沉默热休克蛋白27基因增强大肠癌细胞对5-FU化疗敏感性

目的:探讨不同大肠癌细胞热休克蛋白(HSP27)蛋白表达水平及其与5-氟尿嘧啶(5-FU)化疗敏感性的关系,同时通过RNA干扰抑制HSP27基因的表达,初步探讨沉默该基因对5-FU抗肿瘤作用的影响。方法:Western blot法检测各大肠癌细胞中HSP27蛋白的表达水平,CCK-8法测定不同浓度5-FU对各细胞株的抑制率,分析各组细胞HSP27蛋白表达水平与IC50的关系。设计合成3对针对不同靶点的HSP27小干扰RNA,通过脂质体转染SW480细胞,激光共聚焦显微镜观察转染效率,Real-time PCR及Western blot法检测转染后HSP27 m RNA及蛋白表达水平。CCK-8法检测HSP27-si RNA对细胞的生长抑制作用及沉默HSP27基因细胞对5-FU化疗敏感性的变化。结果:各组细胞中HSP27的表达水平与5-FU的敏感性呈负相关性。Real-time PCR及Western blot法结果显示有两对靶向HSP27-si RNA能有效抑制HSP27 m RNA及蛋白水平的表达;CCK-8法检测结果显示HSP27-si RNA转染可增强SW480细胞对5-FU的敏感性,半数抑制浓度(IC50)明显下调。HSP27在大肠癌细胞中的表达水平与5-FU化疗药IC50值呈正相关。结论:靶向HSP27的si RNA能有效抑制大肠癌SW480细胞HSP27蛋白的表达,增强5-FU化疗药物的敏感性。     

多配体蛋白聚糖1对舌鳞状细胞癌CAL27细胞迁移、侵袭和细胞周期的调控作用

目的:研究舌鳞状细胞癌CAL27细胞中过表达多配体蛋白聚糖1(SDC1)对细胞迁移、侵袭、细胞周期和细胞中活性氧(ROS)水平的影响,阐明SDC1在舌鳞状细胞癌发生发展中的潜在作用机制.方法:前期实验中成功构建的稳定高表达ptt5-SDC1的人舌鳞状细胞癌CAL27细胞作为实验组,稳定转染ptt5空载体的CAL27细胞...     

RNA干扰HSP27基因表达对膀胱逼尿肌细胞收缩特性的影响

目的 探讨热休克蛋白27(heat shock protein 27,HSP27)低表达对体外培养人膀胱逼尿肌细胞(bladder smooth muscle cells,BSMCs)肌动蛋白骨架结构及其收缩功能的影响.方法 构建HSP27基因干扰慢病毒载体作用于BSMCs后,Western blot检测其抑制HSP27表达水平和干扰效率;通过鬼笔环肽荧光染色、Western blot检测BSMCs内F/G-actin比值检测等方法观察,干扰HSP27表达对BSMCs肌动蛋白骨架形态结构和聚合状态的影响;构建离体BSMCs三维培养模型,检测HSP27低表达对膀胱逼尿肌细胞收缩力的影响.结果 成功构建HSP27干扰质粒pGreenPuro-sh-HSP27,慢病毒载体高效感染BSMCs;与正常对照组比较,HSP27干扰组BSMCs细胞内肌动蛋白骨架结构紊乱和皱缩,检测F/G-actin比值(0.116 ±0.001)亦较正常BSMCs (8.717 ±0.500)明显下降(P＜0.05);正常BSMCs三维培养模型在80 mmol/L KCl刺激下可检测到的最大收缩力为(8.4 ±0.6)mg显著大于HSP27干扰组[(3.8±0.2)mg,P＜0.05].结论 HSP27低表达状态可导致BSMCs肌动蛋白结构变化并导致其收缩功能受损.     

PD-L1对人口腔鳞状细胞癌细胞增殖、迁移和侵袭的影响

目的：探讨程序性细胞死亡配体1 (PD-L1)在口腔鳞状细胞癌（OSCC）细胞中的表达及其对OSCC CAL27细胞生物学行为的影响,阐明其可能的作用机制。方法：采用Western blotting法检测口腔上皮HOK细胞和OSCC CAL27、TCA8113和SCC15细胞中PD-L1蛋白表达水平。免疫荧光染色法检测CAL27细胞中PD-L1蛋白表达和定位情况。将CAL27细胞分为对照组（转染si-NC）和si-PD-L1组（转染si-PD-L1）,Western blotting法检测2组细胞干扰效率,CCK-8法检测不同时间点2组细胞增殖活性,平板克隆实验检测2组细胞克隆形成数,细胞划痕愈合实验检测2组细胞划痕愈合率,Transwell小室实验检测2组细胞中迁移和侵袭细胞数。结果：OSCC细胞中PD-L1蛋白表达水平均高于HOK细胞（P<0.05或P<0.01）, PD-L1在CAL27细胞的细胞质和细胞核中均有表达。CCK-8法和平板克隆实验,与对照组比较,不同时间点si-PD-L1组CAL27细胞增殖活性明显降低（P<0.05或P<0.01）,克隆形成...     

靶向热休克蛋白-27基因沉默对5-氟尿嘧啶诱导SW480细胞凋亡的影响及机制

目的：通过RNA干扰抑制热休克蛋白-27（HSP27）基因的表达,探讨沉默该基因对5-氟尿嘧啶（5-FU）诱导大肠癌SW480细胞凋亡的影响及机制。方法：将细胞分为正常对照组（Normal组）、阴性siRNA转染组（NC组）、HSP27-siRNA转染组（siRNA组）、单纯5-FU组（5-FU组）、5-FU+阴性siRNA转染组（NC+5-FU组）、5-FU+HSP27-siRNA转染组（siRNA+5-FU组）,通过脂质体LipofectamineTM 2000将HSP27-siRNA导入SW480细胞,CCK-8法检测靶向HSP27的siRNA和5-FU对SW480细胞增殖的抑制作用,流式细胞技术观察转染后细胞在5-FU作用下的早期凋亡情况,Western blot方法检测凋亡相关蛋白Active-casepase-3、Active-caspase-9及细胞色素C（Cytc）的表达。结果：CCK-8法检测结果显示siRNA+5-FU组细胞增殖抑制率明显高于同期siRNA组和5-FU组,表明联合应用抑制率明显升高（P＜0.05）。流式细胞仪检测结果表明siRNA组和5-FU组均可诱导SW480细胞凋亡,两者联合应用细胞早期凋亡率明显升高,与Normal组及NC组比较,差异均有统计学意义（均P＜0.05）;Western blot检测结果显示siRNA+5-FU组Active-casepase-3、Active-caspase-9、Cytc蛋白相对表达水平均高于siRNA组和5-FU组,差异均有统计学意义（均P＜0.05）。结论：靶向HSP27-siRNA能有效抑制大肠癌SW480细胞HSP27蛋白的表达,上调Active-casepase-3、Active-caspase-9、Cytc蛋白的表达,增强5-FU诱导SW480细胞凋亡,逆转肿瘤细胞对5-FU的耐药。     

干扰TAZ基因对舌鳞癌细胞CAL27增殖凋亡的影响及其机制

目的 探讨干扰TAZ基因后对舌鳞癌细胞CAL27增殖和凋亡的影响以及可能的分子调控机制。 方法 实验分为干扰组和对照组,将稳定干扰TAZ基因的慢病毒载体转染至舌鳞癌细胞CAL27中作为干扰组,并以非特异性序列转染CAL27细胞作为对照组。利用实时荧光定量PCR(RT-PCR)及Western blotting检测干扰效率,CCK-8细胞活力实验及EdU染色法检测转染后细胞增殖能力的改变,流式细胞术检测细胞周期和细胞凋亡情况,Western blotting检测与周期及凋亡相关蛋白的表达情况。 结果 干扰TAZ基因后,RT-PCR和Western blotting检测结果显示,TAZ mRNA和蛋白表达水平明显降低;CCK-8细胞增殖活力检测及EdU染色法显示细胞增殖能力降低;细胞早期凋亡和晚期凋亡比例均增多; G0/G1期细胞比例增多,而G2/M期细胞减少。同时,干扰TAZ基因后,周期相关蛋白CYCLIN D1、CDK4和CDK6等表达水平降低;而凋亡相关蛋白Bax、cleaved Caspase9表达水平均升高,Bcl-2表达水平降低。 结论 干扰TAZ基因可以通过调控细胞周期和凋亡相关蛋白的表达,来影响舌鳞癌细胞的增殖和凋亡。     

siRNA干扰CXCR4基因对T24细胞侵袭力的影响

目的:研究RNA干扰下调CXCR4基因对膀胱移行细胞癌T24细胞体外侵袭力的影响。方法:根据CX-CR4基因特点,设计合成CXCR4特异性小干扰RNA(siRNA),并转染T24细胞,同时设置空白对照(转染时只加脂质体)和阴性对照(采用无关序列RNA转染)组。通过RT-PCR方法检测CXCR4mRNA的表达,采用Westernblot方法检测CXCR4蛋白的表达,用Boyden小室体外细胞侵袭模型检测细胞体外侵袭能力。结果:各组T24细胞的CXCR4mRNA、蛋白水平和穿膜细胞数比较,差异有统计学意义(F=140.822、473.079和133.247,P<0.001)。siRNA转染组T24细胞的CXCR4mRNA、蛋白表达下调,体外侵袭力减弱(P<0.05)。结论:CXCR4特异性siRNA可降低膀胱移行细胞癌T24细胞体外侵袭力。     

Survivin 反义RNA/HSP70双基因对MCF-7细胞的影响

目的 探讨survivin反义RNA/HSP70双基阂转染对乳腺癌细胞系MCF-7的影响.方法 将已成功获得的双基因载体(pIRES2-EGFP-survivin反义RNA/HSP70)用脂质体介导转染乳腺癌细胞系MCF-7,转染72 h,收集各组细胞,用倒置荧光显微镜观察并证实转染是否成功;采用real-time PCR方法检测细胞内survivin基因mRNA水平的表达变化;用Western blotting检测细胞HSP70蛋白表达变化;应用Annexin-V-cy5/7AAD双染后流式细胞术检测细胞凋亡率.结果 转染双基因载体与转染空载体的乳腺癌细胞系MCF-7于倒置荧光显微镜下可见绿色荧光;将转染双基因载体的MCF-7细胞与转染空载体的MCF-7细胞和未转染的MCF-7细胞相比,survivin mRNA表达水平降低,并有效诱导细胞发生凋亡,而HSP70蛋白表达升高.结论 Survivin反义RNA与HSP70双基因转染成功;survivin反义RNA能干扰MCF-7内源survivin的表达,诱导细胞凋亡;HSP70能上调MCF-7细胞HSP70蛋白的表达.     

下调TSG101基因对人结肠癌细胞LOVO生长的调节作用

目的:探讨TSG101基因对人结肠癌细胞生长的调节作用。方法:构建TSG101基因的小干扰RNA载体并将其转导入LOVO细胞,获得稳定转染的阳性克隆后,应用RT-PCR和western blot进行鉴定;MTT法和流式细胞仪检测细胞转染前后生长速度和细胞周期的变化;Western blot检测细胞转染前后细胞周期相关蛋白Cyclin D1、CDK4、CDK6、p21和p27的表达变化。结果:成功构建了TSG101的小干扰RNA载体;筛选到稳定的TSG101低表达的结肠癌细胞模型;转染TSG101小干扰RNA后的细胞生长速度显著减慢,出现G1期阻滞,且Cyclin D1的表达明显降低,p21的表达明显增高。结论:下调TSG101基因能抑制结肠癌细胞生长,提示该基因可能具有临床应用前景。     

HSP70 siRNA对宫颈癌HeLa细胞HSP70表达及细胞增殖与凋亡的影响

目的通过体外实验观察HSP70的小分子干扰RNA(small interfering RNA,siRNA)对宫颈癌HeLa细胞株增殖及凋亡的影响,探讨HSP70在HeLa细胞增殖和凋亡中的功能。方法针对HSP70基因设计siRNA序列,克隆到空载体pTZU6+1中,转化DH5α菌株,提取质粒,进行酶切鉴定和测序分析。在脂质体2000的介导下转染HeLa细胞,同时转染空载体为阴性对照及不加任何试剂的空白对照。转染48h后,应用半定量RT-PCR,Westernblot检测HeLa细胞HSP70mRNA及蛋白的表达情况;MTT法检测HeLa细胞的生长抑制率;AO/EB染色法观察HeLa细胞形态学变化;流式细胞术检测HeLa细胞的凋亡率和细胞周期分布情况。结果与对照组相比,转染pHSP70-siRNA组HSP70的mRNA及蛋白表达均明显下降(P<0.01),表明Phsp70-siRNA质粒转染能有效降低HSP70的表达;细胞生长抑制率明显增高(P<0.05),且在48h时细胞抑制率达到最大;在荧光显微镜下观察到HeLa细胞出现凋亡形态;流式细胞术结果显示pHSP70-siRNA组细胞凋亡率显著高于对照组,且G0/...     

P27及Ki67在非小细胞肺癌组织中的表达及意义

目的:探讨P27及Ki67在非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)组织中的表达及临床意义。方法:采用免疫组化法(S-P法)检测72例NSCLC组织与20例正常肺组织中P27及Ki67的表达,并结合临床资料进行统计学分析。结果:P27蛋白在NSCLC中的阳性表达率为40.27%,显著低于正常肺组织的90%(P<0.05);Ki67蛋白在NSCLC中的阳性表达率为70.83%,显著高于正常肺组织的5%(P<0.05)。P27与Ki67表达与肿瘤的分化程度、TNM分期及淋巴结转移与否相关(P<0.05),但与性别、年龄、组织学类型不相关(P>0.05)。NSCLC中P27与Ki67表达呈负相关(P<0.05)。结论:P27的低表达和Ki67的高表达可能在NSCLC发生发展中起重要作用,对其进行联合检测可能对NSCLC的早期诊断及判断预后有一定价值。     

青蒿琥酯对胃癌细胞系 HGC27 细胞增殖、凋亡的影响及其机 制简

目的 探讨青蒿琥酯对大胃癌细胞系HGC27细胞增殖、凋亡的影响及其机制.方法 体外培养HGC27细胞,采用不同浓度青蒿琥酯处理24、48、72 h,MTT法测定其对HGC27细胞增殖的影响;倒置显微镜下观察细胞的形态学变化;青蒿琥酯（浓度分别为20、40、80 mg/L）处理HGC27细胞48 h后,分别采用流式细胞仪检测细胞凋亡、分光光度计检测Casepase-3、Caspase-9相对活性、Western blot法检RUNX-3蛋白表达情况.结果 青蒿琥酯（浓度10～100 mg/L）能抑制HGC27细胞的增殖,呈剂量和时间依赖性;倒置显微镜下可观察到典型的细胞凋亡形态.青蒿琥酯（浓度分别为20、40、80 mg/L）作用HGC27细胞48 h后,细胞凋亡率分别为11.5％、21.4％、36.6％,而对照组凋亡率仅为2.2％;处理后Casepase-3相对活性分别为（0.19±0.02）、（0.25±0.04）和（0.31±0.03）,对照组为（0.11±0.02）,Casepase-9相对活性分别为（0.18±0.02）、（0.23±0.03）和（0.30±0.04）,对照组为（0.10±0.02）,与对照组比较,青蒿琥酯处理组Casepase-3、Caspase-9相对活性显著增加,差异均有统计学意义（均P＜0.05）;RUNX-3蛋白表达上调,呈剂量依赖性.结论 青蒿琥酯能抑制HGC27细胞的增殖并诱导其凋亡,其作用机制可能与增加细胞Casepase-3、Caspase-9活性、上调RUNX-3蛋白的表达有关.青蒿琥酯是一种前景广阔的抗肿瘤药物.     

肿瘤相关巨噬细胞来源IL-6通过上调肿瘤细胞中LIF表达对口腔鳞状细胞癌Cal27细胞侵袭和迁移的促进作用

探讨肿瘤相关巨噬细胞（TAMs）来源的白细胞介素6（IL-6）对口腔鳞状细胞癌（OSCC）Cal27细胞中白血病抑制因子（LIF）表达及侵袭和迁移的影响，并阐明其可能的作用机制。     

p27kip-1在支气管哮喘气道上皮组织中的表达及意义

【目的】探讨细胞周期素依赖性蛋白激酶抑制因子p27kip-1在支气管哮喘气道上皮组织中的表达及意义。【方法】60只雄性SD大鼠随机分为对照组与哮喘组,每组30只。用卵清蛋白(ovalbumin,OVA)致敏与激发建立大鼠哮喘模型。应用免疫组化SP法,检测对照组和哮喘组气道上皮组织中气道黏膜上皮细胞、p27kip-1的表达情况;测定两组气道上皮组织中气道平滑肌增生细胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen,PCNA)的阳性计数。分离各组气道平滑肌细胞(airway smooth muscle cell,ASMC),以α-Actin抗体标记其核数。【结果】半定量评分显示,哮喘组气道黏膜上皮细胞及p27kip-1显著低于对照组(P<0.05),哮喘组PCNA阳性计数、ASMC核数显著大于对照组(P<0.01)。【结论】支气管哮喘时,p27kip-1在气道上皮组织中表达减少。通过上调p27kip-1在气道上皮组织表达可以抑制气道上皮组织中ASMC的增殖,为哮喘的防治研究提供了新思路。     

CD27／CD27L蛋白在胰腺癌患者血清中的含量及临床意义

【目的】探讨胰腺癌患者外周血清中CD27和CD27L蛋白的含量及临床意义。【方法】ELIsA法和Westernblotting检测52例胰腺癌患者和45例健康查体者外周血中CD27和CD27L蛋白的含量,并分析与病理类型和临床分期的关系。【结果】与健康查体组相比,胰腺癌患者外周血中CD27蛋白含量未出现明显变化（P〉0．05）,但CD27L蛋白含量显著升高（P〈0．001）。Spearman秩相关分析表明CD27和CD27L之间无显著相关性（P〉0．05）。CD27L蛋白含量在发生神经侵润、淋巴结转移和进展期的患者外周血中显著升高（P〈0．05）。[结论]CD27／CD27L通路与胰腺癌的恶性进展和淋巴结转移有密切关系。     

吗啡对胃癌细胞系HGC27细胞增殖的影响及其机制

目的探讨吗啡对人胃癌细胞系HGC27细胞增殖的影响及其机制。方法体外培养的HGC27细胞,用不同浓度吗啡处理24、48、72 h,四甲基偶氮唑蓝（MTT）法测定其对HGC27细胞增殖的影响;倒置显微镜下观察细胞的形态学变化;实验组用吗啡（浓度分别为0.05、0.1、0.2μmol/L）处理HGC27细胞48 h,对照组加入不含药物的培养基,分别采用流式细胞仪检测细胞凋亡、分光光度计检测细胞凋亡蛋白酶-3（Casepase-3）相对活性、western blot法检p16、bcl-2、bax基因表达情况。结果吗啡（浓度0.025～0.4μmol/L）能抑制HGC27细胞的增殖,呈剂量和时间依赖性;倒置显微镜下可观察到典型的细胞凋亡形态;吗啡（浓度分别为0.05、0.1、0.2μmol/L）作用HGC27细胞48 h后,细胞凋亡率分别为9.4%、11.5%、21.4%,而对照组凋亡率仅为2.2%;Casepase-3相对活性显著增加,处理后Casepase-3相对活性分别为（1.32±0.08）、（1.85±0.06）和（2.45±0.07）,对照组为（0.92±0.07）;p16和bax蛋白表达量升高,而bcl-2蛋白表达量降低,呈剂量依赖性。结论吗啡能抑制HGC27细胞的增殖并诱导其凋亡,其作用机制可能与上调p16表达,进而引起bax蛋白表达量升高,而bcl-2蛋白表达量降低,并增加细胞Casepase-3活性有关。     

P27基因在结直肠癌中的表达及其临床意义

目的 对结直肠癌组织进行p27基因表达的检测,探讨其与临床病理特征的关系.方法 对106例结直肠癌组织及各自的正常大肠黏膜组织应用免疫组织化学SP法进行检测.结果 p27在正常大肠黏膜组织中的表达率为100%（106/106）,而在结直肠癌组织中的高表达率为57.5%（61/106）;Dukes分期A＋B、C＋D高表达率分别为764%（42/55）和37.3%（19/51）;低分化、高中分化高表达率分别为24.0%（6/25）和67.9%（55/81）;有无淋巴结转移的高表达率分别为26.8%（11/14）和76.9%（50/65）.结果 表明,p27基因在组织中的表达差异有统计学意义（均P〈0.05）,p27基因的低表达与结直肠癌的临床分期、组织分化程度和有无转移等临床病理因素有显著相关（均P〈0.05）,而与患者性别、年龄、肿瘤部位及大小等无统计学意义（均P〉0.05）.结论 p27基因表达与结直肠癌的生物学行为和预后有关,可作为结直肠癌预后判断有利的参考依据.     

p27和PCNA在骨肉瘤中的表达及临床意义

目的 研究p27和PCNA在骨肉瘤中的表达情况及它们之间的相互关系.方法 应用免疫组织化学方法 （SP）观察10例正常骨组织和46例骨肉瘤石蜡标本的p27和PCNA的表达情况并进行对比分析和相关性研究.结果 正常骨组织中p27呈高表达,PCNA呈阴性表达,而骨肉瘤中p27呈低表达,PCNA呈高表达.p27和PCNA在正常骨组织和骨肉瘤之间的表达差异有统计学意义（P〈0.05）.2）p27表达与骨肉瘤的组织学分级、预后有关（P〈0.05）,与组织学类型、临床分期无关（P〉0.05）.PCNA表达与骨肉瘤的临床分期、组织学分级、预后有关（P〈0.05）,与组织学类型无关（P〉0.05）.3）p27与PCNA表达呈负相关（rs=-0.63,P〈0.05）.结论 p27、PNCA在骨肉瘤的发生、发展和转移过程中起着重要作用,与骨肉瘤的预后有关.     

CyclinE、p27、p53在皮肤鳞状细胞癌中的表达及相关性

目的探讨CyclinE、p27、p53在皮肤鳞状细胞癌中的表达及相关性。方法采用免疫组化法检测36例皮肤鳞状细胞癌组织中CyclinE、p27、p53,分析三者表达与皮肤鳞状细胞癌分化程度之间的关系及三者之间的相关性。结果CyclinE、p53在皮肤鳞状细胞癌中表达均显著高于正常皮肤,随肿瘤分化程度降低而增强（P〈0．05）;p27在皮肤鳞状细胞癌中表达均显著低于正常皮肤,随肿瘤分化程度降低而减弱（P〈0．05）;CyclinE表达与p53表达呈正相关,与p27表达呈负相关。结论CyclinE、p53在皮肤鳞状细胞癌中的表达上调,p27表达下调,三者与皮肤鳞状细胞癌分化程度存在相关性。     

Skp2和p27在甲状腺良恶性病变中的表达及临床意义

目的本研究探讨Skp2和p27蛋白在结节性甲状腺肿,桥本氏甲状腺炎,结节性甲状腺肿癌变和桥本氏甲状腺炎癌变组中的表达相互关系及意义。方法采用免疫组织化学方法检测19例结节性甲状腺肿、21例桥本氏甲状腺炎、23例结节性甲状腺肿癌变和18例桥本氏甲状腺炎癌变组中Skp2和p27蛋白的表达情况。结果 （1）结节性甲状腺肿癌变组和桥本氏甲状腺炎癌变组中Skp2蛋白的过度表达（82.6%,66.7%）和p27蛋白的低表达（39.1%,61.1%）相比结节性甲状腺肿（0%,89.5%）和桥本氏甲状腺炎（4.8%,100%）组织,差异有显著意义（P〈0.01）。（2）Skp2和p27在甲状腺乳头状癌组织中阳性表达率与患者年龄、性别、癌组织大小均无关（P〉0.05）。（3）在甲状腺乳头状癌中Skp2与p27的表达均呈负相关（r=-0.421,P〈0.01）。结论 （1）Skp2和p27可能参与结节性甲状腺肿癌变和桥本氏甲状腺炎癌变过程。（2）Skp2和p27可能成为良恶性甲状腺疾病的诊断指标。（3）甲状腺乳头状癌中p27可能为Skp2的下游基因,将为甲状腺乳头状癌的治疗开辟新的途径。