血淋巴细胞亚群比例发生明显改变,CD4^＋T和Th2细胞比例增高以及γ/δTCR^＋T细胞降低是其特征之一;流式细胞仪检测可为哮喘病情监测和治疗方案拟定提供依据。     

CD10在儿童期B-急性淋巴细胞白血病中的表达特点及其在微小残留病检测中的意义

本研究的目的是观察CDl0在儿童期B急性淋巴细胞白血病(BALL)中的表达情况，并探讨CDl0在白血病微小残留病检测中的应用价值。用流式细胞术分析58例儿童期急性淋巴细胞白血病表型，观察CDl0在BALL病例骨髓细胞中的表达特点，并将CDl0抗体与其它多种抗体构成四色组合用于B-ALL的微小残留病检测，评价其所起到的作用。结果表明，65、5％(38／58)的BALL具有CDl0过强表达(CDl0^bright)的特点，而且CDl0^bright与CD34的阳性表达率有关——CDl0^bright多出现于CD34阳性率高的B-ALL中。CDl0^bright在微小残留病检测中，与其它异常表达的抗原形成的组合能够在双参数点图上很好地区分出白血病细胞群与正常细胞群。即使在其他抗原表达无异常时，也可因CDl0的过强表达而使白血病细胞群与正常细胞群区分开。结论：CDl0^bright与BALL中CD34的高比例表达相关，CDl0^bright也是微小残留病检测的一个很好的指标，CDl0的表达与其他用于微小残留病检测的抗原表达的应用有互补作用。     

探讨流式细胞术检测胞浆抗原的方法及其在白血病免疫分型中的意义

为探讨用流式细胞术检测胞浆抗原的方法及其在免疫分型中的意义，采用三色或四色直接免疫荧光标记法检测56例患17种膜抗原表达，并采用4种透膜剂处理细胞后用流式细胞仪测定胞浆（c)CD3,CD22,CD79a，CD13，CD33及髓过氧化物酶（MPO）的表达。结果显示，用FACS透膜液处理细胞后，胞浆抗原的阳性百分比最高，而细胞的光散射（SSC）及CD45的荧光强度不变。18例急性髓细胞白血病（AML）患，16例MPO阳性；4例T－ALL患，虽然膜cCD3阴性，而胞浆cCD3均为阳性；13例B－ALL患中，9例cCD22阳性。对5例B－ALL检测了cCD79a，结果全部阳性。38例急性白血病（AL）患中，18例表达1个系列以上的膜标记；在21例急性非淋巴细胞白血病（ANLL）患中，8例表达CD7；17例ALL中，7例CD13阳性。经胞浆抗原检测后，只有2例分别符合双表型和混合型AL特点，提示cCD3,cCD22,cCD79a和cMPO为系列特异性标志，对诊断及鉴别双表型或双克隆AL尤为重要。     

Terminal transferase surveillance of remission bone marrows in childhood acute lymphoblastic leukemia: improved sensitivity with countercurrent centrifugal elutriation

In an attempt to better define hematologic remission and relapse in children with TdT positive acute lymphoblastic leukemia (ALL), 101 bone marrow (BM) aspirates were obtained from 74 pediatric patients. The mononuclear cell population of these specimens was isolated using countercurrent centrifugal elutriation (CCE) and characterized by an immunofluorescent terminal deoxynucleotidyl transferase (IF-TdT) assay. Twenty-two children with non-leukemic disorders had a median of 8% (range 0-34%) TdT positive mononuclear bone marrow cells. This was similar to values obtained for 25 children with ALL off therapy and in remission (median 10%, range 1-22%) and 16 children with ALL on continuous anti-leukemic therapy and in remission (median 7%, range 1-26%). Twenty-three BM samples were obtained from 11 children in early or high risk to relapse because of increased immature cells on a routine marrow examination or previous relapse(s). Samples from the early and high risk to relapse groups contained a median of 56% (range 25-80%) and 39% (range 25-72%) TdT positive cells. In contrast, the median percent marrow lymphoblasts identified using standard morphologic criteria for these 2 groups was 12.5% (range 9-23%) and 3% (range 0-5%), respectively. All high risk patients relapsed in their BM 1-4 1/2 months after these TdT determinations. Longitudinal studies in 4 patients at increased risk to relapse consistently demonstrated elevated percentages of TdT positive cells while morphologic surveillance was inadequate in establishing a clinical diagnosis of leukemic relapse. CCE in combination with an IF-TdT assay may enhance detection of recurrent and/or residual leukemia in BM samples from children with TdT positive ALL.     

多参数流式细胞术在白血病免疫分型中的应用探讨

目的 探讨多参数流式细胞术(FCM)在白血病免疫分型中的应用.方法 利用CD45/SSC 设门的四色荧光FCM检测339例白血病患者骨髓细胞表面标记.结果 339例白血病中急性髓系白血病(AML)150例,占44.2%,髓系抗原表达率以CD33(86.7%)最高,其余从高到低依次为CD117、CD3、cMPO、CD15.淋巴细胞性白血病183例,占54.0%,其中急性B淋巴细胞白血病(ALL-B)110例、急性T淋巴细胞白血病(ALL-T)27例、慢性淋巴细胞白血病(CLL)46例.ALL-B淋巴系抗原表达率以CD19最高,其余由高到低依次为cCD79a、CD10、CD22、CD20,ALL-T淋巴系抗原表达率以CD7最高,其余由高到低依次为CD2、CD5、CD3.髓系白血病中常见交叉表达淋巴系抗原CD56、CD7、CD9.ALL中常见交叉表达髓系抗原CD13、CD33,CD14的表达与单核细胞白血病相关.结论 应用多参数FCM能对白血病进行分型,对于白血病的诊断治疗和预后判断均有重要价值.     

50例成人急性淋巴细胞白血病免疫表型分析

目的研究成人急性淋巴细胞白血病(ALL)的免疫表型特征,并分析免疫表型与细胞形态学及细胞遗传学的关系。方法应用一组系列相关单克隆抗体和CD45／SSC设门的三色流式细胞术对50例初治成人ALL进行免疫表型研究。结果 50 例ALL中42例B系来源,5例T系ALL,3例T／B混合型ALL。27例伴有髓系抗原表达(54％),髓系抗原主要表达CD13、CD33。大部分病例(90％)幼稚细胞均出现CD45的缺失及弱表达。细胞学形态学分析发现所分析病例中FAB-L1占多数(67％)、L2 27 ％。2例L3其免疫表型为B-祖细胞及成熟B细胞表型。20例存在染色体异常,其中6例染色体数目异常,涉及的异常为 8、-X、-7、-11、-4、、6和、13。染色体结构异常最多见为t(9;22),且均伴有髓系抗原的表达。结论 ALL免疫表型不是单独的诊断标准,其与细胞形态学及遗传学密切相关。     

Minimal residual disease monitoring by flow cytometry in children with acute lymphoblastic leukemia

The cells that have avoided the action of antitumor drugs may be retained after remission achievement during induction therapy and consolidation. A combination of these cells is given the name minimal residual disease (MRD). Multicolor flow cytometry has recently attracted considerable interest as the most promising method for measuring the content of residual tumor blasts. This technique is based on the detection of the so-called leukemia-associated immunophenotype (LAIP), i.e., a tumor-specific combination of the expression of membrane and cytoplasmic markers. Flow cytometry may be successfully used to monitor MRD in 90-95% cases of acute lymphoblastic leukemia (ALL) and in 80-85% of patients with acute myelocytic leukemia. The sensitivity of flow cytometry, which is real for routine flow techniques, is a possibility of identifying one cell among 10(4)-10(5) cells. Multicolor flow cytometry (that involves the simultaneous analysis of the expression of a few markers) is the most reasonable tool for MRD monitoring. The monoclonal antibody panels recommended by different groups of investigators for MRD monitoring in B-lineage ALL include antibodies to the pan-B-cell antigen CD19, markers of different stages of differentiation of B-lineage precursors of CD10, CD34, and CD20 and leukemia-associated markers different for each panel, such as CD22, CD38, CD58, CD45, TdT, CD13, CD33. The hyperexpression of CD10, CD34, CD19, TdT, the decreased expression of CD38, CD45, CD22, CD19, the simultaneous expression of markers of different stages of differentiation of B lymphocytes, such as CD10 and CD20, and the lymphoblast coexpression of myeloid markers of CD13, CD33, CDS15 are the most frequently described immunophenotype aberrations in B-lineage ALL. The selection of combinations of markers for MRD monitoring in children with T-ALL is based on the simultaneous expression of combinations of the antigens characteristic for early stages of differentiation of normal T lymphocytes, namely TdT and cytoplasmic CD3. Some authors consider the use of CD99 versus TdT to be most appropriate. There is recent evidence that MRD-positive patients have a higher cumulative risk for recurrences as compared with those without residual blasts. Moreover, the longer the tumor cells are retained during therapy, the worse the prognosis is. Thus, for choice of the adequate intensity of antitumor therapy, it is necessary to qualitatively and quantitatively assess MRD by multicolor flow cytometry at different stages of therapy.     

Ph+/bcr-abl+急性淋巴细胞白血病微小残留病变的细胞遗传学分析、巢式RT-PCR及流式细胞术检测

为了探索检测Ph^ ／bcr-abl^ 急性淋巴细胞白血病(ALL)患的微小残留病变(MRD)的简便而灵敏的方法，对84例初治ALL患和其中的缓解期患的骨髓分别用细胞遗传学、流式细胞术和巢式RT—PCR检测。结果表明，缓解期患骨髓中不存在Ph^ 染色体，巢式RT-PCR方法检测到1l／14例缓解期患存在MRD(bcr-abl融合基因)(阳性率78．57％)，而流式细胞术检测到5／14的缓解期患阳性(阳性率35．71％)。巢式PCR的灵敏度达到10^-6-10^-7水平，流式细胞检测的灵敏度达到10^-4-10^-5水平。结论：Ph染色体核型分析技术检测MRD不够灵敏，而巢式RT—PCR检测MRD较流式细胞技术检测灵敏度更高，且更易于开展应用。     

可移植性人髓系白血病BALB/c小鼠模型建立

造血干/祖细胞移植已成为迄今为止治疗恶性血液病等最有效措施,而建立骨髓型可移植性白血病小鼠模型将为造血干细胞移植治疗白血病提供实验用动物模型。本实验用K562细胞接种BALB/c裸鼠产生红白血病的小鼠模型。将4-5周龄雌性BALB/c裸鼠,腹腔连续两天注射环磷酰胺(CTX)2mg,第3天腹腔或尾静脉直接接种K562白血病细胞2×105-2×106/只。定时取小鼠尾静脉外周血、骨髓细胞用流式细胞术和RT-PCR分别检测CD45,CD13,CD33抗原及bcr/abl融合基因。结果显示,4-5周龄BALB/c裸鼠无论通过腹部或尾静脉接种,无论有无CTX预处理,当接种K562细胞数大于2×105/只时,均可在BALB/c裸鼠身上产生可移植性人髓系白血病,荷瘤小鼠可存活30-60天。结论:腹腔或尾静脉接种大于2×105细胞/只均可产生人髓系白血病荷瘤小鼠模型,有无CTX2毫克/只的预处理不影响4-5周龄BALB/c裸鼠产生人白血病模型。