RNA干扰沉默HIF-1α基因对舌癌Tca8113细胞侵袭和迁移的影响

目的 观察RNA干扰沉默缺氧诱导因子-1α （HIF-1α）基因对人舌癌细胞Tca8113侵袭和迁移的影响.方法 将3个shRNA序列质粒导入pGCsi-H1/Hygro/GFPshRNA质粒表达载体,并将重组质粒经脂质体介导转染人舌癌细胞Tca8113（siHIF-1α组）,转染阴性对照质粒的细胞作为空载组.半定量RT-PCR及Western blot法检测HIF-1α的mRNA及蛋白,细胞侵袭实验和划痕实验检测Tca8113的侵袭和迁移能力,同时采用Western blot法检测其上皮-间质转化（EMT）相关标志蛋白和黏着斑激酶（FAK）、磷酸化FAK（P-FAK）.结果 测序证实成功构建了HIF-1α shRNA重组质粒（分别为sh1、sh2、sh3）,将sh3,转染Tca8113后进行低氧培养,HIF-1α基因表达显著被抑制.与空载组相比,转染sh3的siHIF-1α组穿透Matrigel胶的细胞数明显减少,且迁移能力也显著下降,两组相比,P均＜0.05.与对照组（未转染质粒的Tca8113）相比,siHIF-1α组EMT相关标志蛋白和p-FAK蛋白表达下降,两组相比,P均＜0.05.结论 RNA干扰沉默HIF-1α基因能有效抑制舌癌细胞的侵袭和迁移,在一定程度上可以逆转舌癌细胞的恶性表型.     

小干扰RNA抑制MDM2对HepG2细胞的影响及机制

目的探讨小干扰RNA对HepG2细胞泛素蛋白链接酶(MDM2)基因表达的干扰效应和增殖影响的分子机制。方法建立装载靶向MDM2基因小干扰RNA(siRNA)的表达载体;用脂质体法将此表达载体转染HepG2细胞株,以转染阴性对照质粒组作对照;采用RT-PCR检测MDM2,p53,Bcl2和p21基因的表达;MTT法检测细胞增殖抑制情况,流式细胞仪检测细胞凋亡情况,划痕实验检测细胞迁移能力的改变。结果转染siRNA MDM2后的HepG2细胞MDM2和Bcl2基因表达明显减低,而p53和p21基因表达被明显增强,与空白组比差异具有显著性。siRNA MDM2明显抑制了HepG2的增殖并诱导其凋亡,同时使细胞迁移能力明显下降。但转染阴性对照质粒组未出现基因的表达变化和增殖抑制及凋亡。结论 siRNA MDM2可明显抑制HepG2增殖诱导其凋亡,并减弱肿瘤细胞迁移力。可能与抑制MDM2,增强p53表达,从而影响细胞周期和凋亡相关的基因表达变化有关。     

RNA干扰沉默STAT3基因对肝癌细胞株HepG2和SMMC-7721的影响

肝细胞癌是常见的危害人类健康的恶性肿瘤之一,其发生、发展过程受诸多因素的影响.近年研究发现,信号转导和转录激活因子(STAT)具有强烈的抑制细胞凋亡,促进细胞增殖的作用,参与了人类恶性肿瘤的发生、发展和演变,其中以STAT3尤为活跃.本研究利用RNA干扰(RNAi)技术,用短发夹样RNA(shRNA)设计并构建RNAi-DNA质粒,筛选稳定表达小干扰RNA(siRNA)的肝癌HepG2及SMMC-7721细胞株,体外研究siRNA稳定和特异性诱导肝癌STAT3基因转录后沉默并逆转其恶性表型的能力,从而探索肝癌治疗的新方法.     

沉默miR-107对乳腺癌细胞侵袭及上皮-间质转化的影响

目的 探究miR-107对乳腺癌细胞侵袭及上皮-间质转化(EMT)的影响和机制。方法 利用荧光定量PCR方法分析miR-107在正常乳腺细胞及乳腺癌细胞系中的表达差异;HS578T细胞分别转染对照miRNA和miR-107抑制剂,利用划痕实验分析细胞迁移能力,用Transwell实验分析细胞侵袭能力,用实时荧光定量PCR方法检测细胞EMT标志物的表达水平,用蛋白质免疫印迹实验检测细胞PTEN/AKT信号通路。结果 与正常乳腺细胞相比,miR-107在乳腺癌细胞株中高表达;沉默miR-107的表达抑制HS578T细胞的迁移、侵袭及EMT,促进PTEN/AKT信号通路。结论 miR-107在乳腺癌细胞中高表达,沉默miR-107表达通过PTEN/AKT信号通路抑制乳腺癌细胞迁移、侵袭和EMT。     

miR-138在肝细胞癌中的表达及其对MHCC97H细胞侵袭、迁移能力的影响

目的 观察miR-138在肝细胞癌(HCC)组织、细胞中的表达变化,并探讨miR-138对MHCC97H细胞侵袭、迁移能力及上皮间质转化(EMT)的影响.方法 采用qRT-PCR检测HCC组织及癌旁组织、MHCC97H、MHCC97L、HepG2及正常肝细胞系L02细胞中的miR-138.转染miR-138 mimic...     

小干扰RNA沉默垂体瘤转化基因1对肝癌细胞增殖和凋亡水平的影响

肝癌是全世界范围的高发恶性肿瘤,在亚洲的发病率、病死率都很高。肝癌的分子学发病机制尚不完全清楚,包括基因结构和功能的缺陷、癌基因的激活、抑癌基因的失活、细胞周期紊乱、染色体的非整倍体出现以及细胞凋亡途径受阻等。垂体瘤转化基因(PTTG)1是细胞周期调节蛋白,能抑制姐妹染色单体分离,导致染色体不稳定,形成非整倍体。在成人大多数正常组织中PTTG1表达较弱,甚至检测不到,而在垂体肿瘤等多种肿瘤细胞中表达明显升高,PTTG1基因可能是一种潜在的抗癌基因治疗靶点[1]。本研究用小干扰RNA (siRNA)降低肝癌细胞株HepG2、SMMC-7721细胞中PTTG1的表达,检测PTTG1表达下调对肝癌细胞增殖及凋亡的影响,探讨PTTG1对肝癌细胞生物学行为的影响以及作为肝癌治疗靶基因的可能性。     

葛根素对人肝癌细胞HepG2侵袭与迁移能力的影响

目的探索葛根素对人肝癌细胞HepG2侵袭与迁移能力的影响及其相关分子机制。方法将人肝癌细胞HepG2分为两组,实验组用60μg/ml、30μg/ml的葛根素进行培养,对照组用加入等体积的葛根素溶解剂二甲基亚砜(DMSO)的培养基培养;利用细胞划痕实验检测两组细胞的迁移能力;利用Transwell小室检测两组细胞的侵袭能力;通过蛋白免疫印迹检测波形蛋白(vimentin)、E-钙黏蛋白(E-cadherin)、基质金属蛋白酶2/9(matrix metalloproteinase2/9,MMP2/9)。结果人肝癌细胞HepG2在经过葛根素培养后,细胞划痕的愈合能力下降,Transwell小室细胞的侵袭能力下降;E-cadherin表达上升(P<0.05),vimentin、MMP2和MMP9的表达下调(P<0.05)。结论葛根素通过上皮细胞间质转化(EMT)途径导致人肝癌细胞HepG2侵袭转移能力下降。     

人宫颈癌基因小干扰RNA抑制HepG2细胞生长的作用及其机制

目的 利用RNA干扰技术探讨人宫颈癌基因(HCCR)对肝癌细胞增殖、凋亡的影响及其可能的分子机制. 方法 构建表达HCCR小干扰RNA的真核表达质粒pRIV2-siHCCR,将其转染肝癌细胞株HepG2细胞,定量PCR、Westem blot检测HCCR及其相关基因的表达,四甲基偶氮唑盐法检测细胞增殖状态,流式细胞术观察细胞凋亡与细胞周期变化. 结果 成功构建真核表达质粒pRIV2-siHCCR,其表达的HCCR siRNA可有效抑制HepG2细胞内HCCR的表达,细胞增殖受到抑制,细胞凋亡增加.Western blot结果显示HCCR小干扰RNA作用HepG2细胞后,细胞内P53蛋白的表达降低,P15蛋白的表达明显升高,而PTEN、P16、P27蛋白水平没有明显改变. 结论 HepG2细胞中HCCR蛋白下调后,细胞增殖受到抑制,凋亡细胞增多,其作用机制可能与蛋白质P53、P15有关.     

小干扰RNA沉默脂肪酸合酶基因对人肝细胞株HepG2脂代谢的影响

目的:研究基因干扰技术沉默脂肪酸合酶(FAS)基因后对人肝细胞株HepG2细胞内外脂质含量及脂代谢相关基因表达的影响。方法:合成3对针对FAS mRNA不同位点序列的小干扰RNA(siRNA),分别转染至人肝细胞株HepG 2,实时荧光定量聚合酶链反应(PCR)检测空白对照组(HepG2细胞不经过任何处理)、阴性对照组(转染没有任何基因干扰作用的阴性siRNA)、FAS-siR NA-1转染组、FAS-siRNA-2转染组和FAS-siRNA-3转染组的FAS mRNA的表达。蛋白免疫印迹(Western blot)法检测蛋白质的表达水平,筛选出沉默效果最佳的一对siR NA。将最有效siRNA转染至HepG2细胞,48 h后测定细胞内外甘油三酯及总胆固醇含量以及脂代谢相关基因的mRNA表达水平。结果:25 nmol/L si RNA和3μl/孔(24孔板)转染试剂的转染效率最高。FAS-siRNA-3对HepG2的FAS基因的沉默效果最好,FAS-si RNA-3转染组的FAS在mRNA水平和蛋白水平分别降低为空白对照组的(52.33±3.07)%和(51.57±3.14)%。FAS-siRNA-3沉默FAS基因后HepG2的细胞内和细胞外培养液中甘油三酯含量显著低于空白对照组,细胞外总胆固醇含量显著低于空白对照组。与空白对照组比较,FAS-siRNA-3转染组HepG2的肝脂酶基因mRNA表达水平显著升高(P0.0001),微粒体甘油三酯转运蛋白基因mRNA表达水平显著降低(P0.05),差异均有统计学意义。结论:FAS基因沉默可显著降低HepG2细胞内甘油三酯、细胞外培养液甘油三酯和总胆固醇的含量,需进一步的体内外实验加以验证。     

VEGF基因沉默对肝癌HepG2细胞侵袭和迁移的影响

目的观察VEGF基因沉默对人肝癌细胞株HepG2迁移和侵袭的影响。方法采用siRNA技术沉默HepG2细胞内血管内皮细胞生长因子(VEGF)基因。体外成功构建针对VEGF的3种siRNA表达载体和1个阴性对照,分别命名为pGenesil-1-VEGF-shRNA-1、2、3和pGenesil-1-VEGF-shRNA-scramble。Lipofectamine 2000介导转染HepG2,用RT-PCR筛选出沉默效果最好的siRNA片断(pGenesil-1-VEGF-shRNA-2),将其重组质粒转染HepG2(观察组),以空质粒细胞(空载组)和空白细胞(空白组)作为对照。采用细胞创伤愈合试验、Transwell小室体外侵袭试验分别检测三组细胞迁移、侵袭能力。结果细胞创伤愈合试验显示,观察组细胞迁移速度为(3.02±0.03)μm/h,显著慢于空载组的(8.67±0.02)μm/h和空白组的(8.78±0.03)μm/h,P均<0.05;细胞侵袭试验显示,观察组穿膜细胞数为(14.0±1.3)个,显著低于空载组的(35.0±2.3)个和空白组的(36.0±2.5)个,P均<0.05。结论 VEGF基因沉默可抑制肝癌细胞株HepG2的迁移和侵袭能力。     

靶向MTDH的小干扰RNA对人原发性肝癌细胞HepG2骨架重排的影响

目的构建人MTDH基因的shRNA干扰载体,并观察其对原发性肝癌细胞HepG2骨架重排的影响。方法针对MTDH基因的不同部位设计3对shRNA的寡核苷酸片段,克隆到载体pGCsilencerTM H1/Neo中,RT-PCR、Western blotting及免疫荧光检测转染后MTDH mRNA和蛋白表达变化情况,并筛选最佳抑制效率的shRNA干扰载体,并将其转染人原发性肝癌细胞HepG2,用罗丹明标记的鬼笔环肽显示沉默MTDH基因后对人原发性肝癌细胞HepG2骨架蛋白F_actin的改变。结果靶向MTDH干扰质粒构建成功。与转空载体的阴性对照组及未转染组比较,转染pGCsilencerTM H1/Neo-MTDH-shRNA后,HepG2中MTDH mRNA和蛋白表达明显降低,其中以pGCsilencerTM H1/Neo-MTDH-S1最为明显,达到90%以上;细胞形态及细胞骨架显示转染pGCsilencerTMH1/Neo-MTDH-S1的细胞骨架蛋白F_actin发生重排。结论成功构建并筛选最佳抑制效率的靶向MTDH干扰pGCsilencerTM H1/Neo-MTDH-S1,该载体能有效重排肝癌细胞骨架。     

小干扰RNA抑制核因子-κB活化对HepG2细胞凋亡的影响

目的 探讨小干扰RNA(SiRNA)抑制核转录因子(NF)-κB活化对肝癌细胞凋亡的影响.方法 化学合成NF-κB siRNA和阴性对照siRNA,脂质体法转染HepG2细胞,用巢式RT-PCR和荧光定量PCR检测NF-κB mRNA表达情况;免疫组织化学法、酶联免疫吸附法、Western b10t检测NF-κB蛋白表达情况;用磷脂结合蛋白V-异硫氰酸荧光素法检测细胞凋亡,分析NF-κB表达抑制和细胞凋亡间关系.多个样本均数间的比较先行方差齐性检验,方差齐时行单因素方差分析;计数资料比较采用确切概率法分析.结果 NF-κBp65 mRNA在HepG2细胞相对表达量为1.13±0.03,在正常肝细胞L02为0.29±0.07,两者比较,t=27.02,P<0.05,差异有统计学意义.利用NF-κB siRNA干扰可下调NF-κB表达,且呈剂量、时间依赖;NF-κB siRNA转染HepG2细胞72h后,NF-κBmRNA和蛋白表达分别下降了93%和62%,抑制NF-κB表达使HepG2细胞凋亡增加85%. 结论 NF-κB在肝癌细胞中高表达,NF-κB SiRNA能特异性抑制其在肝癌细胞中活化并促进癌细胞凋亡发生.     

TROP-2基因小干扰RNA转染对前列腺癌细胞黏附、迁移和侵袭的影响

目的观察肿瘤相关钙信号转导蛋白-2(TROP-2)基因小干扰RNA(siRNA)转染对前列腺癌细胞黏附、迁移和侵袭的影响。方法以TROP-2基因siRNA转染人前列腺癌PC-3细胞后,分别用实时荧光定量PCR和Western blot法检测细胞TROP-2 mRNA和蛋白,用MTT法检测PC-3细胞吸光度值(以此判断细胞黏附力),以Tr-answell小室实验观察细胞的迁移、侵袭情况。结果与空载对照组相比,TROP-2 siRNA组TROP-2 mRNA的表达明显下降(P均<0.01)并呈浓度和时间依赖性(P均<0.01);与空白对照组及空载对照组相比,TROP-2 siRNA组TROP-2蛋白的表达明显下降(P均<0.01)并呈浓度和时间依赖性(P均<0.01);与空白对照组相比,TROP-2 siR-NA组细胞黏附力下降(P<0.01)并呈浓度、时间依赖性(P均<0.05);与空白对照组及空载对照组相比,TROP-2siRNA组细胞迁移、侵袭数明显减少(P均<0.01)并呈浓度依赖性(P均<0.01)。结论 TROP-2基因siRNA转染可抑制前列腺癌PC-3细胞黏附、迁移和侵袭。     

小干扰RNA干扰高迁移率族蛋白1对HepG2细胞增殖和凋亡的影响

目的 探讨小干扰RNA(siRNA)抑制高迁移率族蛋白1(HMGB1)基因对人肝癌细胞株HepG2细胞增殖和凋亡的影响. 方法设计并化学合成针对HMGB1的3对siRNA分子序列(siRNAH1、siRNH2、siRNAH3),同时设未转染对照组(Lipo组)及转染阴性siRNA组(阴性siRNA对照组).脂质体法瞬时转染HepG2细胞,通过PCR法和Western blot检测细胞中HMGB1基因在mRNA水平和蛋白质水平的变化,利用四甲基偶氮唑盐法检测转染HMGB1-siRNA的HepG2细胞增殖情况,TdT酶介导的缺口末端标记法检测细胞凋亡情况.两组数据间比较用t检验,组内数据比较用方差分析,细胞增殖数据采用可重复双因素方差分析.结果 3对特异性HMGB1-siRNA转染后,HMGB1 mRNA相对表达量分别为1.147±0.024、1.014±0.042和0.435±0.055,较Lipo组的1.411±0.065明显减少(t值分别为7.187、9.018和20.689,P值均＜0.01);HMGB1蛋白相对表达量分别为0.369±0.035、0.340±0.028和0.097±0.020,较Lipo组的0.553±0.051明显减少(t值分别为6.678、7.919和17.287,P值均＜0.01),其中以siRNAH3抑制效果最好,抑制率可达到80%.转染siRNAH3后HepG2细胞的增殖能力受到明显抑制,与Lipo组相比,72、96、120h时F值分别为34.651、540.550、3778.197,P值均＜0.01,HepG2细胞凋亡指数明显增高(F=130.696,P＜0.01).结论 靶向HMGB1基因的siRNA分子片段可以有效地抑制HepG2细胞生长,促进HepG2细胞凋亡,其作用与下调HMGB1的表达有关,HMGB1可能是肝癌治疗的一个潜在靶点.     

HVEM基因干扰后非小细胞肺癌细胞的迁移、侵袭能力变化及其机制

目的 观察疱疹病毒侵入介体(HVEM)基因干扰对非小细胞肺癌(NSCLC)细胞迁移、侵袭能力的影响,并探讨其可能的作用机制。方法 通过Western blotting法检测正常肺上皮细胞BEAS-2B和NSCLC`细胞系SKMES-1、H1299、H460、H226、H520中HVEM蛋白表达,筛选出HVEM蛋白表达升高最明显的H1299细胞进行后续实验。将H1299细胞分为si-NC组、si-HVEM-1组和si-HVEM-2组,分别用Lipofectamine 2000瞬时转染si-NC、siHVEM-1和si-HVEM-2干扰序列,转染48 h。采用Transwell小室实验检测细胞迁移和侵袭能力,采用实时荧光定量PCR法和Western blotting法检测HVEM、E-钙黏蛋白(E-cadherin)、N-钙黏蛋白(N-cadherin)、波形蛋白(Vimentin)、β-连环蛋白(β-catenin)mRNA和蛋白相对表达量。结果 与si-NC组比较,si-HVEM-1组和si-HVEM-2组迁移、侵袭细胞数及HVEM mRNA、蛋白相对表达量均减少,且si-HVEM-2...     

短发夹状RNA抑制SMYD3基因在HepG2细胞中的表达

目的构建针对人SET-和MYND-结构域含有蛋白3(SMYD3)基因的短发夹状RNA (shRNA)表达载体pGenesil-1-s,观察其对人肝癌细胞株HepG2细胞SMYD3基因表达的特异性抑制效应。方法设计合成针对SMYD3 mRNA编码序列267～288、302～323靶位点之间的核苷酸片断,并定向克隆到仅表达EGFP的空载体pGenesil-1的U6启动子下,构建重组质粒pGenesil-1-s1、pGenesil-1-s2；不针对任何序列的重组质粒pGenesil-1-hk作为对照。通过脂质体介导转染人肝癌细胞株HepG2,应用逆转录聚合酶链反应,western blot蛋白免疫印迹法分别从mRNA、蛋白水平检测阻抑效应。结果酶切鉴定和测序结果证实了pGenesil-1-s1、pGenesil-1-s2、pGenesil-1-hk的成功构建,转染HepG2细胞后,pGenesil-1- s1、pGenesil-1-s2组SMYD3 mRNA和蛋白表达均明显下调,与pGenesil-1-hk组及pGenesil-1对照组比较差异有统计学意义(P＜0.01)。结论构建的重组质粒pGenesil-1-s1、pGenesil-1-s2能特异性抑制SMYD3 在HepG2细胞中的表达。     

普伐他汀对HepG2细胞增殖及侵袭能力的影响

目的 观察普伐他汀对肝癌细胞株HepG2细胞增殖及侵袭、运动能力的影响.方法 将培养的HepG2细胞随机分为对照组和高、中、低浓度普伐他汀组(普伐他汀分别为0.01、0.10、1.00g/L),四甲基偶氮唑盐比色法测定普伐他汀对HepG2细胞增殖的影响;Matrigel侵袭实验和迁移实验检测普伐他汀对HepG2细胞的侵袭和运动能力的影响;p38活性试剂盒测定p38活性,Western blot测定磷酸化p38(p-p38)、丝裂原活化蛋白激酶磷酸酶-1(MKP-1)、Ras相似物C(ras homologue C,RhoC)及基质金属蛋白酶-2(MMP-2)的表达.数据分析采用方差分析,各浓度组与对照组之间采用Dunnett-t法进行比较.结果 不同浓度普伐他汀处理细胞后,低、中、高浓度普伐他汀组HepG2细胞增殖率分别为89.51%±9.55%、75.53%±8.33%、64.99%±7.87%,p38活性分别为87.45%±8.22%、73.18%±8.32%、60.11%±7.21%,p-p38表达量分别为83.18%±10.71%、49.83%±6.36%.30.70%±4.66%,MKP-1表达量分别为127.89%±15.38%,153.96%±18.99%、182.63%±20.21%,RhoC表达量分别为81.08%±9.66%、57.11%±7.89%、33.65%±4.78%,MMP-2表达量分别为88.21%±10.01%、51.22%±6.18%、35.66%±5.09%,与对照组的100%相比,差异均有统计学意义(F值分别为19.76、22.29、18.22、20.87、20.01和18.22,P值均＜0.05).Matrigel体外侵袭实验及Tranwell小室迁移实验结果显示,对照组过膜细胞数高于普伐他汀处理组过膜细胞数(F值分别为21.09和19.78,P值均＜0.05).结论 普伐他汀通过抑制p38活性及p-p38表达、提高MKP-1表达,抑制肝癌HepG2细胞增殖;并通过下凋RhoC及MMP-2表达,抑制HepG2细胞侵袭,运动.     

靶向survivin的小干扰RNA对HCCLM6细胞恶性表型的影响

目的 研究survivin基因在肝癌细胞中的表达水平及survivin小干扰RNA对高侵袭潜能人肝癌细胞HCCLM6恶性表型的影响.方法 收集4种人肝癌细胞株,以RT-PCR和Western blot检测survivin蛋白质表达,进而筛选出高表达survivin基因的肝癌细胞.构建针对survivin mRNA的干扰质粒pshRNA-survivin及阴性对照质粒pGPU6/GFP/Neo-NC,并将其转染HCCLM6细胞.实时荧光定量PCR检测survivin mRNA表达量的变化情况;肿瘤细胞黏附实验检测细胞黏附能力的改变及Matrigel侵袭实验检测细胞侵袭力的改变. 结果 4种肝癌细胞随侵袭能力升高survivin mRNA表达水平依次升高(P＜0.05),HCCLM6细胞survivin表达水平最高;Western blot结果与RT-PCR结果一致.HCCLM6细胞转染pshRNA-survivin后,survivin mRNA表达量明显下降,抑制率达93.500%±3.117%,与转染阴性对照质粒组(8.215%±0.797%)相比,差异有统计学意义(t=70.852,P＜0.01).细胞黏附实验结果显示,survivin重组质粒转染组黏附率为11.403%±1.256%,阴性对照组为32.545%±1.367%(t=20.732,P＜0.01).Matrigel侵袭实验结果显示,与阴性对照组[(32.6±1.4)]个相比,转染pshRNA-survivin后,细胞侵袭力明显下降[(13.5±0.9)个,t=14.5,P＜0.01].结论 Survivin与肝癌侵袭转移等恶性生物学行为有关,并随侵袭转移潜能升高表达水平升高.pshRNA-survivin可以特异性抑制高侵袭肝癌细胞HCCLM6中survivin表达,并显著降低其侵袭、黏附能力,小干扰RNA技术有望成为抑制肝癌侵袭转移的新途径.     

上皮间质转化在原发性肝癌侵袭、转移中的作用

上皮间质转化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)是指上皮细胞在特定的情况下向间质细胞转分化的现象。在原发性肝细胞癌的侵袭、转移中存在这一现象。因此,本文除介绍EMT及其诱导调控因素之外,还对它在原发性肝癌侵袭、转移中的作用进行综述。