γ-氨基丁酸受体ρ2亚基重组蛋白构建及表达

目的构建γ-氨基丁酸受体ρ2(GABA_CR ρ2)基因的原核表达载体,诱导重组蛋白GABA_CR ρ2表达,转染SH-SY5Y细胞,实现GABA_CR ρ2亚基重组蛋白一过性表达。方法构建重组质粒p ET-ρ2-GFP-Tat;应用免疫印迹法检测GABA_CR ρ2表达;应用Ni~(2+)亲和层析柱纯化重组蛋白,十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳检测GABA_CR ρ2蛋白纯度;荧光显微镜下观察GABA_CR ρ2的转导作用及细胞定位。将SH-SY5Y细胞分为正常组和低氧低糖组,正常组分为正常对照组(高糖培养基培养且无蛋白转染)和正常转染组(高糖培养基培养且进行蛋白转染);低氧低糖组分为处理组(低氧低糖条件下培养)和处理转染组(低氧低糖条件下培养且进行蛋白转染);使用细胞计数试剂盒检测各组细胞活力。结果重组质粒p ET30-ρ2-Tat构建正确。纯化后的重组蛋白ρ2-Tat成功透过细胞膜转染SH-SY5Y细胞。正常对照组、正常转染组、处理组和处理转染组的细胞活力分别为(100.0±6.9)%、(89.3±3.6)%、(51.4±3.6)%和(66.1±8.5)%。正常对照组与正常转染组细胞活力比较差异无统计学意义(P>0.05);处理组细胞活力显著低于正常对照组(P<0.01),处理转染组细胞活力显著高于处理组(P<0.01)。结论重组蛋白ρ2在Tat转导肽介导作用下透过细胞膜,成功建立了一过性表达重组蛋白ρ2的SH-SY5Y细胞株,为研究ρ2亚基的功能提供了新的研究方法。     

低氧预适应对小鼠海马HT22细胞线粒体能量代谢的影响

目的 探讨低氧预适应(HPC)对小鼠海马HT22细胞线粒体能量代谢的影响及其可能机制。方法 将小鼠海马神经细胞HT22分为对照组、低氧组、HPC组,通过检测各组三磷酸腺苷(ATP)和活性氧(ROS)的水平,以观察HPC对细胞线粒体能量代谢的影响;采用Western blot法检测雷帕霉素靶蛋白(mTOR)、磷酸化mTOR蛋白和自噬底物P62蛋白的表达;细胞免疫荧光法检测磷酸化mTOR,LysoTracker^TM探针检测溶酶体,验证HPC引起细胞代谢改变是否与mTOR/自噬通路有关。结果 与对照组相比,低氧组ATP明显下降,ROS水平增加,HPC处理后,ATP水平增加,ROS水平降低。与对照组相比,HPC组磷酸化mTOR表达下调,自噬底物P62表达下调。结论 HPC可能通过mTOR/自噬信号通路影响HT22细胞能量代谢从而对HT22细胞发挥保护作用。     

FGF2的生物信息学分析及其在低氧神经保护中的作用研究*

目的: 观察FGF2在低氧及低氧预适应条件下小鼠海马神经元细胞中的表达变化,探究FGF2是否参与低氧耐受神经保护作用。方法: 使用生物信息学方法进行搜索和鉴定FGF2基因家族成员。在细胞层面建立低氧和低氧预适应模型,通过Western-blot、qRT-PCR检测细胞中FGF2表达情况。结果: FGFs家族分为7个亚家族,其中FGF2含有一个由17个氨基酸组成的FGF受体结合域,能够与特定的FGF受体结合进行信号的转导。在细胞层面,相比于空白对照组(C),低氧组(H)和低氧预适应组(HPC)FGF2在mRNA水平和蛋白水平的表达均有所下降(P＜0.05),而与H组相比,HPC组FGF2 mRNA水平和蛋白水平的表达有所升高(P＜0.05)。结论: FGF参与低氧预适应的神经保护作用。     

低氧预适应对阿霉素致心肌细胞损伤的保护作用

目的观察低氧预适应(HPC)对阿霉素致心肌细胞损伤的保护作用。方法将培养的心肌细胞随机分为3组:对照组、阿霉素组、HPC+阿霉素组。MTT法测定心肌细胞存活率;试剂盒检测细胞培养液乳酸脱氢酶(LDH)漏出量;SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和蛋白印迹(Western blot)半定量检测核转录因子-κB(NF-κB)蛋白表达量的改变。结果与对照组相比,阿霉素组心肌细胞存活率显著下降(P0.01),细胞LDH漏出量显著增加(P0.01),NF-κB蛋白表达水平增高显著(P0.01);与单纯阿霉素组相比,低氧预适应组心肌细胞存活率显著升高(P0.01),细胞LDH漏出量显著降低(P0.01),NF-κB蛋白表达水平明显降低(P0.01)。结论阿霉素导致心肌细胞氧化损伤,低氧预适应可能通过抑制NF-κB蛋白表达水平对其起保护作用。     

低氧预适应对神经细胞能量代谢调节作用

低氧预适应是通过亚致死的低氧处理后,激活体内小分子内源性保护机制,让机体对接下来的更严重或致死性低氧刺激产生耐受/抗性。神经细胞是一种能接收和传导兴奋的细胞,对氧含量的变化十分敏感,其能量代谢随氧气变化较为显著。在低氧环境下,神经细胞的腺嘌呤核苷三磷酸(adenosinetriphosphate, ATP)合成减少可激活AMP激活的蛋白激酶[adenosine5’-monophosphate(AMP)-activated protein kinase, AMPK]和TSC1/TSC2复合体抑制哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin, mTOR)。mTOR的一个复合物mTOR复合体1(mTORC1)的表达对机体的能量代谢产生影响。低氧预适应,通过激活或抑制一些基因表达让神经细胞有效利用氧气,使机体产生低氧耐受。在氧浓度低的生存环境下,通过低氧预适应调节能量变化增加机体存活的可能性。高原、航空航天事业、水下作业以及病理性的低氧时,低氧预适应诱导相关分子变化可防止对氧有大量需求的脑组织发生病变,增加神经细胞的存活时间,减少死亡。     

外源性一氧化碳对体外培养的SH-SY5Y细胞的影响

目的 研究不同浓度的外源性一氧化碳(CO)对体外培养的神经细胞SH-SY5Y的影响,进一步探讨CO中毒脑损伤的机制.方法 SH-SY5Y细胞在含有不同浓度CO的装置中培养12 h,然后用MTT法检测细胞存活率,DNA琼脂糖凝胶电泳和流式细胞仪检测细胞凋亡的发生,以激光共聚焦显微镜荧光染色法检测细胞内活性氧的产生和线粒体膜电位的变化,用荧光酶标仪测定caspase-3的活性,并用Western印迹的方法 检测Bax蛋白的表达水平.结果 1000、10000 ppm CO处理SH-SY5Y细胞12 h后显著降低细胞的存活率;诱导细胞发生凋亡,凋亡率分别达29.03%和41.67%;激光共聚焦显微镜结果 细胞内活性氧水平及caspase-3的活性显著升高;线粒体膜电位明显降低,红/绿荧光强度的比值由正常的5.97分别降低为1.56±0.07和0.34±0.02;而且细胞中Bax蛋白表达水平显著升高.而100 ppm CO对体外培养的SH-SY5Y细胞的存活率、caspase-3的活性、活性氧水平、线粒体膜电位以及Bax蛋白的表达无明显影响.结论 高浓度的外源性CO(1000、10 000ppm)对体外培养的SH-SY5Y细胞造成损伤,具有明显的细胞毒性;而低浓度的CO(100 ppm)对SH-SY5Y细胞没有明显的损伤作用.     

氯化钴预处理在培养分化的人神经母细胞瘤细胞株缺氧损伤中的保护作用

目的 探讨氧化钴(CoCl2)对体外培养分化的人神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞株的缺氧损伤保护作用及缺氧诱导因子1、2和其调节基因产物血管内皮生长因子在其中的作用.方法 分化的SH-SY5Y细胞分为对照组、化学缺氧预处理组(细胞用50 μmol/L CoCl2预处理3 h,换液后常氧培养1 h,然后在2%的低氧孵箱内缺氧28 h)、缺氧组(无CoCl2预处理过程,其余同化学缺氧预处理组).用Western blotting法测细胞HIF-1α、HIF-2α和VEGF的蛋白表达,通过乳酸脱氢酶释放率测定、MTT细胞活力测定判断细胞损伤程度.结果 化学缺氧预处理组细胞 HIF-2α和VEGF的蛋白表达显著高于缺氧组(P＜0.01),HIF-1α蛋白表达在两组之间没有显著性差异(P＞0.05),化学缺氧预处理组细胞较缺氧组细胞存活率高、乳酸脱氢酶释放率减少(P＜0.01).结论 CoCl2化学预缺氧可保护分化的SH-SY5Y细胞对缺氧产生耐受,缺氧预处理可能通过HIF-2促进VEGF的表达而产生保护作用.     

miR-103及其靶基因Cav1.2在低氧预适应提升小鼠学习记忆中的表达

目的:探究miR-103和Cav1.2在低氧预适应改善学习记忆能力中的表达变化，阐明miR-103调控Cav1.2在低氧预适应内源性神经保护中的作用机制。方法:使用ICR雄性小鼠作为实验对象，构建正常组(Control)、低氧组(Hypoxia)、低氧预适应组(HPC),通过Morris水迷宫分别评估各组小鼠的学习记忆能力；通过Real-time PCR和Western bolt技术检测小鼠海马组织中miR-103和Cav1.2的表达变化，通过双荧光素酶报告基因检测miR-103和Cav1.2之间的调控关系。结果:小鼠随着低氧次数的增加，低氧耐受时间显著增强。与Control组相比，HPC组小鼠的潜伏期时间明显降低(P<0.05),目标象限时间的百分比增加(P<0.05),平台穿越次数明显增加(P<0.05)。与Control组相比，HPC组小鼠海马组织中miR-103在第1 d表达下调(P<0.000 1)。miR-103-3p通过与Cav1.2的3’UTR结合从而靶向Cav1.2。与Control组相比，HPC组小鼠海马组织中Cav1.2蛋白在第2 d表达升...     

低氧预适应对大鼠脑缺血再灌注神经细胞凋亡和Caspase-3活性的影响

目的探讨低氧预适应(8%O2,3h)对大鼠大脑中动脉缺血2h再灌注后12h神经细胞凋亡及Caspase-3活性的影响。方法低氧预适应后12h制作脑缺血再灌注模型,大鼠大脑中动脉阻塞2h,灌注损伤12h,用TUNEL法和荧光四肽底物法分别检测假手术组、缺血再灌注组和低氧预适应组的凋亡细胞百分率和Caspase-3活性水平。结果与缺血再灌注组比较,低氧预适应组和假手术组的凋亡细胞百分率和Caspase-3活性水平显著降低(P<0.05,P<0.01);低氧预适应组与假手术组比较,细胞凋亡率明显升高(P<0.01),Caspase-3水平反而降低(P<0.01)。结论低氧预适应可减少大脑中动脉缺血2h再灌注后Caspase-3活性,抑制神经细胞的凋亡。     

低氧预适应诱导C6细胞对氧葡萄糖剥夺的耐受

目的：研究低氧预适应诱导神经胶质细胞瘤细胞（C6 Glioma Cells，简称C6细胞）对氧葡萄糖剥夺（OGD）的耐受及其机制。方法：C6细胞通过低氧（1％）预处理，在经受OGD打击后，观测其对细胞活力的影响。利用Western blot分析低氧预适应对C6细胞磷酸化-ERK（p-ERK）、缺氧诱导因子-α（HIF-α）和红细胞生成素（EPO）蛋白的影响；通过PD98059和LY294002的使用，分析低氧诱导C6细胞预适应现象与MEK／ERK通路的关系。结果：低氧能诱导细胞预适应的发生，而且对于24h的OGD，最有效的低氧预适应时间为16h；低氧能诱导细胞p-ERK信号蛋白的上调，激活HIF-α和增加EPO的表达，且能被PD98059所抑制。结论：低氧预适应能增强C6细胞对24hOGD的耐受，产生预保护作用，其中以低氧预适应16h效率最高；MEK／ERK信号转导途径参与了低氧预适应作用；低氧预适应可通过激活HIF-α和增加EPO表达水平来实现。