膜-细胞骨架联接分子ezrin对肝癌细胞系生长和侵袭能力的影响

目的探讨膜-细胞骨架联接蛋白ezrin在肝细胞肝癌生长和转移过程中的作用。方法分别应用免疫荧光、逆转录聚合酶链反应（RT—PCR）和Western blot检测ezrin和骨架蛋白在不同转移潜能肝癌细胞系中的表达。选取高转移潜能SF7721（SMMC-7721经转基因后稳定表达肝细胞生长因子，从而获得高转移潜能的细胞系）和MHCC97-H细胞系为研究对象。通过RNA干扰技术下调SF7721和MHCC97-H细胞系中ezrin蛋白的表达，观察其运动和侵袭能力的变化：通过四甲基偶氮唑盐检测细胞增殖能力变化；电子显微镜观察细胞伪足；Transwell检测细胞的运动侵袭能力。结果免疫荧光显示ezrin和骨架蛋白表达于细胞质，且双色荧光证实两者存在共表达，高转移潜能细胞系SF7721。MHCC—I、MHCC97-Hezrin和骨架蛋白的表达明显高于低转移潜能细胞系SMMC-7721、Hep3B、HepG2细胞（x^2=13．277，P=0．010；x^2=21．815，P〈0．01）。D-肌动蛋白在高低转移潜能细胞系的表达差异无统计学意义。通过RNA干扰技术抑制ezrin蛋白表达后。SF7721和MHHC97-H的细胞的增殖和侵袭能力均显著下降。结论ezrin和骨架蛋白的过表达与肝癌的转移潜能相关，通过下调ezrin的表达可明显抑制肝癌细胞系SMMC-7721和MHCC97-H细胞的增殖和运动侵袭能力。     

NRF2/PI3K通路介导肝癌细胞SMMC-7721出现索拉非尼耐药的机制研究

目的探讨NRF2PI3K通路介导肝癌细胞SMMC-7721出现索拉非尼耐药的机制研究。方法建立肝癌细胞系SMMC-7721耐药细胞株SMMC-7721-SR,构建NRF2-siRNA转染肝癌细胞,并给与10μmol/L索拉非尼处理48 h。采用CCK-8法检测细胞活力,采用流式细胞仪检测细胞凋亡,Western blot检测NRF2、Keap1、ARE、p-PI3K和p-Akt蛋白表达水平。Real-Time PCR检测NRF2、Keap1、ARE、p-PI3K和p-Akt基因表达水平。结果索拉非尼明显抑制肝癌细胞SMMC-7721的存活率,促进肝癌细胞SMMC-7721凋亡发生(P0.05)。索拉非尼对SMMC-7721细胞促凋亡作用明显强于SMMC-7721-SR细胞(P0.05)。SMMC-7721-SR细胞中NRF2蛋白水平及mRNA表达明显高于SMMC-7721细胞,Keap1、ARE、PI3K和Akt蛋白水平及mRNA表达明显增加(P0.05)。索拉非尼明显上调SMMC-7721细胞中NRF2蛋白水平及mRNA表达(P0.05)。抑制NRF2 mRNA表达并给予索拉非尼处理后,SMMC-7721-SR细胞存活率明显降低,凋亡率显著升高,Keap1、ARE、p-PI3K和p-Akt蛋白水平及mRNA表达明显降低(P0.05)。结论索拉非尼激活NRF2后诱导肝癌细胞SMMC-7721出现耐药;抑制NRF2可逆转肝癌细胞SMMC-7721对索拉非尼的耐药情况。     

抗人VEGF发卡状核酶基因的构建及其对肝癌细胞VEGF蛋白表达的影响

利用计算机辅助设计合成针对人VEGF的发卡状核酶（RZ），定向亚克隆于真核表达载体pcDNA3．1^＋中，转染肝癌细胞SMMC-7721，RT—PCR鉴定。ELISA法和MTT法检测SMMC-7721细胞对照组、SMMC-7721／pcDNA3．1^＋空载体对照组和SMMC-7721／RZ基因转染组细胞VEGF表达和增殖情况，流式细胞术检测各组细胞周期和凋亡情况。结果为SMMC-7721／RZ基因转染组细胞VEGF表达水平和细胞增殖速率显著低于SMMC-7721细胞对照组和SMMC-7721／pcDNA3．1’空载体对照组。MC-7721／RZ基因转染组细胞出现凋亡峰，其凋亡率达11．O％，而细胞对照和空载体细胞对照均末出现。认为SMMC-7721／RZ转基因细胞株的成功构建和生物学特性的初步研究为进-步建立裸鼠人肝癌模型及评价RZ对体内肝癌生长的抑制作用奠定了-定的基础。     

缺氧环境中黏着斑激酶对SMMC-7721细胞侵袭能力的影响

目的 研究缺氧对人肝癌细胞SMMC-7721黏着斑激酶(FAK)表达的影响以及FAK表达对SMMC-7721细胞侵袭能力的影响.方法 通过1%体积分数O2的低氧培养建立人肝癌细胞SMMC-7721物理缺氧模型,Western blot检测FAK的表达.构建针对FAK mRNA的干扰质粒pshRNA-FAK及阴性对照质粒pGensil-2,并将其转染至SMMC-7721细胞,G418筛选稳定转染细胞株.Western blot检测FAK蛋白表达的变化,细胞迁移和侵袭实验检测缺氧条件下细胞迁移和侵袭能力的改变.在正常条件下将FAK真核表达质粒pcDNA3-FAK转染至SMMC-7721细胞,观测其侵袭能力的改变.根据数所资料的不同分别采用t检验、单因素方差分析,LSD法及Dunnett法进行统计学处理. 结果低氧培养的SMMC-7721细胞FAK蛋白表达水平逐渐升高,24 h后较0 h时明显升高(P<0.01).SMMC-7721细胞稳定转染pshRNA-FAK后,FAK蛋白表达显著下降,抑制率达74.6%±5.1%,在正常及缺氧条件下都对FAK表达有显著抑制作用.细胞迁移实验结果显示,缺氧显著促进SMMC-7721细胞迁移能力(t=18.66,P<0.01),侵袭实验结果与迁移实验结果一致.转染pshRNA-FAK对促进SMMC-7721细胞在缺氧环境中的迁移能力有显著抑制作用,透膜细胞数(353±36)个较对照组(392±31)个明显降低(F=173.983,P<0.05);细胞侵袭实验显示,转染pshRNA-FAK对促进SMMC-7721细胞侵袭能力有显著抑制作用,透膜细胞数(160±12)个较对照组(194±13)个明显降低(F=59.674,P<0.05).同时转染真核表达质粒pcDNA3-FAK显著促进SMMC-7721细胞侵袭能力.结论 缺氧促进SMMC-7721细胞侵袭可能与FAK表达水平升高相关,FAK表达的上调可能是缺氧促进肝癌细胞侵袭转移的机制之一.     

氯化两面针碱对肝癌细胞增殖的抑制作用及机制探讨

目的探讨氯化两面针碱（NC）对体外培养的肝癌SMMC-7721细胞（以下简称肝癌细胞）DNA聚合酶6催化亚基基因P125蛋白的影响。方法取对数生长期的SMMC-7721肝癌细胞分为给药组和对照组,给药组分别予0．15、0．30、0．60mg／L的NC作用10d。采用集落形成试验观察SMMC-7721细胞的增殖抑制作用;Westernblot法检测P125蛋白表达。结果与对照组相比,给药组NC作用后肝癌细胞集落形成数量明显减少（P〈0．05）,并呈现剂量依赖性。给药组P125蛋白表达明显降低,呈剂量依赖性。结论NC可明显抑制肝癌细胞增殖,其作用机制之一可能是从蛋白水平抑制P125表达。     

三氧化二砷对肝癌细胞侵袭转移的影响及机制

目的 探讨三氧化二砷(As2O3)抗肝癌侵袭转移的机制.方法 体外培养人肝癌细胞株SMMC-7721,将0、1.0、2.0 μmol/L浓度的As2O3作用于SMMC-7721细胞,采用过河实验检测肿瘤细胞体外运动;MTT法观察细胞黏附能力;Transwell体外侵袭转移模型检测细胞迁徙、侵袭能力;并用PCR法检测乙酰肝素酶(HPA)mRNA表达.结果 0、1.0、2.0 μmol/L As2O3作用SMMC-7721细胞后,表现为过河时间延长,细胞黏附抑制率明显上升,过膜细胞数减少(P＜0.01),HPA基因表达量降低(P均＜0.01);且呈剂量依赖性.结论 As2O3可明显抑制人肝癌细胞SMMC-7721细胞黏附、迁徙和侵袭能力,下调HPA mRNA表达,此可能为其抗肿瘤侵袭转移作用的机制之一.     

环状RNA hsa_circ_0091579对肝癌细胞增殖、迁移和侵袭的影响

目的探究环状RNA(circRNA)hsa_circ_0091579在肝细胞癌(HCC)细胞系中的表达及其对HCC细胞增殖、迁移和侵袭的影响。方法体外培养人肝癌细胞系SMMC-7721、HuH-7、MHCC-97H、HepG2和人正常肝细胞系HL-7702。从细胞中提取RNA,用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测hsa_circ_0091579在HCC细胞系及人正常肝细胞系中的表达,并进行对比。针对hsa_circ_0091579的环化拼接位点设计siRNA,在体外HepG2和HuH-7细胞中转染hsa_circ_0091579 siRNA,并用qRT-PCR验证其有效性。实验分为siRNA组(hsa_circ_0091579 siRNA)和NC组(negative control siRNA),并在HepG2和HuH-7细胞中用CCK8实验、流式细胞术、划痕实验以及Transwell实验分别研究hsa_circ_0091579对细胞增殖、凋亡、迁移和侵袭的影响。使用双荧光素酶报告基因实验对预测的靶点进行验证。计量资料两组间比较采用t检验。结果与hsa_circ_0091579在人正常肝细胞系HL-7702中的表达水平相比,其在HCC细胞系SMMC-7721、HuH-7、MHCC-97H、HepG2中的表达水平均明显升高(t值分别为14.27、36.34、26.70、36.16,P值均0.001)。与NC组相比,hsa_circ_0091579 siRNA可在HepG2和HuH-7细胞中有效沉默hsa_circ_0091579(t值分别为14.22、27.20,P值分别为0.005、0.001)。CCK8实验和流式细胞术结果显示,与NC组相比,siRNA组HepG2和HuH-7细胞的增殖活性明显降低,凋亡率明显升高,差异均有统计学意义(P值均0.05);划痕实验和Transwell实验显示,与NC组相比,siRNA组HepG2和HuH-7细胞的迁移和侵袭能力明显减弱(t值分别为19.63、13.61、20.75、18.45,P值分别为0.003、0.005、0.002、0.003)。荧光素酶报告基因实验结果显示,与NC组相比,miR-149、miR-490-5p和miR-502-5p均能明显降低野生型荧光素酶质粒的活性(t值分别为10.01、9.13、61.49,P值分别为0.010、0.012、0.001)。结论 hsa_circ_0091579在HCC细胞系中高表达,可能通过抑制miR-149、miR-490-5p和miR-502-5p发挥其癌基因的作用。     

不同转移潜能人肝癌细胞株趋化因子受体谱差异表达

目的对比观察不同转移潜能人肝癌细胞株趋化因子受体谱差异性表达。方法Pre- mier软件设计18对趋化因子受体引物,RT-PCR分析SMMC-7721、MHCC97-L、MHCC97-H和HCCLM6细胞侵袭转移潜能逐渐增强的人肝癌细胞株趋化因子受体谱。结果4组不同转移潜能细胞株趋化因子受体表达谱存在明显差异（P＜0．01）,其中CCR10、CXCR4、CXCR6表达随转移潜能增加逐渐降低。HCCLM6表达谱中CCR3、CCR4、CCR10、CCR12及XCR1比SMMC-7721表达明显降低甚至缺失（P＜0．01）,而CXCR1（P=0．006）、CXCR5（P=0．003）表达高于低转移潜能组SMMC-7721。MHCC97-H和MHCC97-L比较,除CXCR2、CXCR6、XCR1外差异均有统计学意义,其中CCR1（P=0．002）、CCR2（P=0．004）、CCR5（P=0．046）表达高于MHCC97- L。CXCR4在模板减量时只能在SMMC-7721组检测到。结论高低转移潜能肝癌细胞株趋化因子受体表达在mRNA水平存在差异性表达,与肝癌细胞株差异性转移潜能相关。     

中药抗癌灵诱导人肝癌SMMC-7721细胞凋亡及其机制研究

目的 探讨复方中药抗癌灵对人肝癌SMMC-7721细胞凋亡及凋亡相关基因survivin和caspase-3表达的影响.方法 肝癌SMMC-7721细胞,以含100 U/ml青霉素、100 μg/ml链霉素、10% FBS的RPMI 1640培养液,在37℃、5%CO2的培养箱中培养,细胞生长至对数增殖期,更换含0、10、20、40 ml/L 抗癌灵新鲜培养液,用DDP(25 mg/L)为阳性对照组,药物作用时间均为48 h.采用MTT法检测细胞抑制率,TUNEL法检测细胞凋亡率,半定量RT-PCR检测survivin和caspase-3 mRNA表达.结果 与正常对照组相比,抗癌灵各浓度组细胞抑制率显著升高(P＜0.001),细胞凋亡率明显上升(P＜0.01),Caspase-3 mRNA表达显著上升(P＜0.05,P＜0.01),Survivin mRNA表达明显下降(P＜0.05,P＜0.01).结论 复方中药抗癌灵具有诱导肝癌SMMC-7721细胞凋亡的作用,其分子机制可能与上调caspase-3和下调survivin基因表达有关.     

VEGF促进肝癌SMMC-7721细胞侵袭性的自分泌机制

目的:探讨促血管内皮生长因子(VEGF)对人肝癌细胞SMMC-7721侵袭力以及对该细胞中基质金属蛋白酶9(MMP-9)的影响,初步研究VEGF对肿瘤侵袭和转移的影响及可能的作用机制.方法:使用VEGF体外培养人肝癌SMMC-7721细胞,通过细胞体外侵袭实验检测细胞侵袭能力的改变,再分别使用30μg/L、10μg/LVEGF培养人肝癌SMMC-7721细胞,以正常培养人肝癌SMMC-7721细胞为空白对照组.使用半定量RT-PCR和Western blot法对3组细胞中MMP-9的mRNA和蛋白表达水平进行分析.结果:细胞体外侵袭实验显示,外加VEGF培养后,细胞侵袭力明显增强(P0.01);MMP-9mRNA和蛋白的表达在外加VEGF组中要明显高于空白对照组(0.479±0.025,0.665±0.024vs 0.315±0.022;0.521±0.026,0.662±0.026vs 0.366±0.025,均P<0.01),且高浓度和低浓度组之间也有明显差别.结论:肝癌SMMC-7721细胞系中存在有自分泌机制,VEGF可通过自分泌机制上调肝癌细胞的MMP-9表达,进而促进肿瘤的浸润转移.     

XPD对SMMC-7721肝癌细胞中DNp73和GADD45β的调控及意义

目的:观察人剪切修复基因人类着色性干皮病D组基因(xeroderma pigmentosum group D,XPD)转染至人肝癌细胞株SMMC-7721细胞后XPD、DNp73和GADD45β基因的表达变化以及对肝癌细胞生长的影响.方法:实验分4组:重组质粒SMMC-7721-pEGFP-N2-XPD(XPD组)、空载质粒SMMC-7721-pEGFP-N2组(N2组),脂质体组和SMMC-7721细胞空白对照组.应用Lipofectamine2000脂质体瞬时转染,逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)和蛋白印迹(Western blot)法检测转XPD基因后,人肝癌细胞株SMMC-7721细胞中DNp73以及GADD45β的mRNA和蛋白质的表达量变化,并用四甲基偶氮唑盐(MTT)法检测细胞增殖的活力,流式细胞仪检测细胞凋亡的变化.结果:荧光显微镜下,XPD组和N2组细胞中观察到绿色荧光蛋白表达,说明转染成功;RT-PCR检测显示:XPD组中DNp73 mRNA相对表达量较其他3组显著下调,XPD和GADD45βmRNA相对表达量较其他3组明显上调(均P<0.01);Western blot检测显示:XPD、DNp73以及GADD45β蛋白相对表达量在各组间的差异与其mRNA各组间差异一致;MTT检测示:SMMC-7721细胞空白对照组、脂质体组、N2组、XPD组的吸光度(A)值分别为0.633±0.012,0.623±0.009,0.628±0.016,0.384±0.011,XPD组低于其他3组,差异均有统计学意义(均P<0.01),表明转染XPD后SMMC-7721细胞的增殖能力减弱.流式细胞仪检测SMMC-7721肝癌细胞凋亡:转染XPD的SMMC-7721细胞凋亡显著,凋亡率达56.53%,而其他3组均未见明显凋亡.结论:XPD基因在肝癌的发生发展中起抑制作用,癌基因DNp73的表达随XPD表达增加而降低,抑癌基因GADD45β则随XPD表达增加而增加,提示两者可能在XPD抑制肝癌细胞的生长机制中起重要作用.     

敲减LncRNA TPT1-AS1抑制肝癌细胞侵袭及迁移

背景长链非编码RNA(long non-coding RNA,lncRNA)肿瘤蛋白翻译调节因子1-反义RNA1(tumor protein translationally controlled regulator 1-antisence RNA 1,TPT1-AS1)TPT1-AS1可通过不同的作用方式影响肿瘤的侵袭转移,但其在肝癌中的具体作用和相关作用机制还有待进一步的实验验证.目的探讨lncRNA TPT1-AS1在肝癌中的表达及其对肝癌细胞侵袭迁移能力的影响.方法实时荧光定量PCR检测肝癌组织及肝癌细胞系(Huh7、SMMC-7721、HCCLM3和HepG2)中lncRNA TPT1-AS1的表达.靶向TPT1-AS1的小分子干扰RNA(siRNA targeted for TPT1-AS1,si-TPT1-AS1)转染后,经Transwell实验和划痕实验检测HepG2细胞侵袭及迁移能力的变化;Western blot评估上皮-间充质转分化进程(epithelial-mesenchymal transition,EMT)以及磷酸肌醇3激酶(phosphotylinosital 3 kinase,PI3K)/蛋白激酶B(protein kinase B,PKB/AKT)信号通路的活性.结果肝癌组织及肝癌细胞系(Huh7、SMMC-7721、HCCLM3和HepG2)中均可检测到lncRNA TPT1-AS1的高表达.转染siRNA-TPT1-AS1可抑制肝癌细胞HepG2的侵袭及迁移,同时抑制HepG2细胞的EMT进程.此外,下调lncRNA TPT1-AS1可抑制MMP-9的表达及PI3K/AKT信号通路的活性.结论LncRNA TPT1-AS1在肝癌中高表达.敲减lncRNA TPT1-AS1可抑制肝癌细胞HepG2的侵袭迁移,其作用机制可能与下调PI3K/AKT信号通路的活性以及下游基质金属蛋白酶9(matrix metalloproteinase 9,MMP-9)的表达,进而抑制细胞的EMT进程有关.     

KPNA2基因沉默对人肝癌细胞株SMMC7721和Bel7404增殖和侵袭能力的影响

目的观察核转运蛋白基因α2(Karyopherinα-2,KPNA2)基因沉默对人肝癌细胞株SMMC7721和Bel7404增殖以及侵袭能力的影响。方法将KPNA2 siRNA干扰质粒用LipofectaminTM 2000方法瞬时转染人肝癌细胞株SMMC7721和Bel7404,转染后48 h应用蛋白质印迹法检测转染细胞中KPNA2蛋白表达。采用MTT法检测基因沉默细胞增殖能力,采用Transwell法检测基因沉默细胞侵袭能力。结果 SMMC7721细胞株对照组mRNA为1.02±0.13,高于siRNA转染组的0.37±0.07(t=10.78,P0.01);肝癌Bel7404细胞株对照组mRNA为1.05±0.17,高于siRNA转染组的0.36±0.06(t=9.38,P0.01)。肝癌SMMC7721细胞株对照组蛋白定量值为0.96±0.10,高于转染组的0.42±0.05(t=11.83,P0.01);肝癌Bel7404细胞株对照组蛋白定量值为0.93±0.09,高于转染组的0.48±0.06(t=10.19,P0.01)。SMMC7721和Bel7404细胞株在24、48和72 h时对照组增殖能力高于转染组,且差异有统计学意义(P0.05)。SMMC7721细胞株对照组侵袭能力值为126.20±21.61,高于siRNA转染组的51.13±10.2(t=7.68,P0.01);肝癌Bel7404细胞株对照组侵袭能力值为125.124±8.04,高于siRNA转染组的55.20±18.54(t=8.48,P0.01)。结论KPNA2基因沉默可以调节人肝癌细胞株SMMC7721和Bel7404的增殖能力和侵袭能力。     

特异性下调LKB1的表达对肝癌细胞侵袭迁移能力的影响

目的研究特异性下调LKB1的表达对肝癌细胞系SK-hep-1迁移侵袭能力的影响。方法 Real-time PCR和Western Blot检测人肝癌细胞株和人正常肝细胞HL7702中LKB1表达情况。设计并合成LKB1特异性双链小干扰RNA(LKB1-siRNA),转染到高表达LKB1的人肝癌细胞株SK-hep-1中靶向沉默LKB1基因表达,并设置阴性对照组(NC组)。Real-time PCR和Western Blot检测LKB1基因的mRNA水平与蛋白表达水平的变化。利用CCK-8法检测肝癌细胞增殖能力。通过体外Transwell小室基质侵袭和迁移实验,观察LKB1表达沉默后对人肝癌细胞株SK-hep-1侵袭迁移能力的影响。计量资料两组间比较采用t检验,多组间比较采用单因素方差分析,进一步两两比较采用LSD-t检验。结果与正常人肝细胞HL7702相比,LKB1基因和蛋白在人肝癌细胞SK-hep-1中高表达(P值均0.05)。与NC组相比,siLKB1-1处理组SK-hep-1细胞中的LKB1基因和蛋白表达均明显降低(P值均0.05)。与NC组相比,siLKB1-1转染的SK-hep-1细胞增殖速度明显加快、侵袭和迁移能力明显增强(1.393±0.022 vs 1.128±0.032、147±19 vs 83±21、113±13 vs 75±17;t值分别为15.313、14.879、8.791;P值均0.001)。结论 LKB1有可能参与抑制肝癌增殖、侵袭迁移的过程并影响肝癌的预后。     

尿激酶型纤溶酶原激活剂受体的表达对肝癌细胞株体外侵袭迁移的影响

目的观察尿激酶型纤溶酶原激活剂受体(uPAR)的表达对肝癌细胞体外侵袭迁移能力的影响。方法通过Boyden小室肿瘤细胞体外侵袭实验检测肝癌细胞株Hep-3B及SMMC-7721体外侵袭迁移能力,用流式细胞术检测Hep-3B及SMMC-7721的uPAR,通过流式细胞分选技术从具有较强转移能力的SMMC-7721中分选出uPAR+细胞株和uPAR-细胞株,通过Boyden小室检测uPAR+组和uPAR-组SMMC-7721细胞的体外侵袭迁移能力。结果 SMMC-7721体外侵袭迁移能力明显强于Hep-3B(P<0.01);SMMC-7721中uPAR+细胞株占45.5%,Hep-3B中uPAR+细胞株占0.05%,两者相比,P<0.01;从SMMC-7721中分选出的uPAR+组和uPAR-组细胞纯度分别为90%和97%,uPAR+组细胞的体外侵袭迁移能力较uPAR-组细胞明显增强(P<0.01)。结论 uPAR的表达不但和肝癌细胞的体外侵袭迁移能力密切相关,且可能赋予了肝癌细胞强大的侵袭迁移能力。     

siRNA沉默Cyclin E基因对肝癌HepG2、SMMC-7721和BEL-7402细胞增殖和侵袭能力的影响

目的:观察siRNA沉默Cyclin E基因表达对肝癌HepG2、SMMC-7721和BEL-7402细胞增殖和侵袭能力的影响.方法:构建2个靶向Cyclin E基因siRNA载体,转染人肝癌HepG2、SMMC-7721和BEL-7402细胞.RT-PCR、Western blot检测转染后HepG2、SMMC-7721和BEL-7402细胞Cyclin E基因mRNA和蛋白表达水平.CCK-8试验、软琼脂克隆形成实验检测HepG2、SMMC-7721和BEL-7402细胞增殖、克隆形成能力.流式细胞术、transwell试验分别检测HepG2、SMMC-7721和BEL-7402细胞周期和侵袭能力.结果:构建的2个Cyclin E基因siRNA载体插入序列与所设计序列均一致;转染HepG2、SMMC-7721和BEL-7402细胞后,干扰1组、干扰2组与空白对照组和阴性对照组比较,C y c l i n E m R N A和蛋白表达量均显著降低(P<0.05),细胞生长速度延缓,软琼脂细胞集落形成数、穿透细胞数均显著降低(P<0.05),S和G2/M期细胞比例减少,G0/G1期细胞比例增加.结论:沉默肝癌细胞Cyclin E表达水平,可有效抑制细胞生长、增殖和侵袭能力.     

盐酸青藤碱诱导人肝癌细胞SMMC-7721凋亡及其死亡受体DR4、DR5表达的变化

目的观察人肝癌细胞SMMC-7721凋亡过程中死亡受体DR4、DR5的表达,探讨盐酸青藤碱诱导人肝癌细胞凋亡的作用机制。方法体外培养人肝癌细胞SMMC-7721,经不同浓度盐酸青藤碱作用后,采用MTT法检测细胞增殖情况;Hoechst染色荧光显微镜观察细胞凋亡;用Western blotting方法检测人肝癌细胞DR4、DR5的表达。结果盐酸青藤碱对人肝癌细胞的生长有明显的抑制作用,并呈剂量、时间依赖性,不同浓度组之间差异均有统计学意义(P0.05);Hoechst33258染色可见凋亡细胞皱缩,核碎裂,也可见典型凋亡小体;在蛋白水平,盐酸青藤碱处理后SMMC-7721细胞死亡受体DR4、DR5的表达水平较未处理组显著增加(P0.05)。结论盐酸青藤碱可抑制人肝癌细胞SMMC-7721的细胞增殖,促进其凋亡,此作用可能与细胞内死亡受体DR4和DR5表达上调有关。     

三磷酸腺苷结合盒G2调控肝癌细胞多药耐药的作用

目的探讨三磷酸腺苷结合盒(ABC)G2在肝癌耐药细胞中的表达及其在肝癌细胞耐药中的作用。方法 MTT法检测阿霉素(ADM)作用肝癌SMMC-7721细胞24 h后半数生长抑制浓度(IC50)。利用药物浓度递增细胞培养方法建立肝癌耐药细胞,在SMMC-7721细胞培养液中加入ADM,逐渐提高ADM浓度,浓度从0.001μg/ml提高至0.100μg/ml,使细胞在0.100μg/ml ADM中稳定生长,命名为SMMC-7721/ADM细胞。倒置显微镜下观察SMMC-7721/ADM及其亲代SMMC-7721细胞形态。MTT法检测ADM作用肝癌耐药细胞SMMC-7721/ADM 24 h后的IC50,计算耐药指数。流式细胞术(FCM)检测SMMC-7721/ADM及其亲代SMMC-7721细胞凋亡、周期及细胞中ABCG2蛋白表达水平。结果 ADM对SMMC-7721细胞的IC50=(1.11±0.09)μg/ml。历时3个月时间成功使SMMC-7721/ADM细胞在含0.100μg/ml ADM的细胞培养液中稳定生长,细胞命名为SMMC-7721/ADM。倒置显微镜下观察,SMMC-7721/ADM细胞体积增大,细胞形态变得更不规则。SMMC-7721/ADM与SMMC-7721细胞相比细胞凋亡率无显著差异(P0.05),细胞G0/G1期显著降低(P0.05),细胞S及G2/M期无显著差异(P0.05)。SMMC-7721/ADM与SMMC-7721细胞相比,细胞中ABCG2蛋白表达水平显著增高(P0.05)。结论 ABCG2在肝癌多药耐药细胞中异常增高,高表达的ABCG2参与了肝癌多药耐药的形成。     

酪丝缬肽对人肝癌细胞SMMC-7721血管生成相关基因表达谱的影响

目的:观察小分子三肽化合物酪丝缬hk(tyroscryatide,YSV)对人肝癌细胞系SMMC-7721的抑制作用,并分析YSV对肿瘤细胞血管生成相关基因表达的影响.方法:建立人肝癌细胞SMMC-7721的体外培养体系,采用四甲基偶氮唑蓝(MTT)比色法检测YSV对体外培养的SMMC-7721的增殖抑制作用,应用功能分类基因芯片分析人肝癌细胞SMMC-7721经药物作用后血管生成相关基因表达的差异变化,同时应用RT-PCR方法验证相关基因的表达.结果:YSV能显著抑制人肝癌SMMC-7721的生长,10mg/L YSV作用72h对SMMC-7721的增殖抑制率为42.34%,与对照组比较有统计学意义(P＜0.05).在113个血管生成相关基因中,YSV组相比对照组,基因下调0.667倍以上的有7个.RT-PCR在基因水平上证实YSV能显著抑制血管内皮生长因子(VEGF)和白介素8(IL-8)的表达.结论:YSV在体外能够显著抑制人肝癌细胞SMMC-7721的生长,并能在基因水平上下调肿瘤细胞血管生成相关因子的表达.     

shRNA干扰GRP78基因对肝癌细胞株SMMC-7721增殖和凋亡的影响

目的:研究shRNA干扰GRP78基因对肝癌细胞株SMMC-7721增殖和凋亡的影响。方法:将GRP78特异性shRNA质粒载体Pla-anti-GRP78转染SMMC-7721,采用流式细胞术(FCM)检测转染效率、分析细胞周期分布和凋亡,从蛋白和mRNA水平检测干扰GRP78效果,MTT法检测干扰GRP78对SMMC-7721增殖的影响。结果:Pla-antiGRP78转染SMMC-7721细胞48h后,GRP78表达下降,空白对照组GRP78 mRNA的表达量为1,无关对照组组为0.95,而Pla-anti-GRP78组为0.25(P0.05);转染Pla-anti-GRP78的SMMC-7721细胞G2期阻滞(55.2%,P0.05);空白对照组凋亡率为6.6%,无关对照组为8.1%,而Pla-anti-GRP78组高达58.2%(P0.05)。结论:shRNA干扰GRP78表达抑制SMMC-7721的增殖,并诱导其凋亡。