脂肪源性间充质干细胞治疗绝经后骨质疏松症的研究进展

摘要:在绝经后骨质疏松症(postmenopausalosteoporosis,PMOP)研究中,受关注较多的干细胞主要是骨髓源性间 充质干细胞(bonemarrow-derivedmesenchymalstemcells,BMSCs)。尽管 BMSCs有着极强的成骨潜能,但仍然存在数 量有限、取材困难等问题,阻碍其临床应用进程。近年来,许多学者发现脂肪源性间充质干细胞(adipose-derivedmesenchymalstemcells,ADSCs)同样可以进行成骨分化,且具有来源丰富、易于培养、低免疫原性等优点。但到目前为止,关 于 ADSCs治疗 PMOP的研究较少。为解决种子细胞来源问题,探索 ADSCs在 PMOP治疗方面的应用潜力,该综述总 结了近10年发表的关于 ADSCs与 PMOP关系的文献,详细阐述了 ADSCs应用于 PMOP的有效性,ADSCs成骨分化 的潜能及诱导因素,成骨分化的可能机制等问题,以期为促进 ADSCs更好地应用于临床实践提供理论依据。     

兔脂肪间充质干细胞分离培养方法

目的:建立一种简单高效的兔脂肪间充质干细胞(adipose-derived stem cells,ADSCs)分离培养方法,为兔模型中ADSCs研究提供简便充足的干细胞来源.方法:体外分离兔腹股沟皮下脂肪组织,采用0.1％I型胶原酶消化,用含10％胎牛血清的高糖完全培养基贴壁培养兔ADSCs,并对其细胞形态、体外增殖能力、多向分化潜能及表面标记进行分析.结果:体外分离培养的兔ADSCs具有良好的细胞形态、极强的增殖能力,体外经二向诱导,具有成脂及成骨分化潜能,兔第2代ADSCs表面标记CD34、CD105阳性,Sca-1高表达,几乎不表达CD45及SSEA-1.结论:利用兔腹股沟皮下脂肪组织,能培养出高纯度、具有良好干细胞特性及极强增殖能力的兔ADSCs,能很好地满足组织构建对种子细胞量大质优的需求.     

小鼠、大鼠、食蟹猴与人的脂肪干细胞分离培养方法和生物学特性的比较分析

目的比较分析实验动物脂肪间充质干细胞(adipose-derived mesenchymal stem cells,ADSCs)与人脂肪间充质干细胞的分离培养方法和生物学特性的差异,为自体脂肪干细胞移植治疗人类疾病的临床前研究提供临床前的实验数据和方法。方法将临床患者、食蟹猴、C57小鼠和SD大鼠的皮下脂肪组织进行分离培养后得到人脂肪间充质干细胞(h ADSCs)、食蟹猴脂肪间充质干细胞(cynomolgus monkey adipose-derived mesenchymal stem cells,c ADSCs)、小鼠脂肪间充质干细胞(mouse adipose-derived mesenchymal stem cells,m ADSCs)和大鼠脂肪间充质干细胞(rat adipose-derived mesenchymal stem cells,r ADSCs);采用流式细胞术鉴定ADSCs表面标记物;细胞成脂、成骨诱导分化,于诱导后21 d和28 d固定染色,鉴定ADSCs的成脂成骨分化能力。结果 h ADSCs、c ADSCs、m ADSCs和r ADSCs的分离培养方法类似,贴壁培养后均呈成纤维细胞样生长;流式检测显示,不同物种ADSCs间充质干细胞表面标记物CD90、CD29为阳性,少量表达造血干细胞标记物CD34,血管内皮细胞标记物CD31为阴性。成脂和成骨分化能力检测显示,h ADSCs、c ADSCs、m ADSCs和r ADSCs和均具有成脂成骨分化能力,但其成脂成骨分化的时间略有差异。结论实验动物ADSCs与h ADSCs采用相同的分离培养方法,有类似的表面标记物表达及成脂成骨分化潜能,生物学特性具有一致性,是自体脂肪干细胞移植临床前研究的良好模型。     

自体浓缩生长因子对比格犬脂肪干细胞体外增殖及成骨向分化的影响

目的：分析自体浓缩生长因子(concentrated growth factor，CGF)对比格犬脂肪干细胞(adipose-derived stem cells，ADSCs)体外增殖及成骨向分化的影响。方法：取健康比格犬脂肪组织进行分离、培养ADSCs并鉴定其多向分 化潜能，细胞计数试剂盒8(cell counting kit-8，CCK-8)检测细胞增殖。将ADSCs分为CGF组及对照组，对两组细胞进 行成骨诱导后分别检测其碱性磷酸酶(ALP)活性，RT-PCR法检测I型胶原(Col-I)，Runx2等成骨相关基因表达。结果： CGF组细胞增殖能力明显高于对照组(P<0.05)；经成骨诱导的ADSCs在CGF作用下ALP活性明显增强(P<0.05)，Col-I， Runx2等成骨相关基因的表达亦明显高于对照组(P<0.05)。 结论：CGF能够促进ADSCs体外增殖和成骨向分化。     

脂肪干细胞在创伤修复领域的研究进展

脂肪干细胞(ADSCs)来源于脂肪组织,是具有多方向分化潜能的多能干细胞。近年来,随着组织工程学的发展,ADSCs作为种子细胞,能促使血管、骨、软骨、肌腱、神经、皮肤等组织的修复、再生及更新。该文主要介绍ADSCs的分离、培养、鉴定、分化潜能及其在骨组织工程和创面修复中的最新应用进展。     

脂肪干细胞成骨分化的潜在关键基因与信号通路

目的 探讨脂肪干细胞(ADSCs)成骨分化过程相关的关键基因和信号通路.方法 从GEO数据库中下载GSE63754基因芯片数据,利用R语言的Limma软件包筛选出与ADSCs成骨分化过程相关的差异表达基因.针对差异表达基因构建蛋白质互相作用(PPI)网络和转录因子网络.通过cytoHubba插件筛选出与ADSCs成骨分...     

脂肪干细胞的研究进展

脂肪源性间充质干细胞（ADSCs）是从脂肪组织中分离得到的一种成体干细胞,简称脂肪干细胞,它和骨髓间充质干细胞一样,具有自我更新和多向分化潜能,在体外各种诱导条件下可分化为成骨、软骨、脂肪、肌肉、神经、肝和内皮等细胞。脂肪组织在体内含量多、获得容易、创伤小,且ADSCs具有数量多、增殖能力强、可以自体移植等优势,有望成为组织工程理想的种子细胞,在基因治疗、细胞移植等方面具有广泛的应用前景。     

转染Ad-hBMP2的脂肪干细胞与壳聚糖/磷酸三钙复合物支架的相容性

目的探讨转染腺病毒骨形态发生蛋白(Ad-hBMP2)基因的脂肪干细胞(ADSCs)与壳聚糖/磷酸三钙(CTCP)复合物支架的相容性,以期为ADSCs修复骨缺损寻找理想的组织工程骨支架材料。方法将壳聚糖与磷酸三钙进行复合制成CTCP复合物材料,再将其与转染Ad-hBMP2的ADSCs(密度1×106/mL)复合培养,进行细胞复合物支架的一般与超微形态学观察,观察细胞粘附能力、增殖活力,RT-PCR及Western blot测定成骨细胞骨钙素和Ⅰ型胶原水平。结果 CTCP支架孔径200～350μm,孔隙率83%;电镜显示转染Ad-hBMP2的ADSCs与CTCP复合物在体外培养期间支架无塌陷及形变,且其在支架上粘附、增殖良好,并能分泌细胞外基质如骨钙素和Ⅰ型胶原等;随着培养时间延长,骨的组织学特征日益明显。结论 CTCP支架具有适宜的孔结构和良好的生物相容性及骨诱导作用,可以作为骨组织工程较理想的支架材料,且与转染Ad-hBMP2的ADSCs相结合更易形成组织工程骨。     

小鼠脂肪源干细胞的生物学特性及增殖特点

目的探讨脂肪源干细胞的生物学特性及其增殖特点。方法无菌条件下获取C57BL/6小鼠腹股沟脂肪组织,Ⅰ型胶原酶消化并收集脂肪源干细胞(ADSCs),细胞传代至第3代(P3)后加成骨诱导液及成脂诱导液,对脂肪源干细胞进行定向成骨及成脂诱导,并分别行茜素红及油红O染色;流式细胞仪检测脂肪源干细胞表面免疫表型;测定脂肪源干细胞的细胞周期及其生长方式;CCK-8法测脂肪源干细胞增殖情况。结果小鼠脂肪来源的细胞在体外呈梭形生长,且能稳定传代;细胞在加入成骨及成脂诱导液后可定向分化成成骨细胞、成脂细胞;流式指标检测示:CD29高表达(91.4±0.95)%,CD34低表达(38.7±0.4)%;细胞增殖结果显示:细胞增殖旺盛,具有典型的对数期、平台期。结论小鼠脂肪组织来源的细胞是间充质干细胞;脂肪源间充质干细胞是具有多向分化潜能的理想种子细胞。     

脂肪来源干细胞-组织工程学的新亮点

脂肪来源干细胞(Adipose derived stem cells,ADSCs)是来源于脂肪组织,具有多向分化潜能的干细胞群。它贴壁生长,显微镜下呈长梭形。没有特定的表面标记物,除了CD45以外,与骨髓间充质细胞具有相同的表面抗原。经特定条件诱导,ADSCs有分化为脂肪、骨、软骨、神经、血管内皮等多种器官或组织的细胞的潜能,经免疫组化、RT-PCR技术、镜下观察及染色等方法可鉴定ADSCs具有该种器官或组织细胞的结构和功能。因此,常用作组织工程的种子细胞进行人工器官的再造或用作细胞治疗,来解决软骨组织工程、神经与皮肤的创伤和脂肪移植等临床方面的问题,并参与促进各种损伤的人体组织修复和再生。近年来,ADSCs已逐渐成为国内外新的干细胞移植的种子细胞来源。本文结合近年来的相关研究,就ADSCs的生物学特性、分化潜能与鉴定方法,国内外的研究进展、本实验室的工作积累及研究意义和所存在的问题等方面进行了综述。     

Differentiation of adipose-derived neural stem cells into GABAergic neurons in vitro

目的 探讨诱导脂肪源性神经干细胞(neural stem cells,NSCs)分化为GABA能神经元的体外培养方法,为细胞移植修复神经系统损伤提供种子细胞.方法 贴壁培养C57BL/6小鼠(附睾脂肪垫)脂肪来源的干细胞(adiposederived stem cells,ADSCs),流式细胞仪进行表型鉴定(CD45、CD9O、CD105)及标志物纤连蛋白(fibronectin)鉴定后,在碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor,bFGF)、表皮生长因子(epidermal growth factor,EGF)、2％ B27的Neurobasal培养基中诱导成NSCs.用免疫荧光细胞染色法进行NSC特异性标记物Nestin、增殖能力BrdU检测,再次添加脑源性神经营养因子、骨形成蛋白2后,维甲酸(RA)诱导分化为γ-氨基丁酸能神经元,并进行其标志物GABA的检测.结果 分离纯化的ADSCs CD90、CD105表达强阳性,CD45表达阴性;诱导后的干细胞球经Nestin及BrdU鉴定为NSCs,且具有较强的增殖能力;神经干细胞诱导分化后的神经元GABA抗体染色呈阳性.结论 在特定神经营养因子作用下,ADSCs在体外诱导生成的NSCs可被诱导分化为GABA能神经元.     

脂肪来源的干细胞复合壳聚糖支架促进大鼠颅骨缺损修复的实验研究

目的:探讨以脂肪来源的干细胞(adipose-derived stem cells,ADSCs)为基础构建组织工程生物材料修复大鼠颅骨缺损的效果。方法:分离、培养ADSCs,并进行成骨、成脂、成软骨三系分化。制备壳聚糖多孔支架,扫描电镜观察接种ADSCs前后的微结构变化,以细胞活力试剂盒测试ADSCs接种于壳聚糖多孔支架后的细胞活力。取15只雄性Sprague Dawley(SD)大鼠予手术制备颅骨缺损模型,将缺损留空或植入壳聚糖支架,壳聚糖支架表面预先种植低密度(2.5×10⁵)或高密度(1×10⁶)ADSCs。术后8周收集样品用于微型计算机断层扫描分析,随后脱钙,石蜡包埋切片后行苏木素-伊红染色和免疫组化染色观察成骨指标骨涎蛋白。结果:ADSCs可以成功诱导成骨、成软骨和成脂肪分化;扫描电镜和细胞活力测试结果提示壳聚糖支架呈现多孔结构,ADSCs可黏附于支架并增殖,增殖效果与普通培养板相比无统计学差异。在大鼠颅骨缺损模型中,高密度ADSCs/壳聚糖支架组骨组织体积百分数分别比空白对照组和低密度ADSCs/壳聚糖支架组升高140.8%(P=...     

成人脂肪来源干细胞定向诱导分化为软骨细胞的实验研究

[目的] 诱导脂肪组织来源干细胞(ADSCs)定向分化为软骨细胞并进行鉴定,为软骨组织工程获取大量种子细胞做准备.[方法] 对患者抽脂术的脂质部分进行分离培养及传代,采用四氮唑复合物(MTT)法测定细胞活性并描绘细胞增殖曲线,通过流式细胞仪将培养的细胞行干细胞鉴定,将第4代的ADSCs向软骨细胞定向诱导分化并行阿新蓝染色鉴定;免疫组化检测成软骨方向诱导后的ADSCsⅡ型胶原的表达.[结果] ADSCs体外增殖速度快,并且保持稳定的倍增率直至13～15代;流式细胞仪分析提示该细胞具有干细胞特性;通过定向分化技术,ADSCs可向软骨细胞分化,阿新蓝染色及Ⅱ型胶原表达均呈阳性,说明定向分化后的细胞具备正常软骨细胞的功能.[结论] 成功诱导ADSCs向软骨细胞定向分化,为软骨组织工程提供了可靠的种子细胞.     

外源性NO对脂肪干细胞成软骨分化的影响

目的 通过观察不同浓度外源性一氧化氮（nitric oxide ,NO）供体硝普钠（SNP）对脂肪干细胞（adipose-derived stem cells,ADSCs）增殖状况及相关基因表达的影响,探讨外源性NO在ADSCs成软骨分化中的作用。方法 获取并培养ADSCs,分别进行成骨和成脂诱导,采用茜素红染色和油红O染色进行多向分化鉴定。NO检测试剂盒检测ADSCs成软骨分化过程中NO的变化;采用细胞计数试剂盒-8(CCK8)法检测不同浓度SNP（0.25 mmol/L、1.00 mmol/L、4.00 mmol/L）下ADSCs的增殖情况。以Real time-PCR（RT-PCR）方法检测ADSCs在不同浓度SNP下,表达转化生长因子-β1（TGF-β1）以及成软骨分化特异基因——信号传导蛋白Smad3、 Ⅱ胶原蛋白（Col-Ⅱα1）基因的变化。结果 培养的细胞经成骨和成脂诱导后茜素红染色和油红O染色呈阳性;ADSCs成软骨分化过程中,培养上清液中NO浓度始终比对照组高（P<0.05）;与对照组相比,低浓度SNP（0.25 mmol/L、1.00 mmol/L）对ADSCs的增殖无明显影响（P>0.05）,高浓度SNP（4.00 mmol/L）抑制ADSCs增殖,差异有统计学意义(P<0.05)。RT-PCR检测发现SNP能抑制ADSCs自身TGF-β1 mRNA的表达,同时抑制Smad3 mRNA和Col-Ⅱα1 mRNA的表达。结论 在ADSCs成软骨分化过程中,外源性NO可以通过抑制ADSCs自身产生TGF-β1,并且抑制TGF-β下游信号通路,从而抑制成软骨分化。     

兔脱细胞软骨基质颗粒复合SD大鼠脂肪干细胞对软骨内成骨的促进作用

目的:探讨兔脱细胞软骨基质颗粒(ACM)的生物相容性,阐明其对SD大鼠脂肪干细胞(ADSCs)软骨内成骨的促进作用。方法:提取原代SD大鼠ADSCs进行三向分化实验,流式细胞术检测细胞干性。采集3月龄新西兰白兔耳软骨,采用研磨浸泡法制备ACM备用。实验分为ACM组和ADSCs+ACM共培养组,在扫描电镜下观察ACM和ACM上ADSCs的超微形态表现,采用钙黄绿素/碘化丙啶(Calcein-AM/PI)荧光染色法观察ADSCs+ACM共培养组中ADSCs的生长情况。将ADSCs分为对照组和实验组(ADSCs与ACM共培养),采用CCK-8法检测2组细胞增殖活性,实时荧光定量PCR (RT-qPCR)法检测成软骨诱导7和14 d时2组细胞中Ⅱ型胶原(COL-Ⅱ)、Ⅹ型胶原(COL-Ⅹ)、SOX转录因子9 (SOX-9)、血管内皮生长因子(VEGF)、碱性磷酸酶(ALP)和Runt相关转录因子2 (RUNX-2) mRNA表达水平。结果:成功制备兔ACM,提取的SD大鼠ADSCs可以进行三向分化且表达干细胞特异性表面标志物。ADSCs可以在ACM上黏附生长。与对照组比较,实验组ADSCs增殖...     

脂肪源性神经干细胞诱导分化为γ-氨基丁酸能神经元的体外研究

目的探讨诱导脂肪源性神经干细胞(neural stem cells,NSCs)分化为GABA能神经元的体外培养方法,为细胞移植修复神经系统损伤提供种子细胞。方法贴壁培养C57BL/6小鼠(附睾脂肪垫)脂肪来源的干细胞(adipose-derived stem cells,ADSCs),流式细胞仪进行表型鉴定(CD45、CD90、CD105)及标志物纤连蛋白(fibronectin)鉴定后,在碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor,bFGF)、表皮生长因子(epidermal growth factor,EGF)、2%B27的Neuro-basal培养基中诱导成NSCs。用免疫荧光细胞染色法进行NSC特异性标记物Nestin、增殖能力BrdU检测,再次添加脑源性神经营养因子、骨形成蛋白2后,维甲酸(RA)诱导分化为γ-氨基丁酸能神经元,并进行其标志物GABA的检测。结果分离纯化的ADSCs CD90、CD105表达强阳性,CD45表达阴性;诱导后的干细胞球经Nestin及BrdU鉴定为NSCs,且具有较强的增殖能力;神经干细胞诱导分化后的神经元GABA抗体染色呈阳性。结论在特定神经营养因子作用下,ADSCs在体外诱导生成的NSCs可被诱导分化为GABA能神经元。     

小鼠脂肪间质干细胞源胞外囊泡激活蛋白激酶B促进卵巢癌细胞增殖迁移和上皮间质转化

目的:探讨小鼠脂肪间质干细胞(adipose-derived mesenchymal stem cells,ADSCs)源胞外囊泡(extracellular vesicles,EVs)对卵巢癌ID8细胞株生物功能的影响及其可能机制。方法:采用酶消化法分离获得ADSCs,利用其形态特征、成骨成脂多向分化能力和流式细胞术表面标志检测对ADSCs进行鉴定;采用超速离心法从ADSCs上清液中分离和纯化EVs(ADSC-EVs),并通过透射电子显微镜、纳米粒径分析和蛋白质印迹实验进行鉴定;以PBS作为对照组,实验组采用不同浓度ADSC-EVs(20 μg/mL和40 μg/mL)分别预处理ID8细胞,通过平板克隆实验检测ADSC-EVs对ID8细胞增殖能力的影响;划痕实验和Transwell实验检测ADSC-EVs对ID8细胞迁移能力的影响;蛋白质印迹实验检测ID8细胞上皮间质转化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)和蛋白激酶B(即AKT)相关蛋白的表达。结果:分离的ADSCs具有典型的干细胞形态,能够向成骨成脂分化,并符合干细胞表面一般特征;ADSC-EVs表达CD9和CD81蛋白;与PBS组相比,ADSC-EVs组ID8细胞增殖和迁移能力明显增强(P均＜0.05),且40 μg/mL ADSC-EVs组细胞增殖和迁移能力较20 μg/mL ADSC-EVs组明显增强(P均＜0.05);随着ADSC-EVs浓度增加,ID8细胞E-钙黏蛋白表达明显降低,N-钙黏蛋白、波形蛋白和p-AKT表达明显增加(P均＜0.05)。结论:ADSC-EVs可能通过激活AKT信号的磷酸化促进ID8细胞EMT,进而增强其增殖和迁移能力。     

柚皮苷促进牙周韧带干细胞增殖和分化的研究

目的探讨不同浓度柚皮苷对牙周韧带干细胞增殖和分化的影响。方法分别在含有0.14 mg/mL(低浓度组)和1.4 mg/mL(高浓度组)柚皮苷的细胞培养基上对牙周韧带干细胞进行培养,并与不含柚皮苷的细胞培养基(空白对照组)培养情况进行对比。在培养1 d、4 d、7 d后对牙周韧带干细胞的增殖情况进行测定,在培养7 d、14 d后对牙周韧带干细胞的碱性磷酸酶活性及成骨相关基因[成骨特异性转录因子(Runx2)、骨钙素(OCN)、碱性磷酸酶(ALP)、Ⅰ型胶原(ColⅠ)]的表达进行测定。结果高浓度(1.4 mg/mL)的柚皮苷对牙周韧带干细胞的增殖具有促进作用(P0.05),对牙周韧带干细胞的成骨向分化也具有一定的促进作用,能够显著提高成骨相关基因(ColⅠ、ALP、OCN、Runx2)的表达。结论柚皮苷在一定的浓度和时间下,能促进牙周韧带干细胞的增殖与成骨向分化。     

人牙髓干细胞和根尖乳头干细胞体外分化能力的对比研究

目的 对比研究人牙髓干细胞(DPSCs)和根尖乳头干细胞(SCAP)的体外生长特性、增殖及矿化能力.方法 采用酶消化法体外培养人DPSCs和SCAP,诱导分化培养基诱导细胞成骨/成牙本质向分化,流式细胞仪检测特异性标记物,茜素红染色检测矿化程度,逆转录PCR(RT-PCR)检测分化标记物表达.结果 人DPSCs和SCAP为成纤维细胞样贴壁生长,SCAP增殖率较高;两种细胞表达特异性间充质干细胞(MSCs)标记物:CD34、CD45(-),CD90、CD105、CD146(+),基质细胞抗原1(STRO-1)、八聚体转录因子4(OCT-4)(+),SCAP特异性标记物CD24(+).成骨诱导3周可形成明显钙化结构,SCAP钙化能力较强.成骨诱导2周2种细胞均可表达分化标记物:骨涎蛋白、骨钙素、牙本质涎磷蛋白,且随诱导时间表达逐渐增加.结论 人DPSCs和SCAP均具有间充质干细胞典型特征,可分化为成牙本质样细胞,是牙源性组织工程的可靠于细胞来源.     

年龄因素对大鼠脂肪干细胞成骨诱导分化能力的影响

目的 探讨年龄因素对脂肪干细胞成骨分化能力的影响.方法 通过密度梯度离心法分离不同年龄段ADSCs进行培养及传代,观察细胞生长情况,细胞培养至第3代进行诱导分化,各年龄组细胞均在成骨诱导分化后进行检测.观察其形态变化、细胞凋亡率、碱性磷酸酶活性及钙离子浓度测定.结果 体外培养的ADSCs呈梭形,诱导条件下,各年龄组细胞形态由梭形变为立方形、多角形;经检测,随年龄的增长细胞的凋亡率在不断增大,幼年组细胞碱性磷酸酶活性较老年组高,钙离子浓度随年龄增加而降低.结论 ADSCs成骨分化能力随着年龄的增加而降低.