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1.
目的 建立检测血清抗 H2A 抗体的间接 ELISA 技术,探讨抗 H2A 抗体对类风湿关节炎( RA) 的临床意义。 方法 RT?PCR扩增 H2A 基因,将其克隆到原核表达载体 pET28a,对重组质粒 H2A / pET28a 进行原核表达,经 Western blot 检测后,利 用 H2A 重组蛋白建立检测人血清中抗 H2A 抗体的间接 ELISA 方法。 用建立的间接 ELISA 方法检测 50 例 RA 患者和 50 例健 康人对照组血清抗 H2A 抗体水平。 结果 表达的 H2A 蛋白相对分子量约为 15 000,与预期大小相符,western blot 结果表明组 蛋白 H2A 与抗 H2A 抗体阳性血清具有良好的反应原性。 经方法学评估,建立的 ELISA 法在特异性、可重复性方面均达到检 测要求。 RA 组抗 H2A 抗体水平高于健康人对照组(P<0.01)。 当 cut?off 值设为 0.494 时,RA 患者血清抗 H2A 抗体的阳性率 为 84%(42 / 50),明显高于健康人对照组 20%(10 / 50),差异具有统计学意义(χ2 = 41.026, P<0.01)。 结论 成功建立了检测 血清抗 H2A 抗体的间接 ELISA 技术。 RA 患者血清中抗 H2A 抗体水平明显高于健康人对照组。 抗 H2A 抗体在 RA 患者血清 中出现可能具有重要的致病意义。  相似文献   

2.
目的 通过克隆人聚角微丝蛋白(filaggrin)基因,构建重组表达质粒,获得具活性的纯化重组蛋白,建立人AFA间接ELISA检测法,以评价AFA在RA诊断中的价值.方法 构建重组表达载体,在大肠杆菌Rosetta-gami(DE3)中表达;融合蛋白经Ni-NAT树脂柱进行亲和层析纯化,建立间接ELISA检测AFA方法,并用于检测114例RA患者、56例SLE患者、32例OA患者及40名健康体检者血清中抗人AFA;分析AFA和抗CCP抗体诊断RA的相关性.结果 扩增出321 bp人filagrin基因片段,构建了具有正确序列的质粒载体pET-28a(+)-filaggrin,转化大肠杆菌Rosettagami(DE3)中经诱导产生高水平的表达产物.经SDS-PAGE分析,在相对分子质量为14 000处出现新生蛋白带.用Ni-NAT树脂纯化后得到具有活性的纯化人filaggrin重组蛋白.间接ELISA检测标本血清结果显示,RA组AFA检测吸光度(A)值为0.473±0.248,与SLE组、0A组及健康对照组的A值(分别为0.160±0.088、0.050±O.018、0.121±0.040)两两组间比较,差异具有统计学意义(t值分别为12.004、14.464、18.078,P均<0.01).AFA在RA组、SLE组及OA组阳性率分别为48.2%、5.4%和3.1%.RA组AFA阳性率与SLE组、OA组及健康对照组比较,差异有统计学意义(x~2=67.088,P<0.01).AFA与抗CCP抗体对RA的诊断呈正相关(r=0.42,P<0.05).AFA与抗CCP阳性一致率为70.1%,114例患者中有10例患者抗体CCP阴性,而AFA检测结果为阳性.AFA对RA诊断的敏感度、特异度、阳性预测值和阴性预测值分别为48.2%、96.9%、93.2%和67.9%.结论 用纯化fitaggrin融合蛋白建立的间接ELISA检测抗人AFA的方法,对RA诊断具有较好敏感度和特异度,AFA与抗CCP抗体共同检测可提高检测阳性率.  相似文献   

3.
目的 通过克隆人组氨酰转移核糖核酸合成酶自身抗原Jo-1基因,构建重组表达质粒,获得具有免疫活性的纯化重组蛋白,建立间接ELISA法,并探讨其在检测多发性肌炎/皮肌炎(PM/DM)中的抗Jo-1抗体的价值.方法 构建重组表达载体,在大肠杆菌DH5 α和BL21(DE3)中表达;融合蛋白经Ni-NTA树脂柱进行亲和层析纯化,并通过十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和免疫印迹(WB)进行免疫活性鉴定;应用表达蛋白建立间接ELISA法.同时用该方法检测30名正常献血者,30例SLE,30例类风湿关节炎(RA),10例原发性干燥综合征(SS),75例PM/DM患者血清中抗Jo-1抗体.结果 经重组质粒测序和酶切结果证实,Jo-1目的基因已正确插入原核表达载体中,基因序列正确,符合表达框架;经SDS-PAGE检测显示,表达产物在相对分子质量55 000处有一明显的蛋白表达条带;WB分析表明,重组蛋白具有人Jo-1抗原反应性;间接ELISA法检测标本血清结果显示,PM/DM组中抗Jo-1抗体的阳性率为28%,非PM/DM组(疾病对照组及正常对照组)均为阴性,其差异均有统计学意义(x2=31.84,均P<0.01).结论 成功克隆了人组氨酰转移核糖核酸合成酶自身抗原Jo-1基因,其可在大肠杆菌中表达,且重组自身抗原具有较好的抗原性和特异性.应用纯化融合蛋白建立的间接ELISA法检测PM/DM抗Jo-1抗体具有较好的特异性.  相似文献   

4.
目的 探讨酶联免疫吸附法(ELISA)检测抗异质性胞核核糖核蛋白A2(hnRNPA2)/类风湿关节炎(RA)33抗体在不同风湿性疾病患者中的阳性率及对RA早期诊断的意义。方法 以纯化的重组蛋白hnRNPA2为抗原,用ELISA检测RA179例、系统性红斑狼疮(SLE)14l例、其他弥漫性结缔组织病(CTD)97例、血清阴性脊柱关节病(SPA)30例、骨关节炎(0A)10例、关节痛/关节炎59例、正常对照40名,比较抗hnRNPA2/RA33抗体在各组人群中的阳性率,并评价其与RA患者临床和实验室检查指标间的关系及早期诊断的价值。结果 抗hnRNPA2/RA33抗体在RA患者中的敏感性为36.9%、特异性为87.1%,在SLE、其他CTD、SPA和OA患者中阳性率分别为19.2%、7.2%、6.8%和0。抗hnRNPA2/RA33抗体在早期RA患者中的阳性率为43.3%。结论 以纯化的重组蛋白hnRNPA2为抗原的ELISA是检测抗hnRNPA2/RA33抗体,早期诊断RA的可靠方法。  相似文献   

5.
目的建立与α-烯醇化酶(ENOI)相关的抗内皮细胞抗体(AECA)的酶联免疫吸附试验(ELISA),并探讨ENOI-AECA与自身免疫性疾病的关系。方法人工合成获得人ENOI基因编码序列并克隆该片段构建pUC57-ENOI重组质粒,再将重组质粒亚克隆入原核表达载体pET28(a),回收酶切产物并经T4DNA连接酶连接,获得的重组表达质粒pET28(a)-ENOI,在大肠埃希菌BL21(DE3)中诱导表达蛋白,Ni NTA亲和层析纯化重组ENOI蛋白。以纯化的重组蛋白为包被抗原,并对ELISA反应条件进行优化,初步建立检测ENOI-AECAELISA并作分析性能评价。用建立的方法分别检测健康人及系统性红斑狼疮(SLE)、类风湿性关节炎(RA)患者血清中的ENOI-AECA。结果获得了相对分子质量为47 000的高纯度人ENOI重组蛋白。ELISA抗原最佳包被浓度为5μg/mL,血清最佳稀释倍数为1∶50。以免疫印迹法为参照,所建方法的敏感性和特异性分别为76.0%和90.2%。SLE和RA患者血清中ENOI-AECA的阳性率分别为23.1%和57.1%;RA组ENOI-AECA阳性率与健康对照组比较,差异有统计学意义(P=0.000)。结论以人ENOI重组蛋白为抗原建立的检测ENOI-AECA的ELISA有较高的敏感性和特异性,可用于ENOI-AECA的检测。ENOI-AECA阳性提示患者可能患有自身免疫性血管炎。  相似文献   

6.
血清抗Ⅱ型胶原蛋白抗体检测法的建立与应用   总被引:2,自引:0,他引:2  
目的 建立血清抗Ⅱ型胶原蛋白抗体的ELISA法,探讨其在类风湿关节炎(RA)患者中的应用价值.方法 以自提可溶性鸡Ⅱ型胶原蛋白(soluble chicken collagen type Ⅱ,SCC Ⅱ)作为包被抗原,优化实验条件,建立抗Ⅱ型胶原蛋白抗体间接ELISA法.对124例RA病人和54例健康人血清抗II型胶原蛋白抗体进行检测.结果 血清抗Ⅱ型胶原蛋白抗体的检测条件为:SCCⅡ包被浓度为20 μg/ml;以含10%羊血清的缓冲液进行封闭、稀释血清和酶标抗体;采用双波长(450nm/630 nm)进行测定.RA患者和健康人血清抗Ⅱ型胶原蛋白抗体阳性率分别为19.35%(24/124)和1.85%(1/54),两组有明显的统计学差异(P<0.01).结论 以SCCⅡ为包被抗原检测抗Ⅱ型胶原蛋白抗体可作为判断RA患者病情的一个辅助诊断指标.  相似文献   

7.
目的探讨血清中抗β2糖蛋白1(抗β2GP1)抗体在狼疮性肾炎(LN)和类风湿性关节炎(RA)患者中的临床应用价值。方法用酶联免疫吸附试验(ELISA)定量检测45例LN患者和45例RA患者血清中抗β2GP1抗体及抗心磷脂(CL)抗体水平。结果抗β2GP1抗体在LN中的阳性率为42.2%,显著高于在RA中的阳性率(6.7%),但在LN和RA中抗β2GP1抗体和抗CL抗体的表达均没有相关性;抗β2GP1抗体与LN病情活动性无相关。结论血清抗β2GP1抗体在LN和RA患者中均有表达,但与LN的相关性更强,联合检测抗β2GP1抗体和抗CL抗体能显著提高抗磷脂抗体在LN和RA中的阳性率,并提高抗CL抗体检测的准确性。  相似文献   

8.
郭丽茹  李晓燕  孔梅  刘英华  邹明  苏旭 《疾病监测》2015,30(11):964-968
目的 构建人偏肺病毒融合蛋白亚单位F1、F2原核表达系统,初步获得抗F1、F2重组蛋白的多克隆抗体,为相关疫苗的研究奠定基础。 方法 聚合酶链反应(PCR)法扩增F1、F2基因片段,经T-A克隆确保其准确性,双酶切后插入原核表达载体pET32a(+)中,转化大肠埃希菌BL21(DE3),按优化后条件大量诱导表达,纯化后经Western Blot检测特异性。取纯化蛋白免疫BALB/c小鼠制备多克隆抗体,ELISA法检测效价,间接免疫荧光法(IFA)检测多克隆抗体是否能与人偏肺病毒发生特异性反应。 结果 F1、F2基因均正确插入pET32a(+)中,并具有正确的读码框架。0.5 mmol/L IPTG 37 ℃诱导培养5 h可获得大量带His标签的重组蛋白,纯化后浓度分别达到200 g/ml和300 g/ml。Western Blot结果显示,重组蛋白可被抗His标签抗体特异识别;免疫小鼠获得多克隆抗体效价分别为抗pET32a-F1最高1 : 640,抗pET32a-F2最高1 : 40 960。IFA显示抗pET32a-F1、抗pET32a-F2多克隆抗体均可与人偏肺病毒作用产生特异性荧光。 结论 成功构建了F1、F2的原核表达质粒, 并在大肠埃希菌中获得高效表达,该蛋白具有良好的抗原性;免疫小鼠获得特异性多克隆抗体,有利于人偏肺病毒的深入研究。  相似文献   

9.
目的 获得重组HBx蛋白,检测乙型肝炎患者血清抗-HBx抗体并探讨其临床意义。方法 利用分子克隆技术克隆HBVX基因构建PET32a-HBX原核表达载体,表达和纯化HBx蛋白,用该重组蛋白建立检测抗-HBx抗体的间接ELISA方法;采用该ELISA分别检测正常人组、急性肝炎组、慢性肝炎组、肝硬化组和肝细胞癌组患者血清中的抗-HBx抗体。结果 获得具有免疫原性的HBx融合蛋白;ELISA检测表明,慢性肝炎组、肝硬化组和肝细胞癌组的抗-HBx抗体的水平均高于急性肝炎组,差异具有显著性;在这三组之间,慢性肝炎组高于肝硬化组和肝细胞癌组,差异具有显著性,肝硬化组和肝细胞癌组的抗-HBx抗体水平无显著性差异。结论 HBV患者血清中抗-HBX抗体是乙型肝炎病毒感染的一种特异性抗体,是HBV感染的血清学指标之一,可以反映乙型肝炎肝炎患者病情的变化。  相似文献   

10.
目的 构建人羧基肽酶H不同区段抗原的原核表达载体,诱导表达获得重组蛋白,初步验证人羧基肽酶H不同抗原区段在羧基肽酶H自身抗体检测中的应用价值。方法 应用RT-PCR方法调取目的基因,构建相应的原核表达质粒,转化大肠埃希氏菌诱导表达重组蛋白,用重组蛋白作为包被抗原建立人羧基肽酶H自身抗体的间接ELISA方法,评价羧基肽酶H抗原在检测新诊断2型糖尿病患者抗羧基肽酶H自身抗体中的应用价值。结果 获得了羧基肽酶H三种不同区段抗原,其中42~476氨基酸区段为较理想的抗原。以该全长抗原作为包被抗原检测95例新诊断2型糖尿病患者,羧基肽酶H自身抗体阳性率为8.42%。结论 原核克隆表达的人羧基肽酶H 42~476氨基酸区段抗原具有良好的抗原性,可作为成人隐匿性自身免疫性糖尿病鉴别诊断的候选抗原。  相似文献   

11.
目的克隆、表达及纯化梅毒螺旋体(Tp)外膜蛋白Tp 0319,并建立间接ELISA方法,探讨其在梅毒血清学诊断中的价值。方法构建重组质粒PQE32/Tp 0319,IPTG诱导表达,SDS-PAGE和western blot鉴定表达结果;Ni-NTA亲和层析法纯化重组蛋白,间接ELISA检测梅毒患者血清中特异性IgG抗体。结果成功构建了PQE32/Tp 0319重组质粒;经SDS-PAGE检测,诱导产物显示有一条相对分子质量约为30 000的特异蛋白质条带,western blot分析证明其只与人抗Tp IgG发生特异性反应;将Tp 0139用于间接ELISA检测抗Tp抗体阴、阳性参比血清,特异性和敏感性均为100%;检测梅毒患者和健康献血者血清各150份,结果与TPPA法符合率为95.3%。结论制备的Tp 0319重组蛋白有较好的免疫反应性,可望用于临床梅毒血清学诊断。  相似文献   

12.
目的扩增人血管内皮细胞生长因子受体-2/激酶插入受体(VEGFR-2/KDR)三区基因,构建表达载体,在大肠埃希菌中表达,获得纯化蛋白。检测胃癌术前患者外周血中抗-KDR抗体水平,为进一步研究KDR与抗-KDR抗体在胃癌中的作用奠定基础。方法从人血管内皮细胞株ECV304提取总RNA,逆转录后,聚合酶链反应(PCR)扩增KDR胞外段三区基因,连接到pMD18-T载体测序;酶切后将目的基因插入原核表达载体pET28a( )构建重组质粒,将重组质粒转化到大肠埃希菌DH5α内并提取质粒,经双酶切鉴定后,再转化入表达菌株BL21(DE3),异丙基-β-D硫化半乳糖苷(IPTG)诱导表达,用Ni2 -NTA树脂纯化、复性;用获得的蛋白包被酶联免疫吸附试验(ELISA)板,用ELISA检测32例胃癌患者和35名健康对照者外周血抗-KDR抗体水平。结果构建了表达载体pET28a( )-KDR3,并获得高效表达,表达的蛋白质相对分子质量为16 000,重组蛋白以包涵体形式存在。胃癌患者外周血中抗-KDR抗体水平显著高于健康对照组(P<0.01)。结论VEGFR-2/KDR三区基因成功克隆到表达质粒内并表达。为进一步研究KDR与抗-KDR抗体在胃癌中的作用奠定了基础,及可能为胃癌的血清学诊断提供新的方法。  相似文献   

13.
目的 制备兔抗人KiSS-1多克隆抗体.方法 聚合酶链反应(PCR)法扩增出KiSS-1基因,将其克隆入原核表达载体pET28中,转化大肠埃希菌BL21(DE3).采用异丙基-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导重组蛋白的表达,采用镍离子螯合琼脂糖凝胶(Ni^2+-NTA)亲和层析法纯化重组蛋白,以之为免疫原免疫家兔,制备多克隆抗体,并用酶联免疫吸附测定(ELISA)、Western blot及免疫组织化学法检测抗体.结果 成功构建了KiSS-1原核表达载体pET28/ KiSS-1,高效表达并纯化KiSS-1蛋白,间接ELISA检测所制备抗体的效价为1:6 400.Western blot鉴定制备的抗体与KiSS-1蛋白能特异性结合,免疫组织化学法检测结果表明该抗体识别人卵巢癌组织中的天然KiSS-1.结论 成功制备了效价高、特异性较强的兔抗人KiSS-1抗体,为进一步探讨KiSS-1在卵巢癌的发生、发展过程中的作用奠定了基础.  相似文献   

14.
梁建群  罗燕飞 《实用医学杂志》2006,22(15):1820-1821
目的:了解类风湿关节炎(RA)患者血清中抗环瓜氨酸肽抗体(抗ccp)、抗角蛋白抗体(抗AKA)、抗RA33抗体对RA诊断的灵敏度、特异性及其在风湿性疾病中的临床价值并进行评价.方法:采用ELISA法检测抗ccp、抗RA33抗体,间接免疫荧光法检测抗AKA抗体,共检测RA 63例,非RA风湿病104例和50例正常健康人.结果:63例RA患者中抗cc、抗AKA、抗RA33抗体的灵敏度分别为59.2%、28.0%、38.0%;特异性分别为95.0%、94.4%、96.0%;三者灵敏度差异有显著性,特异性无差异显著性.结论:抗ccp、抗AKA、抗RA33抗体对RA早期诊断有良好的灵敏度和特异性,联合检测特异性显著提高.  相似文献   

15.
目的 探讨血清中抗β2糖蛋白1(抗β2GP1)抗体在狼疮性肾炎(LN)和类风湿性关节炎(RA)患者中的临床应用价值。方法 用酶联免疫吸附试验(ELISA)定量检测45例LN患者和45例RA患者血清中抗β2GP1抗体及抗心磷脂(CL)抗体水平。结果 抗β2GPl抗体在LN中的阳性率为42.2%,显著高于在RA中的阳性率(6.7%),但在LN和RA中抗β2GP1抗体和抗CL抗体的表达均没有相关性;抗β2GP1抗体与LN病情活动性无相关。结论 血清抗β2GP1抗体在LN和RA患者中均有表达,但与LN的相关性更强,联合检测抗β2GP1抗体和抗CL抗体能显著提高抗磷脂抗体在LN和RA中的阳性率,并提高抗CL抗体检测的准确性。  相似文献   

16.
目的将前期制备的亮氨酸拉链EF-hand结构域跨膜蛋白1抗体(抗-LETMD1)应用于肝细胞癌的临床诊断研究,为建立特异、灵敏的肝细胞癌早期诊断方法提供实验基础。方法以制备并鉴定的抗体为工具,运用Western blot及免疫组织化学方法检测肝癌组织中LETMD1编码产物表达情况,建立双夹心酶联免疫吸附试验(ELISA)法检测肝细胞癌患者及健康人血清中LETMD1编码产物表达情况。结果 LETMD1编码产物在正常组织中不表达,在肝癌组织中的表达明显高于癌旁组织;双夹心ELISA法检测血清中LETMD1编码产物表达结果显示,肝癌患者血清中LETMD1编码产物表达明显高于健康对照。结论使用制备的抗-LETMD1,建立了肝细胞癌临床组织标本LETMD1的检测方法 ;初步建立了检测血清中LETMD1的双夹心ELISA方法 。  相似文献   

17.
目的 制备兔抗人S100A7(hS100A7)多克隆抗体。方法制备原核表达重组人S100A7,用纯化的hs100A7为免疫原免疫新西兰大白兔,制备兔抗人S100A7抗体,并以问接ELISA测定抗体效价,以Westernblot和免疫组织化学法鉴定抗体的特异性。结果成功制备了重组人S100A7及其抗体,ELISA结果显示抗体效价达1:16000,Western blot和组织化学法分析表明该抗体能特异结合hS100A7。结论以纯化的重组人S100A7为免疫原,成功地制备了效价高、特异性强的兔抗人S100A7抗体。  相似文献   

18.
目的用重组表达的丙酮酸脱氢酶复合物E2亚单位(PDC-E2)检测M2抗体,以利于原发性胆汁性肝硬化(PBC)的早期诊断。方法采用重组表达的PDC-E2建立了免疫印迹法(IBT)和酶联免疫吸附试验(ELISA)。检测40例PBC患者血清的M2抗体,以其他肝病患者、自身免疫病患者、健康体检者作对照。结果40例PBC患者血清中检测出抗PDC-E2抗体阳性37例,阴性3例,阳性率为92.5%,而疾病对照组和健康体检者血清中该抗体检测均为阴性。结论用重组表达的人PDC-E2检测抗体有较好的敏感性和特异性,有助于PBC的临床诊断。  相似文献   

19.
目的利用基因工程表达的组氨酰转移核糖核酸合成酶自身抗原Jo-1蛋白,建立ELISA法,初步用于检测多发性肌炎/皮肌炎(PM/DM)中的抗Jo-1抗体。方法用表达蛋白建立间接ELISA,摸索反应时间、抗原包被浓度、样本稀释浓度及抗抗体工作浓度等工作条件,进一步检测方法的重复性及稳定性。用建立的方法,检测40例健康体检者、30例系统性红斑狼疮(SLE)、30例类风湿关节炎(RA)、20例干燥综合征(SS)、90例多发性肌炎/皮肌炎(PM/DM)患者血清中抗Jo-1抗体。结果成功建立间接ELISA法,并确立了一系列反应条件。临床检测结果显示,PM/DM患者抗Jo-1抗体的阳性率为25.6%,而非PM/DM患者均为阴性。PM/DM组Jo-1抗体阳性率与疾病对照组及健康对照组比较,差异均有统计学意义(均P<0.01)。结论本研究成功应用基因工程表达的Jo-1蛋白建立了间接ELISA法,检测抗Jo-1抗体,与国外报道的结果基本相当,与常用免疫印迹法对比检测的结果一致。  相似文献   

20.
类风湿关节炎患者抗-CCP抗体检测的临床意义   总被引:1,自引:0,他引:1  
目的检测类风湿关节炎(RA)血清中的抗环瓜氨酸肽(抗-CCP)抗体对类风湿关节炎诊断的临床意义及结合类风湿因子测定的互补作用。方法用酶联免疫吸附实验(ELISA检测)探讨其对RA患者、SLE患者、其他风湿性疾病患者和健康人进行抗-CCP抗体检测并比较分析。结果RA患者血清中,抗-CCP抗体阳性率为94.5%,其他风湿性疾病阳性率为48.1%。结论抗-CCP抗体对RA诊断具有良好的诊断价值。  相似文献   

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