基因编辑“猪-恒河猴”异位心脏异种移植的围术期治疗及管理经验

目的 总结异种异位心脏移植动物实验的经验,旨在为成功转化基因编辑猪心脏异种移植临床应用积累研究基础。方法 2022年10月在1只恒河猴的腹腔内完成了异位猪心脏移植。“猪-恒河猴”异位心脏异种移植实验从多个方面对受体进行精细化管理,围术期针对免疫排斥和凝血功能障碍,维持供体心脏功能,延长受体生存时间,尽可能保证其生存和生活质量。结果 受者存活20天,死于凝血功能障碍。结论 为了克服免疫排斥、跨物种感染、凝血功能障碍等致命障碍,仍需要大量的临床前动物实验。     

异种心脏移植排斥反应中黏附分子表达及LFA-1mAb、AS—ICAM-1 ODN的作用

免疫排斥反应是异种移植走向临床应用的主要障碍。为模拟猪-人非协调性异种心脏移植，本研究以Sprague—Dawley(SD)大鼠为供体，新西兰白兔为受体，建立大鼠-兔非协调性异种异位心脏移植模型，应用供体肾脏灌注吸附及中华眼镜蛇毒延迟超急性排斥反应的发生，检测排斥反应时细胞黏附分子表达，并应用LFA-1 mAb和AS-ICAM-1     

“转基因猪心”可期？异种心脏移植研究进展

心脏移植是终末期心力衰竭的有效治疗手段,但供体严重不足制约了心脏移植的广泛开展。异种移植由于供体器官来源不受数量和时间的限制,可以更好地满足临床需要,最有可能成为解决供需矛盾的可靠方法。近年来,由于基因编辑猪的应用及新的免疫抑制方案实施,心脏异种移植实验研究方面取得了巨大的进展,相继克服了超急性排斥反应、早期移植物失功、人畜共患病及异种移植器官过度生长等难题。在此基础上,研究者开展了一系列准临床级别的人体试验,取得了巨大的突破。但是,异种移植仍面临如何维持移植心脏长期存活及开展临床试验所涉及的伦理和行政监管等诸多问题的挑战。本文通过对异种移植研究现状及面临的问题进行综述,为心脏异种移植的进一步实验研究和临床试验提供更多的思考。     

异种心脏移植的伦理思考

随着异种心脏移植免疫排斥反应研究的逐渐深入,根据以往的临床经验,包括生理相容性以及感染的可能性和医学伦理学上的考虑,目前认为猪心可成为未来异种心脏移植最理想的供体。虽然还需要更多的临床应用实验．对可能的感染风险也需要更深入的认识,但随着人类补体调控蛋白在转基因猪的表达,以及新的免疫抑制方法的发现,异种心脏移植已成为人们关注的热点,因此就这一领域进一步探讨有关伦理问题。     

异种移植超急性与急性排斥反应及其对策研究进展

器官移植作为治疗终末期器官衰竭患者的一种比较有效的方法,在临床上得到了越来越广泛的应用,然而这也使人类器官供体相对缺乏的状况越来越严重,激起人们对异种移植的强烈兴趣。考虑到器官的功能特点、形状和大小,基因调控和控制病毒传播的难易程度等因素,使得猪成为理想异种移植供体之一。     

克服异种移植超急性排斥的方法

人供体器官严重短缺极大地限制了同种器官移植的推广和应用 ,但也极大地推动了异种器官移植的研究。由于种种原因 ,猪被认为是人异种器官移植最理想的供体。猪→人的移植属于非协同异种移植 ,其主要障碍是超急性排斥。克服超急性排斥是猪→人异种移植成功的第一步 ,也是关键的一步。目前普遍认为 ,这种超急性排斥是由天然抗体 (主要是ＩｇＭ ,此外还有ＩｇＧ、甚至ＩｇＡ)和供者异种抗原 (主要是Ｇａｌα1,3Ｇａｌ)反应 ,补体激活 [通过经典和 (或 )旁路补体激活途径 ]介导组织损伤 ,属于体液免疫范畴。据此 ,研究人员设计了许多对策克服超…     

人血型抗体IgG、IgM对基因修饰猪外周血PBMC和RBC杀伤作用初步研究

目的：探讨人血型抗体IgG、IgM对基因修饰猪外周血PBMC和RBC的结合和杀伤差异，为猪-人异种肾移植临床应用的供体猪血型选择提供理论依据。方法：抽取20例健康正常人、20例终末肾病患者和20例脑死亡器官捐献者血清，并根据ABO血型分成4组（A血型：n=20;B血型：n=17;AB血型：n=7;O血型：n=16）。用流式细胞术检测4组人血清分别与O血型野生型（WT）、α1、3-半乳糖基转移酶基因敲除（GTKO）、胞苷酸N-乙酰神经氨酸羟化酶基因敲除（GTKO/β4GalNT2KO）、β1、4-N-乙酰氨基半乳糖转移酶2基因敲除（GTKO/CMAHKO）和3种基因敲除（TKO/hCD55）猪外周血单个核细胞（PBMC）和红细胞（RBC）的抗体结合或补体依赖的细胞毒性试验（CDC）。结果：A血型、B血型、AB血型和O血型人血清抗体IgM和IgG分别对WT猪PBMC,GTKO猪PBMC,GTKO/β4GalNT2KO猪PBMC,GTKO/CMAHKO猪PBMC,TKO/hCD55猪PBMC的结合和杀伤无明显差异。A血型、B血型、AB血型和O血型人血清抗体分别对WT猪RBC,GTKO猪RBC...     

异种生物材料应用于角膜移植的研究进展

异种角膜材料和生物工程角膜材料的应用可以在一定程度上缓解人类供体角膜的紧张情况。供体脱细胞处理方式和手术方式上的改进使异种来源的角膜植片能够应用于临床治疗。猪眼角膜被认为是一种具备替代人供体的材料之一。目前,很多研究将猪来源的供体角膜作为异种移植材料,也在一定程度上取得了初步成果,这为临床试验的开展打下了基础。近年来很多关于脱细胞处理后的猪眼角膜应用于异种移植的研究相继被报道,未来猪眼角膜可能应用于临床以缓解临床供体的紧张现状。     

同系或同种胸腺与异种胸腺混合移植诱导T细胞免疫耐受的实验研究

目的 探讨同系或同种胸腺与异种胸腺混合移植诱导移植免疫耐受而不发生自身免疫性疾病的可行性。方法 BALB／c裸小鼠的肾包膜下植入胸腺建立异种、同系与异种混合、同种与异种混合胸腺移植模型。4个月后，用流式细胞仪技术检测受者裸小鼠外周血中CD3^＋CD4^＋T细胞，用单向混合淋巴细胞培养了解受者T细胞对ConA以及同种异种淋巴细胞的反应性，异基因皮肤移植观察皮肤移植物存活期。用ELISA法检测受体血清中抗DNA自身抗体。结果 胎胸腺移植4个月后，受者裸小鼠中CD3^＋CD4^＋T细胞重建良好；T细胞对ConA以及无关的SD鼠异种淋巴细胞的反应性强，而对移植胸腺供体来源的淋巴细胞不发生增殖反应；受者对移植胸腺供体来源鼠皮肤移植物不发生排斥，而对无关的SD鼠皮肤移植物发生排斥。异种胸腺移植组发生消耗性疾病死亡高，抗DNA自身抗体明显高于混合胸腺移植组。结论 同系或同种异种胎胸腺混合移植可诱导受者T细胞对供者移植物的免疫耐受。     

CRISPR/Cas9介导的猪Six1和Six4基因敲除细胞系的建立

目的：利用干细胞囊胚互补技术再生同种或异种动物器官已得到验证,其重要的前提是需要构建出相应的器官缺失动物模型。本文拟通过CRISPR/Cas9基因编辑技术建立猪Six1单基因和Six1/Six4双基因敲除猪细胞系,为构建肾脏发育缺陷和缺失猪模型奠定重要的研究基础。方法：选取猪Six1基因和Six4基因第一外显子为敲除靶点,分别设计并合成单导向RNA（single guide RNA,sgRNA）,将其插入含有Cas9骨架的PX330质粒,分别构建Six1基因和Six4基因敲除打靶载体PX330?sgRNA1和PX330?sgRNA4;用T7EN1酶验证打靶载体敲除效率后,将高效打靶载体与含G418抗性的质粒（pCMV?tdTomato）共转染原代猪胎儿成纤维细胞（porcine fetal fibroblasts,PFFs）中,并通过药物筛选获得单克隆细胞群落,随后对单克隆细胞进行基因型鉴定。结果：分别成功构建Six1和Six4基因的Cas9/sgRNA表达载体。转染Six1基因打靶载体经药物筛选后,利用PCR方法鉴定所获得的Six1基因敲除单克隆细胞系48个,其中Six1-/-细胞系21个。通过同样方法同时转染Six1基因和Six4基因打靶载体,经药物筛选后共获得44个单克隆细胞系,其中Six1-/- Six4-/-细胞系为13个。结论：通过CRISPR/Cas9基因编辑技术可高效获得Six1单基因敲除细胞系和Six1/Six4双基因敲除细胞系,为构建肾脏发育缺陷猪动物模型提供了基础,并有助于研究Six1和Six4基因在猪肾脏发育中的功能。