侵袭及非侵袭性KYSE150细胞的体外分离及p75NTR的表达

目的：体外分离人食管鳞状细胞癌（ESCC）KYSE150细胞系侵袭和非侵袭性细胞亚系,比较2种细胞亚系p75NTR的表达。方法：用涂有Matrigel的Transwell小室对KYSE150进行体外侵袭实验,回收侵袭性和非侵袭性细胞,用免疫细胞化学SP法检测2者p75NTR的表达情况。结果：镜下观察,2种细胞亚系形态无明显差异。侵袭性细胞亚系p75NTR表达较非侵袭性细胞亚系显著增高,差异有统计学意义（P〈0.01）。结论：用涂有Matrigel的Tanswell可成功分离及回收侵袭性和非侵袭性KYSE150细胞;可能存在ESCC干细胞。     

Rab3D对食管鳞状细胞癌细胞系增殖及细胞周期素D1表达的影响

目的探讨Rab3D对人食管鳞状细胞癌细胞系增殖及细胞周期素D1(Cyclin D1)表达的影响。方法采用Western blot法从8株人食管鳞状细胞癌细胞系KYSE410、KYSE450、TE-1、TE-7、KYSE510、KYSE150、EC9706、EC109中筛选出Rab3D表达较低的2株食管鳞状细胞癌细胞株KYSE410、KYSE450及Rab3D表达较高的2株食管鳞状细胞癌细胞株EC109、EC9706,将KYSE410、KYSE450细胞株分别分为转染Rab3D质粒的Rab3D组和转染空载体的对照组,将EC109、EC9706细胞株分别分为转染Rab3D小干扰RNA(siRNA)的Rab3D siRNA组和转染阴性对照的阴性对照组,MTT法检测Rab3D对食管鳞状细胞癌细胞的增殖及Cyclin D1表达的影响,Western blot检测Cyclin D1蛋白的表达。结果 KYSE410、KYSE450食管鳞状细胞癌细胞株转染Rab3D组细胞的吸光度与本细胞株对照组比较,在转染后12 h差异无统计学意义(P>0.05),转染后24、48、72 h均高于本细胞株对照组,差异有统计学意义(P<0.05)。EC109、EC9706食管鳞状细胞癌细胞株转染siRNA组细胞的吸光度在转染后12、24 h与本细胞株阴性对照组比较差异无统计学意义(P>0.05),转染后48、72 h均低于本细胞株阴性对照组(P<0.05)。KYSE410、KYSE450细胞转染Rab3D组Cyclin D1蛋白表达水平较本细胞株对照组增高(P<0.05);EC109、EC9706细胞转染siRNA组的Cyclin D1蛋白表达水平较本细胞株阴性对照组降低(P<0.05)。结论 Rab3D促进食管鳞状细胞癌细胞的增殖,机制可能与促进Cyclin D1的表达有关。     

食管鳞癌上皮细胞间质转化对NK细胞活化及其生物学作用的研究

目的 探讨食管鳞癌上皮细胞间质化（EMT）对自然杀伤（NK）细胞生物学活性的影响。方法 通过Western blot检测EMT化相关蛋白E-cadherin和Vimentin表达,从6株细胞系中筛选出 EMT化和非EMT化食管鳞癌细胞株;收集10例正常人外周血,负性分选NK细胞;根据共培养不同的条件培养基分为RPMI 1640正常培养基刺激-NK组（NC组）、EC9706细胞上清液刺激-NK组（EC9706组）与KYSE150细胞上清液刺激-NK组（KYSE150组）,将不同的条件培养基加入NK细胞共培养72 h,流式细胞术检测NK细胞表面/胞内分子的表达。10 ng/mL 转化生长因子-β（TGF-β）处理KYSE150细胞株7 d诱导EMT化后,收集KYSE150 EMT和KYSE150上清液,分别与NK细胞共培养,72 h后以流式细胞术检测NK细胞表面/胞内分子的表达、CD107a脱颗粒能力、靶细胞K562杀伤效应、NK细胞增殖及凋亡。结果 6株细胞系中筛选出2株EMT化和4株非EMT化的食管鳞癌细胞株,从中各选出一株（EC9706和KYSE150）用于后续实验;NK细胞负性筛选达到90%以上的纯度,T细胞<1%。不同的食管鳞癌细胞上清液刺激后,3组NK细胞表面活化型、抑制型受体,效应分子结果显示:与NC组和KYSE150组比较,EC9706组活化型受体NKP30、NKG2D、NKP44表达,颗粒酶释放均降低（ P<0.05）;抑制型受体NKG2A和CD158b表达增加（ P<0.05）;NKP46、CD226、CD16表达和穿孔素释放在3组间差异无统计学意义。与KYSE150上清刺激比较,KYSE150 EMT上清刺激后,NK细胞活化型受体NKP30、NKG2D、NKP44表达,穿孔素释放均降低;CD107a脱颗粒作用、靶细胞K562杀伤效应均减弱,NK细胞Ki67增殖指数下降（ P<0.05）;抑制型受体NKG2A和CD158b表达增加（ P<0.05）;NKP46、CD226、CD16表达,颗粒酶释放及NK细胞凋亡在两组间差异无统计学意义。结论 食管鳞癌细胞EMT化可能通过抑制NK细胞活化、减少NK细胞杀伤效应分子的分泌来降低NK细胞杀伤效应,从机体免疫监视中逃逸。     

蝎毒多肽优化体CT-K3K7抗食管癌的机制研究

目的 探讨蝎毒多肽优化体CT-K3K7对食管癌细胞的作用及机制。方法 采用CCK-8法检测蝎毒多肽优化体CT-K3K7对食管癌细胞KYSE70与KYSE150增殖的影响;克隆形成实验检测CT-K3K7对KYSE70与KYSE150克隆形成的影响;划痕实验检测CT-K3K7对KYSE70与KYSE150细胞迁移能力的影响;PI吸收实验检测CT-K3K7对KYSE70与KYSE150的细胞膜完整性的影响;流式细胞术检测CT-K3K7对KYSE70与KYSE150细胞线粒体膜电位、ROS水平及凋亡率的影响;Western blot检测CT-K3K7对KYSE70与KYSE150细胞中3种凋亡相关蛋白Caspase-3、Bcl-2和Bax表达水平的影响。结果 蝎毒多肽优化体CT-K3K7作用后,食管癌细胞KYSE70与KYSE150的增殖与迁移能力受到抑制;细胞膜通透性增强;细胞内线粒体膜电位降低、ROS富集且细胞凋亡率明显升高;抗凋亡蛋白Bcl-2蛋白表达量随着CT-K3K7作用浓度的升高显著下调,而促凋亡蛋白Bax和凋亡效应蛋白Caspase-3表达量则随着CT-K3K7的作用浓度升高显著...     

AJUBA在食管鳞状细胞癌KYSE150细胞中的功能

目的 研究AJUBA对食管鳞状细胞癌(ESCC)细胞迁移与增殖的作用.方法 用慢病毒转染AJUBA的短发夹RNA(short hairpin RNA,shRNA)至KYSE150细胞系,实验分为对照组与敲降组,其中对照组包括KYSE150组(未转染的KYSE150细胞)和KYSE150shnon组(转染随机序列),敲降...     

具核梭杆菌诱导内质网应激相关蛋白GRP78及XBP1高表达在食管鳞癌中的临床意义

【目的】分析食管鳞癌（ESCC）中具核梭杆菌（Fn）对内质网应激相关蛋白葡萄糖调节蛋白78(GRP78)及X盒结合蛋白1(XBP1)的诱导效应,并探讨其潜在机制及临床意义。【方法】采用Fn感染ESCC细胞KYSE150及KYSE140不同时间（12 h、24 h及48 h）,通过氧化应激指标试剂盒及Western blot检测各组细胞中氧化应激指标（ROS、MDA与SOD）及GRP78与XBP1的表达情况。实验分为Fn组,Fn+siNC1组,Fn+siGRP78组,Fn+siNC2组及Fn+siXBP1组,比较各组细胞中氧化应激指标、紫杉醇（PTX）应答效力、增殖、侵袭及转移能力差异。采用RNA scope及免疫组化法检测234例ESCC组织及癌旁组织中Fn感染及GRP78与XBP1的表达情况。利用卡方检验分析各因素与患者临床病理特征之间的相关性。采用Kaplan-Meier生存分析比较各因素对患者生存期的影响。【结果】与Fn未感染的KYSE150及KYSE140组细胞相比,Fn感染组（12 h、24 h及48 h）细胞中ROS与MDA含量逐渐增加,SOD活性逐渐降低,且GRP78及X...     

具核梭杆菌富集髓源抑制细胞对食管鳞状细胞癌患者预后的影响

目的:探讨具核梭杆菌(Fn)富集髓源抑制细胞(MDSC)对食管鳞状细胞癌(ESCC)患者预后的影响。方法:采用免疫荧光法检测Fn感染KYSE150细胞情况。将健康人PBMC分别给予：体外单独培养(对照组),与KYSE150体外共培养(KYSE150组),Fn感染(Fn组),Fn感染且与KYSE150体外共培养(KYSE150+Fn组);各组分别于培养24、48和72 h后采用流式细胞术检测PBMC中MDSC(CD45⁺HLA-DR^-CD11b⁺CD33⁺细胞)百分比。采用RNAscope及免疫组化SP法分别检测130例ESCC组织中Fn感染和MDSC富集情况。比较Fn+MDSC阳性组与阴性组ESCC患者的临床病理特征及预后的差异。采用Cox回归分析ESCC患者预后的影响因素。结果:Fn可成功感染KYSE150细胞,并定植于细胞质。与KYSE150共培养及Fn感染均可升高PBMC中MDSC百分比,且两者存在协同作用(P<0.05)。ESCC组织中Fn感染与MDSC富集具有较高一致性(Kappa=...     

沉默线粒体核糖体蛋白L35基因对人食管癌TE-1细胞生长的影响

目的：探讨慢病毒介导沉默线粒体核糖体蛋白L35（MRPL35）基因对人食管癌TE-1细胞生长的影响,并阐明其机制。方法：选择3种人食管癌TE-1、ECA109和KYSE150细胞,采用实时定量PCR法检测3种细胞中MRPL35 mRNA相对表达水平。食管癌TE-1细胞分为shMRPL35组和shCtrl组,分别加入沉默靶基因带有嘌呤霉素抗性的si-RNA慢病毒和带有嘌呤霉素抗性的阴性对照si-RNA慢病毒进行感染,建立稳定沉默MRPL35基因的食管癌细胞系,实时定量PCR及Western blotting法检测各组细胞中MRPL35基因沉默效率,采用CCK-8法检测各组细胞生长曲线,Annexin Ⅴ-PE/7AAD双染色后流式细胞术检测细胞凋亡率。结果：3种食管癌细胞均表达MRPL35基因,3种细胞中MRPL35 mRNA表达水平比较差异无统计学意义（P>0.05）。实时定量PCR法和Western blotting法检测,shMRPL35组TE-1细胞中MRPL35 mRNA和蛋白表达水平明显低于shCtrl组（P<0.05）。与shCtrl组比较,shMRPL35组TE-1细胞生长速度明显降低（P<0.05）,凋亡率明显升高（P<0.01）。结论：沉默MRPL35基因可抑制食管癌细胞TE-1增殖,并通过凋亡途径发挥作用。     

MC1R在食管鳞癌细胞和组织中高表达

目的 通过分析MC1R在食管鳞癌细胞和组织中的表达水平及其与相关临床病理参数的相关性,探讨MC1R在食管鳞癌中的临床意义。方法 通过生物信息学分析MC1R在食管癌中的表达情况;以RT-PCR和Western blotting方法比较分析人食管上皮细胞BAr-T、人食管鳞癌细胞ECA109、KYSE30、KYSE150、KYSE510、TE-1、TE-13、EC9706、人胃癌细胞SGC7901及19对食管鳞癌组织和对应癌旁组织中MC1R的表达水平;以IHC方法比较分析32对食管鳞癌组织切片和对应癌旁组织切片中MC1R的表达水平;使用t检验进行组间MC1R表达量的差异比较,使用Fisher’s精确检验分析MC1R表达水平与临床病理特征之间的关系。结果 生物信息学分析显示MC1R在食管癌组织中显著高表达（P<0.05）;食管鳞癌细胞ECA109、KYSE30、KYSE510、TE-13、EC9706和胃癌细胞系SGC7901中MC1R表达量高于食管上皮细胞（P<0.05）;食管鳞癌组织切片中MC1R相对表达量显著高于癌旁组织（P<0.05）。MC1R高表达现象主要存在于老...     

RIP1增强顺铂诱导食管癌细胞的凋亡

目的：探讨受体相互作用蛋白1( RIP1)增强顺铂( DDP)诱导食管癌细胞凋亡的敏感性。方法单溶液细胞增殖分析( MTS )法检测不同浓度 DDP 对食管癌细胞株KYSE510、KYSE410的增殖抑制作用;Annexin V/PI 双染流式细胞术检测细胞凋亡;Western blot法检测RIP1、半胱天冬氨酸蛋白酶3(caspase-3)、PARP的蛋白表达。结果 DDP诱导食管癌细胞凋亡具有剂量和时间相关性。凋亡率随剂量增加和时间延长升高, RIP1蛋白的表达升高, DDP 联合RIP1特异性抑制剂处理食管癌细胞后,较敏感的KYSE510凋亡率明显减少。结论 RIP1可能参与了DDP诱导食管癌细胞凋亡的作用。     

CAPN4与食管鳞形细胞癌增殖和迁移关系的体外研究

 目的 探讨钙蛋白酶小亚基1(calpain small subunit 1,CAPN4)在食管鳞形细胞癌细胞系中的表达水平,分析其与食管鳞形细胞癌细胞增殖和迁移能力的相关性。 方法 挑选人正常食管上皮细胞系HEEC及食管鳞形细胞癌细胞系EC109与KYSE510,应用Western blot检测细胞系中CAPN4蛋白质水平,应用RNA干扰下调EC109与KYSE510中CAPN4的表达水平,通过CCK-8与Transwell实验分别检测细胞增殖与迁移能力的变化。同时用Western blot检测细胞系中增殖和迁移相关蛋白质水平。结果 CAPN4在EC109与KYSE510中的蛋白质水平显著高于HEEC,下调EC109与KYSE510中CAPN4蛋白质水平后,细胞增殖与迁移能力均显著降低(P<0.05),MMP-2蛋白质水平下调。 结论 CAPN4在食管鳞形细胞癌中高表达,促进食管癌增殖和迁移,并与下游分子MMP-2的表达水平密切相关。     

食管鳞状细胞癌survivin表达与其CpG岛甲基化的研究

目的探讨食管鳞状细胞癌(esophageal squamous cell carcinoma,ESCC)肿瘤组织survivin基因的表达与其CpG岛甲基化状态的关系。方法采用RT-PCR的方法检测ESCC细胞株、ESCC肿瘤组织及对应的远癌组织中的sur-vivin基因mRNA的表达;采用亚硫酸氢钠修饰后测序法(BSP)检测survivin基因CpG岛甲基化状态。结果ESCC肿瘤组织survivin mRNA表达阳性率为65.5%,而绝大部分远癌组织表达阴性;20例survivin表达阳性的肿瘤组织、survivin表达阴性的远癌组织及5株ESCC细胞所扩增片段中的CpG位点均呈非甲基化状态。结论ESCC组织中survivin的表达与否与其CpG岛的甲基化状态无关,提示该区域的甲基化修饰未参与调控survivin基因的转录。     

人食管鳞癌细胞株中RIZ1基因启动子区甲基化状态的研究

目的:探讨6种人食管鳞癌细胞株KYSE150,KYSE510,TE13,EC9706,CaEs17和EC109中RIZ1基因启动子区的甲基化状态;观察特异性DNA甲基转移酶抑制剂5-Aza-CdR对存在甲基化的细胞株RIZ1基因的转录调控作用及其对该细胞生长增殖的影响。方法:甲基化特异PCR(MSP)法检测6种人食管鳞癌细胞株中RIZ1基因启动子区的甲基化状态;实时定量PCR法检测5-Aza-CdR处理前后RIZ1基因启动子区CpG岛高度甲基化的人食管鳞癌细胞株TE13中RIZ1 mRNA表达量的变化;MTT法检测5-Aza-CdR对TE13细胞生长增殖的影响。结果:(1)6种人食管鳞癌细胞株中TE13,CaEs17,EC109三株细胞RIZ1基因启动子区存在甲基化;(2)5-Aza-CdR处理细胞株TE13后,RIZ1 mRNA表达量上调;(3)5-Aza-CdR能抑制TE13的生长增殖,并随时间的延长和浓度的增加抑制作用变明显。结论:启动子区CpG岛高度甲基化是人食管鳞癌细胞株TE13 RIZ1基因表达沉默的重要原因;5-Aza-CdR能使TE13 RIZ1 mRNA表达上调;并能抑制TE13细胞的生长增殖,并呈时间和浓度依赖性。     

成束蛋白、细胞角蛋白14在食管鳞癌中的表达

目的 检测和分析食管鳞癌组织、癌旁正常鳞状上皮及食管鳞癌细胞系中成束蛋白（fascin）和细胞角蛋白14（CK14）的表达情况,探讨这两种细胞骨架蛋白及相关蛋白在食管鳞癌发生发展中可能的作用及在食管鳞癌诊断中的应用前景。方法 收集116例食管鳞癌组织标本,构建组织芯片。用免疫组化方法检测鳞癌组织与癌旁正常鳞状上皮中成束蛋白、CK14的表达情况,并分析它们与临床病理特征、预后的关系及两种蛋白之间的相关关系。用Western印迹方法检测12种食管鳞癌细胞系中成束蛋白、CK14的表达情况,并分析它们与生长和侵袭特点的关系。结果成束蛋白和CK14在食管正常鳞状上皮阴性（基底细胞除外）,在食管鳞癌组织明显上调,阳性率分别为79．3％和67．0％,两者联合阳性率高达86,2％。成束蛋白和CK14在高、中分化鳞癌中表达更高（成束蛋白在高、中、低分化鳞癌阳性率为87．1％、83．9％、62．1％,P=0．054;CK14在高、中、低分化鳞癌阳性率为87．1％、76．4％、27．6％,P〈0．01）。两种蛋白表达与预后无明显关系（P=0．8980和P=0,2610）。两种蛋白表达呈正相关（r=0．487,P〈0．01）。成束蛋白在绝大多数细胞系高表达,仅在生长和侵袭能力弱的TE12细胞系中无表达,而CK14仅在KYSE180细胞系中表达。结论 成束蛋白、CK14在食管鳞癌普遍表达上调,可能在食管鳞癌发生发展中起重要作用。联合应用还有望成为食管鳞癌诊断的有效标志物。     

MACC1表达与胸中段食管鳞癌侵袭､转移的关系

目的:研究结肠癌转移相关基因(MACC1)在食管鳞癌中的表达及其与淋巴结转移的关系?方法:采用Western blot方法检测食管鳞癌细胞株和40例胸中段食管鳞癌组织及配对癌旁组织中MACC1蛋白的表达情况?结果:KYSE510? EC109 两种食管鳞癌细胞株中MACC1蛋白相对表达量分别为0.413 ± 0.175?0.876 ± 0.202,差异有统计学意义(P < 0.05)?40例配对胸中段食管鳞癌组织中,MACC1蛋白表达水平癌组织为0.513 ± 0.228,癌旁组织为0.248 ± 0.179,癌组织和配对癌旁组织表达差异有统计学意义,且在伴有淋巴结转移的癌组织中表达量明显较高(P < 0.05)?结论:MACC1与食管鳞癌的发生?发展及转移密切相关?     

miR-143通过负向调控Bcl-2抑制食管癌细胞的增殖

目的探讨miR-143通过负向调控B淋巴细胞瘤-2(Bcl-2)抑制食管癌细胞的增殖。方法 RTPCR法检测食管癌细胞TE-1、EC109、EC9706、KYSE150、KYSE510、SEG-1及人正常食管上皮细胞HEEC中miR-143表达,使用脂质体Lipofectamine~(TM) 2000将miR-143 mimics和miR-143 NC转入EC9706细胞中,48 h后,RT-PCR法检测miR-143表达,CCK-8法检测细胞活力,Ed U染色检测细胞增殖情况,流式细胞术检测细胞周期,RT-PCR及Western blot检测Bcl-2蛋白及mRNA的表达。结果 miR-143在食管癌细胞TE-1,EC109,EC9706,KYSE150,KYSE510及SEG-1中的表达量[(1.36±0.13),(1.08±0.10),(0.89±0.09),(0.95±0.09),(1.32±0.14),(0.96±0.11)]显著低于miR-143在人正常食管上皮细胞HEEC(2.38±0.15)中的表达量(P0.01)。与miR-143 NC组比较,miR-143 mimics组miR-143表达量显著升高(P0.01),细胞活力下降(P0.01),细胞增殖能力降低(P0.01),细胞周期阻滞在G1期(P0.01),同时Bcl-2蛋白及mRNA表达量显著降低(P0.01)。结论miR-143过表达能通过下调Bcl-2表达抑制EC9706细胞增殖。     

CAPZA1的3′UTR的高表达对食管癌细胞的增殖、侵袭的影响

目的 探究CAPZA1的3＇UTR的高表达对食管癌细胞的增殖和迁移的影响.方法 提取10株食管癌细胞系的总DNA及RNA,对CAPZA1的3＇UTR进行测序,并采用实时定量PCR方法检测其在10株食管癌细胞系中的表达量情况.将构建的高表达CAPZA1的3＇UTR的质粒和对照质粒瞬时转入KYSE180中,采用流式细胞检测高表达后对细胞凋亡的影响.采用MTS及克隆形成实验检测CAPZA1的3＇UTR高表达后对细胞增殖和生长的影响.利用Transwell实验检测高表达后对食管癌迁移、转移能力的影响.结果 测序结合real-time PCR结果选择KYSE180作为实验对象,之后实验证明CAPZA1的3＇UTR高表达后可以促进细胞生长和增殖并且可以促进细胞的侵袭.结论 CAPZA1的3＇UTR的高表达是具有促癌的作用的.