全骨髓法培养SD大鼠骨髓间充质干细胞及其生物学特性

目的建立一种体外纯化及培养扩增SD大鼠骨髓间充质干细胞（MsCs）的简便有效方法。方法全骨髓法分离培养SD大鼠MSCs,通过体外培养和连续传代达到纯化和扩增MSCs目的。倒置显微镜下观察细胞形态变化情况：利用四唑盐比色（MTT）法测定MSCs的生长曲线：流式细胞仪（FCM）鉴定MSCs膜抗原。结果SD大鼠胫骨全骨髓细胞在分离后与含10％优质胎牛血清DMEM培养基混合,约5-10min后即可见大量有核细胞贴壁,细胞形态为圆形,24-48h后可见贴壁细胞转变为椭圆形、多角形及短梭形,7-12d时细胞呈长梭形并达到90％单层融合。通过传代细胞进一步纯化及扩增。细胞传代后2d内处于潜伏期,3d后进入生长期,5d后进入平台期。FCM检测第4代MSCs膜表面抗原CD45、CD90、CD29阳性率分别为1．50％、99．18％、97．70％。结论SD大鼠全骨髓贴壁法能有效得到分离纯化的MSCs,用此方法培养的SD大鼠MSCs生长稳定,增殖能力活跃,具有MSCs的一般生物学特性,可以为组织工程提供理想的种子细胞。为本实验研究打下基础。     

大鼠骨髓间充质干细胞生物学特性及分化潜能研究

目的建立一种体外分离、培养和扩增大鼠骨髓间充质干细胞的方法.探讨体外培养骨髓间充质干细胞的一些生物学特性,为利用MSCs进行多种疾病的细胞治疗提供实验基础. 方法分离6～8周龄的大鼠胫骨、股骨,用DMEM/F12培养基冲出骨髓,采用Percoll淋巴细胞分离液获得骨髓中的单个核细胞,并结合MSCs的贴壁特性,获得大鼠MSCs,体外扩增.体外进行多向诱导分化鉴定分离的细胞,并测定传代细胞的生长曲线、观察其接种贴壁率、检测细胞周期和超微结构.结果体外培养的MSCs生长状况良好,并能迅速扩增,具有分化形成成骨和成脂肪细胞的能力;MSCs倍增时间约为28.8h;传代后10h贴壁达95.5% 以上;细胞周期显示有92%细胞处于G0/G1期;电镜显示的结果进一步证实MSCs具备了干细胞的结构特点.结论在本实验条件下,体外培养的MSCs具有多向分化潜能,体外生长稳定,传代后的细胞适应性强,增殖较快,超微结构和细胞周期表现出较早期细胞特点.使干细胞用于移植治疗、基因治疗成为可能.     

大鼠骨髓间充质干细胞的分离培养及表型和功能特点

目的 建立体外分离纯化、培养扩增大鼠骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells，MSCs)的方法，探讨其表型和功能特点。方法 用密度梯度离心结合贴壁培养法分离纯化大鼠骨髓MSCs，传代扩增，测定生长曲线，通过形态学观察，细胞化学及免疫细胞化学法分析大鼠骨髓MSCs的表型和功能特点。结果 MSCs属骨髓中单个核细胞，密度梯度离心结合贴壁培养法能有效分离纯化大鼠骨髓MSCs，在含10％小牛血清的L-DMEM中，1、3、5代细胞生长曲线基本相同，增殖快，每传代一次细胞约增加2．2倍。细胞呈均一的成纤维细胞样，表达CD44、CD54、纤维粘连蛋白(fibronectin，FN)、Ⅰ型胶原(collagenⅠ)。加入地塞米松(Dex 10^-8mol／L)、β-甘油磷酸钠(β-GP 10mmol／L)、抗坏血酸(AA50μg／ml)可诱导MSCs分化为成骨细胞，碱性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)活性增高，形成矿化结节。结论 所分离、培养的细胞具有间充质干细胞的表型和功能特点，建立了体外分离纯化、培养扩增大鼠骨髓MSCs的方法。     

培养基对兔骨髓间充质干细胞体外扩增的影响

目的考察含10％胎牛血清的高糖DMEM培养基(DMEM HG, 10％FBS)、10％胎牛血清的低糖DMEM培养基(DMEM LG,10％FBS)、15％胎牛血清的低糖DMEM培养基(DMEM LG, 15％FBS)、20％胎牛血清的低糖DMEM培养基(DMEM LG, 20％FBS)对兔骨髓间充质干细胞体外贴壁、扩增的影响。方法① 选2月龄的新西兰大白兔,股骨转子间区抽取骨髓利用密度梯度离心贴壁法分离纯化细胞,体外培养。选取传代第一代骨髓间充质干细胞 (passenger one, P1)分别用以上4种细胞培养基培养,测细胞扩增倍数;② 选取传代第二代骨髓间充质干细胞(passenger two, P2)分别将以上4种细胞培养基混悬液接种于24孔板中,观察细胞生长状态并测生长曲线;③ 选取4种培养基中培养效果最好的一组细胞,以密度0.5×104/mL接种于24孔板中,成骨诱导,茜素红染色测其矿化能力。结果DMEM LG(15％FBS) 组中细胞扩增倍数为(16.20±1.60)倍,细胞集落形成数为6.11±1.17,与其它组比较差异有统计学意义（P＜0.05）,并矿化能力最强。结论DMEM LG (15%FBS)培养基较其他3种培养基更符合兔骨髓间充质干细胞体外扩增培养的条件,且更好的保持了细胞的正常形态和生物活性。     

慢性高原病患者骨髓间充质干细胞的体外扩增及鉴定

目的探讨慢性高原病（chronic mountain sickness,CMS）患者骨髓间充质干细胞（mesenchymal stem cell,MSCs）的体外培养方法、生物功能及分子生物学特征。方法采用密度梯度离心和贴壁筛选法对15例CMS患者（CMS组）和15例正常人（对照组）骨髓MSCs进行分离培养,于倒置显微镜下观察MSCs形态,用流式细胞仪行细胞表面抗原检测,检测MSCs生长情况,测定生长曲线。结果采用密度梯度离心法分离骨髓单个核细胞（BMMNC）后培养,骨髓MSC均分离培养成功,贴壁细胞呈梭形;两组骨髓MSCs均表达CD29、CD105和CD13,不表达CD45、CD4、CD8、CD14、CD3、CD34、HLA—DR和CD20。CMS组MSCs增殖能力高于对照组（P〈0．01）,但传代率低于对照组（P〈0．05）,对P3代细胞生长曲线进行观察发现CMS骨髓MSCs生长较对照组活跃。结论CMS患者骨髓MSCs在体外可有效分离培养,所培养扩增的细胞成分单一,CMS患者骨髓MSCs具有其特有的生物学特性。     

补肾壮骨颗粒含药血清对骨质疏松大鼠骨髓间充质干细胞增殖的影响

目的:探讨补肾壮骨颗粒含药血清对去卵巢骨质疏松大鼠骨髓间充质干细胞(MSCs)体外增殖的影响。方法:选用10只6月龄SD大鼠去卵巢制作骨质疏松模型,对骨质疏松骨髓间充质干细胞进行分离和体外培养,传代后的MSCs分为OP组、OP+补肾壮骨颗粒含药血清组和OP+空白血清组,倒置显微镜观察各组MSCs的生长情况,进行形态学观察,并用四甲基偶氮唑蓝(MTT)法测定生长曲线。结果:OP+含药血清组,MSCs呈典型的集落生长,细胞呈长梭形,突起细长且多,细胞增殖较旺盛,细胞数量不断增加,随着传代次数的增多,细胞增殖速度减慢。OP组及OP+空白血清组MSCs接种后胞体立体感下降,体积较大,细胞偏圆形,突起收缩,增殖速度较慢,细胞数量减少;随着传代次数的增多,细胞增殖速度显著减慢。OP+补肾壮骨颗粒含药血清组骨髓间充质干细胞增殖能力明显提高,生长曲线有显著性差异。结论:补肾壮骨颗粒含药血清能促进去卵巢骨质疏松大鼠MSCs的增殖。     

大鼠骨髓间充质干细胞的无血清培养与鉴定

目的探索大鼠骨髓间充质干细胞(MSCs)的体外分离纯化、培养、扩增及鉴定方法,为MSCs后续研究提供种子细胞。方法采用Percoll密度梯度离心法和贴壁法相结合分离纯化MSCs并传代,在无血清组和有血清组培养基DMEM/F12中培养,传代扩增。倒置相差荧光显微镜下观察两组细胞生长特性和形态,采用MTT(噻唑蓝)法检测增殖水平并绘制生长曲线,检测两组细胞周期。分别取两组细胞第三代MSCs,采用流式细胞仪检测细胞表型。结果无血清组培养基培养9~10 d有明显的细胞丛生长,略晚于有血清组的7~8 d;MTT测定生长曲线显示两组细胞增殖能力相似;流式细胞仪检测两组培养方式下细胞均表达CD29、CD54,不表达CD34、CD45;细胞周期检测显示无血清组G0/G1期细胞为68.0%,明显高于有血清组的46.4%,两组差异有显著性。结论无血清培养基的条件能较好地使细胞处于G0/G1期,保持更好的分化潜能及干细胞特性。     

人骨髓间充质干细胞分离培养及生物学特性研究

目的 探讨体外培养骨髓间充质干细胞的一些生物学特性，为利用MSCs进行疾病的细胞治疗提供实验基础。方法 密度梯度离心，贴壁培养和消化时间控制相结合，分离纯化人骨髓间充质干细胞，并用马血清诱导分化为脂肪细胞。结果 分离获得了高纯度贴壁生长的MSCs。MSCs原代培养呈均匀分布的集落样生长，呈梭形。细胞传代稳定，在体外连续传代培养9代，未发生形态学改变，无衰老征象；传代培养MSCs（P3）在20％马血清的L—DMEM培养液中分化为脂肪细胞。结论 采用Percoll细胞分离液密度梯度离心，贴壁培养和消化时间控制相结合，可以获得纯度较高和活性骨髓MSC，是简便有效使用可行的方法；骨髓MSCs体外增殖和传代能力强，通过离体培养可使体内环境下低丰度的MSCs实现数量扩增；     

大鼠骨髓间充质干细胞的分离纯化与成骨鉴定

[目的] 研究大鼠骨髓间充质干细胞 (MSCs) 的分离纯化和在诱导条件下的成骨能力.[方法] 取SPF级SD大鼠6只,采用全骨髓贴壁培养法分离成年大鼠骨髓间充质干细胞,取传至第3代的MSCs进行细胞形态和免疫组化鉴定;应用含地塞米松、B-甘油磷酸钠和维生素C的诱导分化培养液诱导传代细胞向成骨细胞分化,检测碱性磷酸酶 (ALP) 的活性和细胞矿化作用进行成骨细胞鉴定.[结果] 全骨髓贴壁培养法能有效分离纯化大鼠骨髓MSCs,MSCs 在含体积分数为10%胎牛血清的低糖 DMEM(L-DMEM) 养液中生长性状相对稳定,增殖速度快;诱导条件下,细胞ALP活性明显增高,并出现了矿化结节.[结论] 建立了一种体外分离纯化、培养扩增大鼠骨髓 MSCs 的方法,成骨能力肯定,为中药蛋白质组学研究提供材料基础.     

改良法分离培养大鼠骨髓间充质干细胞的实验研究

目的：改良大鼠骨髓间充质干细胞（MSCs）原代分离方法,探讨大鼠MSCs体外培养的适宜条件。方法：比较改良与传统单纯贴壁培养法、密度梯度离心法结合贴壁分离法分离培养大鼠MSCs,观察不同方法获得原代细胞形态及不同代MSCs的生长曲线,流式细胞仪检测细胞表面标记,同时观察不同浓度的胎牛血清（FBS）对MSCs生长曲线的影响。结果：改良单纯贴壁培养法获得的原代细胞贴壁时间早、生长快,与其他两种分离方法差异明显（P〈0.01）;原代MSCs用15％的FBS培养,其增殖明显高于5％、10％及20％的FBS培养;第3代以后MSCs用5%的FBS培养有力于细胞纯化。结论：成功地改良了分离培养大鼠MSCs的方法,配合不同血清浓度培养基可使收获MSCs效率增高。     

苦参碱对兔晶状体上皮细胞内胶原合成的影响

目的探讨苦参碱（Mat）对体外培养的兔晶状体上皮细胞（RLECs）内Ⅰ型和Ⅲ型胶原蛋白合成的影响。方法 RLECs培养后分为3组：空白对照组以DMEM为培养基;重组人表皮生长因子（rhEGF）组以DMEM＋50μg/L rhEGF为培养基;Mat组以含50μg/L rhEGF和1.0 g/L Mat的DMEM为培养基。利用50μg/LrhEGF诱导RLECs增殖,加入1.0 g/L Mat培养24 h后,采用酶联免疫吸附测定法（ELISA）检测RLECs内Ⅰ型和Ⅲ型胶原蛋白表达。结果 50μg/L rhEGF作用后,RLECs内Ⅰ型和Ⅲ型胶原蛋白浓度分别为57.65±4.54μg/L和1.59±0.19μg/L,较空白对照组明显升高（P〈0.01）。Mat作用后,RLECs内Ⅰ型和Ⅲ型胶原蛋白浓度分别为21.74±3.96μg/L和0.56±0.21μg/L,较rhbFGF组和空白对照组明显下降（P〈0.01）。结论 Mat能抑制体外培养的RLECs内Ⅰ型和Ⅲ型胶原蛋白的合成。     

碱性成纤维细胞生长因子和地塞米松联合诱导骨髓间充质干细胞的增殖和成骨分化

目的:研究碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)和地塞米松联合对骨髓间充质干细胞(BMSCs)增殖和成骨分化的影响。方法:以第三代BMSCs为实验材料,分别给予10%FBS的DMEM培养基,含80μg/LbFGF的10%FBS的DMEM培养基,含bFGF80μg/L+地塞米松10-8mol/L+β-甘油磷酸钠10mmol/L+维生素C50mg/L的10%FBS的DMEM培养基处理,通过计数BMSCs细胞数评价其增殖能力,同时行碱性磷酸酶(ALP)活性检测及茜红素染色评价其成骨分化的能力。结果:与对照组相比较,bFGF可以显著提高骨髓间充质干细胞的增殖能力,bF-GF和地塞米松联合不仅促进了骨髓间质干细胞的增殖,而且促进碱性磷酸酶的表达和钙结节的形成。结论:bFGF和地塞米松联合促进了骨髓间充质干细胞的增殖和成骨分化。     

当归对人脐血间充质干细胞增殖的影响

目的:探讨当归对人脐血间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)增殖的影响及当归诱导后脐血间充质干细胞nestin变化情况。方法:无菌条件下收集新生儿脐血,以Ficoll-Hypaque淋巴细胞分离液密度梯度法分离单个核细胞(mononuclear cells,MNCs)。分离获得的MNCs采用DMEM/F12培养基/10%胎牛血清进行MNCs培养传代。向培养基内加入1μl/ml当归注射液,分为两组,阳性对照组为加当归注射液,阴性对照组不加当归注射液,进行台盼兰染色活细胞计数,以平均数为结果分别绘制两组的细胞生长曲线。对人脐血间充质干细胞进行神经标志物nestin的免疫组化检查。结果:阳性对照组脐血MSCs细胞生长曲线比阴性对照组高,在体外应用当归诱导后表达nestin。结论:当归注射液有促进脐血MSCs分化增值的作用,脐血MSC具有较强的可朔性,当归在体外使脐血间充质干细胞nestin表达增高。     

大鼠骨髓间充质干细胞体外分离培养的实验研究

目的:探讨大鼠骨髓间充质干细胞(MSCs)体外分离、培养的适宜条件。方法:采用密度梯度离心法结合贴壁分离法分离培养大鼠骨髓MSCs,观察其形态,流式细胞仪检测细胞表面标记,MTT法观察不同浓度的胎牛血清(FBS)对MSCs生长曲线的影响及不同代MSCs的生长曲线和细胞贴壁率。结果:大鼠MSCs呈梭形或纺锤形,CD34、CD45表达阴性,CD44表达71.5%、CD166表达83.2%;MSCs用10%的FBS培养,其增殖明显高于用无血清、5%及20%的FBS培养;第1、3、5、10代MSCs的生长曲线及细胞贴壁率无明显差异(P>0.05)。结论:密度梯度离心法结合贴壁分离法适于大鼠MSCs的分离;10%的FBS适合MSCs的培养;早期传代对MSCs的增殖无影响。     

血管内皮生长因子基因转染骨髓间充质干细胞对慢性肾衰竭大鼠血管新生的影响

目的：探讨血管内皮生长因子（ vascular endothelial growth factor , VEGF）基因转染骨髓间充质干细胞（ mesenchy-mal stem cells,MSCs）对慢性肾衰竭（chronic renal failure, CRF）大鼠肾小球内皮细胞修复和血管新生的影响。方法体外分离、培养大鼠MSCs,Ad5-hVEGF-EGFP转染MSCs并观察转染对细胞增殖,分泌VEGF的影响。50只雄性SD大鼠按数字表法随机分为假手术组、慢性肾衰竭组、MSCs移植组、Ad-VEGF注射组和VEGF基因转染的MSCs移植组,每组10只。采用分阶段5／6肾切除术制备大鼠慢性肾衰竭动物模型。假手术组与慢性肾衰竭组于切除右肾之前从该侧肾动脉注射不含血清的改良杜氏伊格尔（DMEM）培养液,其余3组分别给予MSCs,Ad-VEGF和VEGF基因转染的MSCs。8周后检测各组大鼠肾功能,并用免疫组化检测肾小球CD31表达情况。结果 Ad5-hVEGF-EGFP转染后对MSCs细胞增殖无影响,转染后分泌VEGF蛋白较空质粒转染组明显增加（P＜0.05）。 MSCs移植组和VEGF基因转染的MSCs移植组血肌酐（Scr）和尿素氮（BUN）均较慢性肾衰竭组降低（P＜0．05）;与MSCs移植组比较,VEGF基因转染的MSCs移植组Scr和BUN降低更显著（P＜0．05）。慢性肾衰竭组肾小球中CD31表达较假手术组显著降低（P＜0．05）,应用MSCs和VEGF165基因转染的MSCs干预后肾小球中CD31表达有所增加,VEGF基因转染的MSCs组增加更明显（P＜0．05）。结论慢性肾衰竭大鼠给予转染VEGF基因的MSCs移植后毛细血管内皮细胞数量增多,肾脏功能改善;其作用可能与基因转染增加VEGF表达及有利于肾小球毛细血管内皮修复、血管新生有关。     

阿奇霉素对哮喘大鼠气道平滑肌细胞生长的影响

目的 探讨阿奇霉素对哮喘大鼠气道平滑肌细胞（ASMCs）增殖的影响.方法 将20只SD大鼠随机分为对照组和哮喘组（哮喘组制备大鼠哮喘模型后,随机分为不同剂量的阿奇霉素组）,采用CCK-8法测定不同剂量的阿奇霉素组对哮喘大鼠气道平滑肌细胞的药物毒性反应,并分别采用琼脂糖凝胶电泳检测法和激光共聚焦显微镜观察法观察阿奇霉素各组的细胞凋亡情况,同时采用划痕法检测各阿奇霉素组平滑肌细胞的迁移能力.结果 （1）各剂量阿奇霉素组哮喘大鼠气道平滑肌细胞的生长率分别为（72.71±13.16）%、（66.42±4.90）%、（64.92±2128）%、（51.45±2.83）%;（2）与对照组比较,阿奇霉素各组均可以检测到气道平滑肌细胞染色体DNA发生片段化降解;（3）阿奇霉素各组均可显示典型的细胞凋亡形态学特征;（4）划痕法结果显示：阿奇霉素组的迁移数目和距离均较10%FBS血清刺激组减少和缩短（均P〈0.01）.结论 阿奇霉素可抑制哮喘大鼠气道平滑肌细胞增殖、迁移,促进细胞凋亡.     

烧伤患者血清对骨髓间充质干细胞生物学特性的影响

目的:探讨烧伤患者血清对体外培养的骨髓间充质干细胞的生物学行为的影响。方法:培养BM-MSCs,传代后分别用含有体积分数为10%正常人血清、烧伤患者血清的低糖达氏修正依氏培养基培养,用噻唑蓝(MTT)法测定其生长曲线,碘化丙啶(PI)染色,流式细胞仪分析细胞周期、β-gal染色测定衰老的MSCs。结果:含正常血清培养基传代培养的细胞生长曲线较烧伤患者血清慢,烧伤患者血清处理的细胞中G0/G1期细胞比例明显低于正常血清组(P<0.01),β-gal染色阳性细胞数目显著低于正常血清组。结论:烧伤患者血清比正常血清能更好地促进BM-MSCs生长;烧伤血清内可能含有多种能影响BM-MSCs生长的物质。     

外源性骨形态发生蛋白7联合血管内皮生长因子诱导大鼠脂肪干细胞向成骨细胞分化的实验研究

 目的探讨脂肪干细胞经低浓度骨形态发生蛋白7（BMP-7）及血管内皮生长因子（VEGF）短期诱导后骨细胞方向的分化情况。方法无菌切取成年Wistar大鼠腹股沟处脂肪,砖型胶原酶消化法体外分离培养脂肪干细胞,分为4 组：各组均加入含10%FBS 的DMEM培养基,0.1 μmol/L地塞米松,50 μmol/L 维生素C,10 mmol/L β-甘油磷酸钠,100 U/mL 青霉素,100 U/mL 链霉素;在此基础上,第1 组加BMP-7 和VEGF（各5 ng/mL）;第2 组加BMP-7（10 ng/mL）;第3 组加VEGF（10 ng/mL）;另设第4组（空白组）,加高糖DMEM。每3 d 更换培养基。至1,5,7,10,14 d 观察细胞生长及转化情况,通过免疫组化、ALP 染色、茜素红钙结节染色及MTT等检测不同组别诱导的成骨细胞。结果细胞计数、MTT、ALP 活性检测及免疫组化灰度值检测证实4 组诱导液诱导脂肪干细胞向成骨细胞分化的能力：BMP-7+VEGF组>BMP-7 组>VEGF组>空白组。结论与单独使用BMP-7、VEGF或基础培养基相比,BMP-7 联合VEGF 有加快脂肪干细胞向成骨细胞分化的能力。