MiR-532-3p抑制弥漫性大B细胞淋巴瘤细胞增殖的机制研究

目的：研究miR-532-3p和脂蟾毒甙元（RES）通过调节Wnt/β-catenin信号对弥漫性大B细胞淋巴瘤（DLBCL）细胞活性的作用机制。方法：收集2019年10月至2021年10月兰州市兰州大学第一医院DLBCL患者的癌组织样本及癌旁组织样本;将SU-DHL-4细胞分为mimics-NC组、miR-532-3pmimics组及对照组、脂蟾毒甙元组（RES组）。采用RT-qPCR法检测miR-532-3p的表达水平;Western blot检测β-catenin的蛋白含量;MTT法检测SUDHL-4细胞的增殖活性。结果：相比于癌旁淋巴组织,淋巴癌组织中的miR-532-3p表达明显降低（P<0.001）;淋巴瘤细胞中的miR-532-3p的含量显著低于正常淋巴细胞（P<0.001）。过表达miR-532-3p后,SU-DHL-4细胞的增殖活性明显下降（P<0.01）,而β-catenin的表达亦显著减少（P<0.05）。相比于对照组,RES抑制了SU-DHL-4细胞的增殖,同时降低了细胞中β-catenin的表达。结论：过表达miR-532-3p降低Wn...     

miR-505-3p 对胃癌细胞增殖、克隆形成及迁移、侵袭的影响及机制研究

目的 检测胃癌组织及细胞中miR-505-3p 表达,并探究其对胃癌细胞增殖、克隆形成、迁移和侵袭的影响及潜在分子机制。方法 利用实时荧光定量PCR 实验（qRT-PCR）检测胃癌组织、癌旁正常组织及胃癌细胞和人正常胃黏膜细胞中miR-505-3p 相对表达;构建miR-505-3p 过表达、c-MYC 过表达和敲低表达细胞系,通过CCK-8 法,克隆斑点形成实验、Transwell 侵袭/ 迁移实验检测miR-505-3p 和c-MYC 对胃癌细胞增殖、克隆形成及迁移、侵袭的影响;裸鼠皮下成瘤实验验证miR-505-3p 对裸鼠肿瘤生长的影响;双荧光素报告实验验证miR-505-3p 和c-MYC 的靶向关系,并探究其两者间的表达调控作用;Western blot 检测miR-505-3p 和c-MYC 对Wnt/β-catenin 通路关键蛋白表达的影响。结果 临床胃癌组织中miR-505-3p 表达水平较正常癌旁组织显著下调（0.92±0.37 vs 1.74±0.59）,差异有统计学意义（t=3.723,P ＜ 0.01）。胃癌细胞系MGC803（1.12±0.35）,AZ521（2.31±0.24）和HGC-27（2.28±0.43）中miR-505-3p 相对表达较人正常胃黏膜细胞系GES1（4.62±0.79）明显降低,差异有统计学意义（F=26.109,P ＜ 0.001）。miR-505-3p 过表达组细胞增殖（0.92±0.27）、克隆形成（51.67±21.75）、迁移（43.25±15.47 ）、侵袭（38.53±14.76）能力较NC组（1.85±0.34,128.36±36.42,100.08±2.12,100.12±1.94）明显降低,差异均有统计学意义（t=3.131 ～ 7.166,均P ＜ 0.05）;miR-505-3p 过表达抑制了裸鼠生长。c-MYC 是miR-505-3p 的靶基因,miR-505-3p 靶向负调控c-MYC。c-MYC 过表达组细胞增殖（2.72±0.68）、迁移（147.15±20.36）、侵袭（145.46±22.73）能力较NC 组（1.85±0.34,100.08±2.12,100.12±1.94）明显增高,差异均有统计学意义（t=2.455 ～ 4.456,均P ＜ 0.05）;c-MYC 过表达可逆转miR-505-3p 对胃癌细胞增殖、迁移和侵袭的抑制作用。miR-505-3p 过表达组Wnt（0.46±0.07 ）,β-catenin（0.50±0.05）蛋白相对表达水平明显低于NC 组（1.01±0.02,1.02±0.02）,差异均有统计学意义（t=8.139,7.342,均P ＜ 0.001）;过表达c-MYC 能够逆转miR-505-3p 对Wnt 和β-catenin 蛋白表达的抑制作用。结论 胃癌中miR-505-3p 显著低表达,其可通过靶向调控c-MYC 表达介导Wnt/β-catenin 信号通路激活进而发挥作用参与胃癌的发生发展过程。     

miR-15b-5p通过靶向LATS2基因调控 前列腺癌细胞侵袭、迁移以及凋亡的分子机制

目的探讨miR-15b-5p靶向大肿瘤抑制分子(LATS2)基因对前列腺癌PC-3细胞侵袭、迁移及凋亡的影响及机制。方法将anti-miR-15b-5p及anti-miR-15b-5p+si-LATS2(同时抑制miR-15b-5p和LATS2表达)转染前列腺癌PC-3细胞,48 h后,通过qRT-PCR检测miR-15b-5p mRNA表达,Transwell小室检测细胞侵袭和迁移能力;膜联蛋白V-异硫氰酸荧光素/碘化丙啶(Annexin V-FITC/PI)双染细胞凋亡试剂盒检测细胞凋亡率。双荧光素酶报告系统检测miR-15b-5p与LATS2的靶向关系。Western blotting检测LATS2、β-catenin、MMP-2和Bax蛋白表达。结果 PC-3细胞转染anti-miR-15b-5p后,miR-15b-5p mRNA表达明显降低,细胞侵袭和迁移能力明显降低,细胞凋亡率明显升高(P 0. 05)。miR-15b-5p与LATS2存在靶向关系,抑制LATS2表达后可明显减弱anti-miR-15b-5p对PC-3细胞侵袭、迁移、凋亡及β-catenin、MMP-2和Bax蛋白表达的影响(P 0. 05)。结论抑制miR-15b-5p可明显降低前列腺癌PC-3细胞的侵袭和迁移能力,并诱导细胞凋亡,其机制与靶向LATS2抑制Wnt/β-catenin信号通路有关。     

miR-142-2p通过TCF7调控骨肉瘤细胞侵袭、迁移以及凋亡的分子机制

目的研究miR-142-2p对骨肉瘤细胞迁移、侵袭、凋亡的影响,并探讨其机制。方法运用Western blot检测癌旁组织、骨肉瘤组织或U-2OS细胞中TCF7的蛋白表达;将miR-142-3p组(转染miR-142-3p mimics)、miR-con组(转染miR-con)、si-TCF7组(转染si-TCF7)、si-con组(转染si-con)均用脂质体法转染至U-2OS细胞; qRT-PCR法检测各组细胞中miR-142-2p的表达; Transwell法检测各组细胞的迁移、侵袭;流式细胞术检测各组细胞的凋亡;双荧光素酶报告基因检测实验检测各组细胞的荧光活性。结果与癌旁组织相比,骨肉瘤组织中miR-142-3p表达显著降低,TCF7表达显著升高(P 0. 05);过表达miR-142-3p、敲减TCF7可抑制U-2OS细胞的迁移侵袭,促进凋亡; miR-142-3p可靶向负调控TCF7的表达。结论 miR-142-3p可抑制骨肉瘤细胞迁移、侵袭,促进凋亡,其机制可能与靶向TCF7有关,将可为骨肉瘤的治疗提供新靶点。     

miR-124-3p通过靶向Rab11a缓解创伤性脑损伤引起的氧化应激和炎性反应

目的探讨微小RNA-124-3p(miR-124-3p)/脑Ras相关蛋白11a(Rab11a)分子轴在创伤性脑损伤(TBI)引起的氧化应激和炎性反应中的作用。方法采用过氧化氢(H2O2)处理小鼠海马神经元(HT22)细胞构建TBI细胞模型,实时荧光定量PCR(RT-qPCR)检测miR-124-3p和含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶1(caspase 1)、白细胞介素1β(IL-1β)、白细胞介素18(IL-18)及肿瘤坏死因子α(TNF-α)的表达水平;Western blot检测硒蛋白N1(SEPN1)、谷胱甘肽过氧化物酶1(GPX1)和诱导型一氧化氮合酶(iNOS)蛋白的表达水平;双荧光素酶报告基因试验验证miR-124-3p和Rab11a之间的靶向调控关系;活性氧(ROS)检测试剂盒检测ROS水平。结果 miR-124-3p在H2O2处理的HT22细胞中低表达(P0.05);过表达miR-124-3p明显抑制H2O2诱导HT22细胞SEPN1、GPX1蛋白表达水平的下调(P0.05)和iNOS表达水平的上调(P0.05),以及炎症因子caspase 1、IL-1β、IL-18表达水平的上调(P0.05);双荧光素酶报告基因证实miR-124-3p靶向作用Rab11a并下调其表达(P0.05);实验进一步证实,与敲降Rab11a比较,同时敲降miR-124-3p和Rab11a可明显下调单独敲降Rab11a对HT22细胞氧化应激和炎性反应的抑制作用(P0.05)。结论 miR-124-3p通过靶向下调Rab11a抑制H2O2诱导HT22细胞氧化应激和炎性反应。     

和厚朴酚对人结肠癌细胞及Wnt信号通路的影响及调控作用

目的探讨和厚朴酚(HNK)对人结肠癌细胞及Wnt信号通路的影响和调控作用。方法采用结晶紫染色法和增殖细胞核抗原(PCNA)蛋白表达检测HNK对人结肠癌LoVo细胞增殖的抑制作用;利用流式细胞仪和Caspase-3蛋白表达观察HNK对人结肠癌LoVo细胞凋亡的影响;利用荧光素酶报告质粒检测HNK对Wnt信号通路中β-catenin/Tcf4转录活性的影响;蛋白的表达采用Western blot检测。结果 HNK剂量依赖性地抑制细胞增殖(P0.05),并诱导细胞凋亡。荧光素酶报告质粒检测结果显示,HNK在10.0μmol/L时就能明显降低LoVo细胞中β-catenin/Tcf4转录活性(P0.05)。结论 HNK能抑制人结肠癌细胞增殖,诱导其凋亡,该作用可能与HNK抑制Wnt信号通路的转导有关。     

5-氟尿嘧啶促进HPV阳性宫颈癌细胞凋亡的Wnt/β-catenin信号通路机制研究

【目的】探讨5-氟尿嘧啶促进HPV阳性宫颈癌细胞凋亡的Wnt/β-连环蛋白(β-catenin)信号通路机制。【方法】HPV阳性宫颈癌细胞SiHa随机分为对照组、低剂量组(10μmol/L 5-氟尿嘧啶)、高剂量组(40μmol/L 5-氟尿嘧啶)和Wnt抑制剂(ICG-001)组(10μmol/L ICG-001),除对照组给予无菌磷酸盐缓冲液外,其余各组分别给予对应剂量的药物。比较各组细胞的增殖、凋亡情况(凋亡率和凋亡蛋白Caspase-3、Caspase-9)及Wnt/β-catenin信号通路相关蛋白(Wnt、β-catenin)的表达水平。【结果】5-氟尿嘧啶能明显抑制HPV阳性宫颈癌细胞增殖,提高细胞凋亡率和细胞凋亡蛋白Caspase-3及Caspase-9的表达水平(P<0.05);5-氟尿嘧啶处理后Wnt/β-catenin信号通路关键蛋白Wnt和β-catenin的表达明显减弱(P<0.05),且随着剂量的增加,上述效果越明显(P<0.05)。【结论】5-氟尿嘧啶促进HPV阳性宫颈癌细胞凋亡,可能与其抑制Wnt/β-catenin信号通路有关。     

miR-203a-3p 靶向GLS1 调控HCC 细胞增殖、迁移、侵袭的机制研究

目的　探究微小核糖核酸（microRNAs, miRNA, miR）-203a-3p 对肝细胞癌（hepatocellular carcinoma,HCC）细胞增殖、迁移、侵袭的影响及其潜在分子机制。方法　采用实时荧光定量PCR（quantitative real-time PCR,qRTPCR）检测HCC 细胞、人正常肝细胞以及临床HCC 组织中miR-203a-3p 相对表达;采用细胞增殖实验、细胞划痕实验和Transwell 实验分别检测miR-203a-3p 对HCC 细胞增殖、迁移、侵袭的影响;生物信息学网站预测miR-203a-3p 的潜在靶基因（GLS1）,双荧光素酶实验进行验证;探究HCC 细胞对谷氨酰胺的依赖性及抑制谷氨酰胺酶1(glutaminase 1,GLS1) 对HCC 细胞增殖、迁移、侵袭的影响;蛋白免疫印迹（Western blot）实验检测Wnt/β-catenin 信号通路关键蛋白β-catenin,p-GSK-3β 和c-Myc 表达。结果　HCC 癌组织中miR-203a-3p（0.32±0.07）表达明显低于癌旁正常组织（1.02±0.03）,差异有统计学意义（t ＝ 41.105,P ＜ 0.001）;HCC 细胞HepG2（0.34±0.05）,HCCLM3（0.58±0.06）,Huh7（0.43±0.05）,Hep3B（0.29±0.04）中miR-203a-3p 相对表达水平明显低于人正常肝细胞LO2（1.01±0.02）中miR-203a-3p 表达,差异有统计学意义（F ＝ 119.080,P ＜ 0.001）。与Blank 组相比,miR-203a-3p 过表达组HCC细胞增殖（0.61±0.05 vs 1.24±0.06）, 迁移率（21.43%±2.01% vs 60.22%±3.14%） 及侵袭能力（76.54±13.56 vs221.06±16.54）均明显降低,差异有统计学意义（t ＝ 14.849,13.900,10.562,均P ＜ 0.001）。GLS1 是miR-203a-3p的靶基因,miR-203a-3p 靶向负调控GLS1 表达。HCC 细胞中GLS1 高表达呈现高酶活性,HCC 细胞对谷氨酰胺存在明显依赖性。GLS1 抑制组α-KG,谷氨酸水平均较Blank 组和siRNA-NC 组明显降低,差异有统计学意义（F ＝ 64.754,35.627,均P ＜ 0.001）。GLS1 抑制组细胞增殖（0.59±0.04）、迁移率（30.15%±1.02%）和侵袭能力（69.59±15.74）较Blank 组明显降低（1.29±0.07,59.67%±1.45%,202.14±13.52）,差异均有统计学意义（t ＝ 16.499,16.278,11.215,均P ＜ 0.001）。miR-203a-3p 过表达和GLS1 表达抑制明显抑制了Wnt/β-catenin 信号通路关键蛋白β-catenin,p-GSK-3β 和c-Myc 的表达,差异均有统计学意义（t ＝ 11.129 ～ 28.213,均P ＜ 0.001）。转染GLS1 可逆转miR-203a-3p 对HCC 细胞生物学行为及Wnt/β-catenin 信号通路关键蛋白表达的抑制作用。结论　HCC 中miR-203a-3p 显著低表达,其过表达能够抑制HCC 细胞的增殖、迁移和侵袭,可能与GLS1 调控谷氨酰胺代谢及miR-203a-3p 靶向GLS1调控Wnt/β-catenin 信号通路活性有关。     

miR-219a-5p对皮肤鳞状细胞癌细胞凋亡的影响及机制

目的探讨miR-219a-5p对皮肤鳞状细胞癌细胞凋亡的影响以及潜在的作用机制。方法设置miR-con组、miR-219a-5p组、anti-miR-con组、anti-miR-219a-5p组、miR-219a-5p+pcDNA组、miR-219a-5p+pcDNA-SMC4组、miR-con+SMC4-WT组、miR-con+SMC4-MT组、miR-219a-5p+SMC4-WT组、miR-219a-5p+SMC4-MT组,转染均用脂质体法。qRT-PCR检测miR-219a-5p和SMC4 mRNA表达水平;Western Blot检测蛋白表达;MTT法检测细胞增殖活性;流式细胞术检测细胞凋亡;双荧光素酶报告基因检测实验检测荧光活性。结果相较于人正常皮肤细胞HaCaT,皮肤鳞状细胞癌细胞HSC-2、Colo-16、SCL-1中SMC4 mRNA和蛋白表达水平显著升高,miR-219a-5p表达水平显著降低(P<0.05)。过表达miR-219a-5p可抑制皮肤鳞状细胞癌细胞增殖,诱导细胞凋亡;促进Caspase-3蛋白表达,抑制Cyclin D1蛋的表达;抑制Wnt/β-catenin信号通路激活。miR-219a-5p靶向负调控SMC4的表达,转染SMC4野生型表达载体的HSC-2细胞荧光素酶活性显著降低(P<0.05);而转染SMC4突变型表达载体的HSC-2细胞荧光素酶活性差异不显著。且过表达miR-219a-5p,SMC4表达水平显著降低;抑制miR-219a-5p表达,SMC4表达水平显著升高。过表达SMC4能逆转miR-219a-5p对皮肤鳞状细胞癌细胞HSC-2的增殖抑制和凋亡促进的作用。结论miR-219a-5p可抑制皮肤鳞状细胞癌细胞增殖,诱导细胞凋亡,其机制可能与Wnt/β-catenin及SMC4信号通路有关,将为皮肤鳞状细胞癌的预防和治疗提供新靶点。     

miR-142-3p靶向HOXA5对急性B淋巴细胞白血病细胞增殖、周期阻滞与凋亡作用的研究

目的:探讨miR-142-3p通过调控同源异型盒基因5(HOXA5)的表达对急性B淋巴细胞白血病(B-ALL)细胞增殖、周期和凋亡的作用及分子机制。方法:采用实时荧光定量PCR法检测人B-ALL细胞系Nalm6和人B淋巴母细胞系Hmy2-cir中miR-142-3p和HOXA5的表达水平。使用脂质体转染技术将miR-142-3p模拟物、pcDNAHOXA5过表达质粒、miR-142-3p模拟物+pcDNA-HOXA5过表达质粒及对照物转染至Nalm6细胞。根据microRNA.org预测HOXA5与miR-142-3p的结合位点,通过双荧光素酶报告基因实验检测miR-142-3p与HOXA5基因的靶向关系。使用细胞计数盒8(CCK-8)和细胞克隆形成实验检测miR-142-3p对Nalm6细胞增殖能力的影响。采用流式细胞术检测miR-142-3p对Nalm6细胞周期分布与凋亡的影响。通过Western blot检测细胞周期相关蛋白G1/S-特异性周期蛋白-D1(CyclinD1)、周期蛋白依赖性激酶4 (CDK4)以及B细胞淋巴瘤/白血病-2蛋白(BCL-2)、BCL-2相关X蛋白(Bax)和半胱氨酸天门冬氨酸特异性蛋白酶(Caspase-3)的表达水平。结果:与Hmy2-cir细胞比较,miR-142-3p在Nalm6细胞中低表达而HOXA5呈高表达(P 0.05)。miR-142-3p与HOXA5 3'-UTR存在互补结合区域,转染miR-142-3p模拟物与野生型HOXA5 3'-UTR组荧光素酶活性较转染miR-142-3p阴性对照与野生型HOXA5 3'-UTR组荧光素酶活性显著下降(P 0.05)。转染48和72 h后,转染miR-142-3p模拟物能够抑制Nalm6细胞增殖能力和细胞克隆数目(P 0.05),使Nalm6细胞发生G1期阻滞,从而抑制CyclinD1与CDK4蛋白表达(P0.01),促进Nalm6细胞的凋亡,并且抑制BCL-2蛋白表达,促进Bax、Caspase-3蛋白表达(P 0.05)。结论:miR-142-3p通过靶向下调HOXA5表达来抑制Nalm6细胞增殖,使细胞G1期阻滞,并促进细胞的凋亡。     

miR-21在前列腺癌中的表达及抑制其表达对前列腺癌细胞增殖凋亡的影响

目的探讨抑制前列腺癌细胞中miR-21基因表达对癌细胞增殖和凋亡的影响及机制。方法 RTPCR检测前列腺癌及癌旁组织中miR-21基因的mRNA表达;空白对照组(Control)、阴性对照组(NC)和miR-21 inhibitor组转染人前列腺癌PC-3细胞,48 h后RT-PCR检测各组细胞中miR-21基因的mRNA表达;CCK8实验检测细胞增殖;流式细胞仪检测细胞凋亡;Western blot检测ki67、Cleaved caspase3、β-catenin、Cyclin D1蛋白表达。结果前列腺癌组织中miR-21的mRNA表达显著高于癌旁组织(P0.01);转染miR-21 inhibitor后miR-21的表达显著降低;NC组细胞存活率、细胞凋亡率及ki67、Cleaved caspase3、β-catenin、Cyclin D1蛋白表达与对照组,差异无统计学意义(P0.05),miR-21 inhibitor组细胞存活率及ki67、β-catenin、Cyclin D1蛋白表达显著低于对照组,细胞凋亡率及Cleaved caspase3蛋白表达显著高于对照组(P0.01)。结论抑制前列腺癌细胞中miR-21基因的表达可降低癌细胞的增殖及诱导细胞凋亡,其机制与抑制Wnt/β-catenin信号通路有关。     

β-连环素及其信号通路在肝癌中的研究进展

β-连环素(β-catenin)是一种由CTNNB1基因编码的具有介导细胞间黏附及信号转导等多重功能的重要分子,其通过Wnt/β-catenin信号通路在肿瘤的发生发展中发挥关键作用。近年来,大量的研究证实经典Wnt/β-catenin信号通路的异常激活在肝癌中具有重要作用,而作为Wnt信号通路关键分子的β-catenin的异常表达与肝癌的发生、发展及预后密切相关。现对β-catenin和Wnt/β-catenin信号通路在肝癌中的作用及目前研究状况作一简要综述,为进一步阐明肝癌中β-catenin及信号通路的作用机制及以Wnt/β-catenin信号通路为靶点的临床治疗提供理论依据。     

MiR-144调控Wnt4/β-catenin信号通路抑制多发性骨髓瘤细胞恶性生物学行为的研究

目的:探讨miR-144对多发性骨髓瘤细胞生物学行为的影响及机制。方法:RT-PCR检测miR-144在多发性骨髓瘤细胞及多发性骨髓瘤(MM)患者血浆中的表达情况;MTT法检测miR-144模拟物转染至骨髓瘤细胞后细胞的增殖情况及细胞克隆形成能力;流式细胞术检测过表达miR-144的骨髓瘤细胞周期分布情况;Tunel法检测过表达miR-144的骨髓瘤细胞的凋亡情况;Transwell细胞侵袭实验与迁移实验检测过表达miR-144的骨髓瘤细胞的侵袭及迁移能力;Western blot法检测过表达miR-144的骨髓瘤细胞的MMP-9、MMP-2的蛋白表达水平及Wnt4/β-catenin信号通路相关蛋白的表达水平。结果:MM细胞株及MM患者血中miR-144表达水平明显低于正常对照组(P0.05)。过表达miR-144的骨髓瘤细胞的增殖、侵袭、迁移能力明显降低(P0.05),细胞凋亡水平增加(P0.05)。过表达miR-144的骨髓瘤细胞的MMP-9、MMP-2、Wnt4/β-catenin信号通路相关蛋白的表达水平均明显低于对照组(P0.05)。结论:MiR-144能抑制多发性骨髓瘤细胞的增殖、迁移和侵袭,诱导其凋亡,其具体机制可能与抑制Wnt/β-catenin信号通路的活性有关。     

CircKRT17与miR-485-5p互作调控Wnt/β-catenin通路影响胃癌发生发展的机制研究

目的探讨circ KRT17在胃癌中的表达水平,并对circ KRT17在胃癌中的临床意义、生物学功能及内在机制进行评价。方法 2013年5月至2018年3月获得67例临床胃癌样本和对应的癌旁正常组织标本,并采用qRTPCR检测circ KRT17在胃癌组织和不同胃癌细胞株中的表达情况;分析circ KRT17的表达与胃癌患者临床病理学特征之间的关系;CKK-8法和平板克隆实验检测circ KRT17对胃癌细胞增殖能力的影响;Transwell实验检测circ KRT17对胃癌细胞迁移和侵袭能力的影响;裸鼠成瘤实验检测circ KRT17对胃癌细胞肿瘤异种移植的影响;荧光素酶报告基因检测circ KRT17与miR-485-5p以及miR-485-5p与Wnt3a之间的相互作用。结果 circ KRT17在胃癌组织中表达上调,与肿瘤分期、转移及患者预后不良密切相关。此外,降低circ KRT17表达显著抑制了胃癌细胞的增殖、迁移和侵袭,诱导了细胞凋亡。体内实验显示,敲低circ KRT17表达抑制肿瘤生长。机制上,研究发现circ KRT17作为miR-485-5p的海绵,增加Wnt3a的表达,从而激活Wnt/β-catenin信号。结论 circ KRT17/miR-485-5p/Wnt3a/β-catenin信号对胃癌的发生、发展至关重要。     

Wnt/β-catenin信号通路在1,25-二羟基维生素D3诱导人急性早幼粒细胞HL-60单核系分化中的作用

目的探讨Wnt/β-catenin信号通路在1,25-二羟基维生素D3[1,25-(OH)2-hydroxyvitamin D3,1,25-(OH)2 D3]诱导人急性早幼粒细胞HL-60向单核系分化中的作用。方法分别采用不同浓度的1,25-(OH)2 D3在不同时间诱导HL-60细胞向单核系分化,确定最佳药物浓度和诱导时间;使用最佳药物浓度0.1μmol/L 1,25-(OH)2 D3诱导HL-60细胞72 h,采用流式细胞技术、细胞化学染色技术检测并观察HL-60细胞的分化方向、分化程度及细胞增殖受抑情况;western blot检测ICAT、TCF1、c-Myc、cyclin D1、β-catenin蛋白的表达水平及pRB蛋白的磷酸化水平;采用免疫荧光法检测β-catenin在细胞内的分布情况。结果0.1μmol/L 1,25-(OH)2 D3于72 h时可有效诱导HL-60细胞向单核系分化;G 0/G 1期细胞增殖明显受抑(t=4.769,P<0.001),且细胞增殖抑制率升高(t=4.84,P<0.001);瑞氏染色结果发现,与对照组比较,成熟单核细胞比例显著升高[(61.2±13.6)%vs(0.8±0.2)%,t=7.49,P=0.001];western blot结果表明,ICAT蛋白表达上调(t=9.917,P<0.01),TCF1、c-Myc和cyclin D1蛋白表达下调(t分别为54.54,54.64和29.24,P均<0.001);此外,pRB蛋白的磷酸化水平亦下调(t=150.6,P<0.001);细胞β-catenin蛋白表达水平无显著性变化(P>0.99),但其在核内的表达水平下降(t=9.77,P=0.01);免疫荧光检测结果显示,β-catenin蛋白呈胞浆聚集状态。结论1,25-(OH)2 D3通过抑制Wnt/β-catenin信号通路,抑制HL-60细胞增殖并促进其单核系分化。     

miR-544a对非小细胞肺癌细胞系Wnt信号通路抑制因子GSK3β表达的调控作用

摘要：目的：探讨微小RNA-544a(miR-544a)对肺癌干细胞的自我更新能力影响及其可能的机制。 方法：通过生物信息学预测miR-544a的靶向基因,用荧光素酶报告系统及western blot验证其靶向关系;构建稳定表达miR-544a的非小细胞肺癌（NSCLC）细胞系95C和95D,并用荧光定量PCR验证;用肿瘤球悬浮培养实验检测miR-544a在形成肿瘤球中的作用。 结果：生物信息学预测发现,miR-544a可以靶向调节Wnt信号通路的抑制子GSK3β,并通过荧光素酶报告系统得到了验证（F=201.37,P＜0.01）;western blot结果显示,miR-544a可以下调GSK3β的表达,而β-catenin、CD133蛋白表达水平明显上调（F分别为7.73,3.37,9.43,P均＜0.01）;荧光定量PCR结果显示,95C、95D细胞在转染miR-544a后,miR-544a表达水平增高,分别为20.51±0.97、15.16±1.38 (F=418.05,P＜0.01)。肿瘤球悬浮培养实验发现,稳定表达miR-544a的细胞能够反复形成具有肿瘤干细胞特性的肿瘤球。 结论：miR-544a可以通过直接下调GSK3β的表达来激活Wnt信号通路,以维持肺癌干细胞自我更新能力。     

沉默wee1基因对卵巢癌细胞增殖、迁移和侵袭的作用机制

目的探讨沉默wee1基因对卵巢癌细胞增殖、迁移和侵袭的作用机制。方法将卵巢癌细胞分为Blank组、小干扰RNA(siRNA)阴性对照(siRNA-NC)组和携带wee1基因片段(siRNA-wee1)组,利用siRNA技术在卵巢癌细胞中沉默wee1基因,采用实时荧光定量PCR、免疫印迹法(WB)检测3组卵巢癌细胞wee1 RNA及蛋白表达水平,采用细胞划痕试验、Transwell试验观察卵巢癌细胞平板集落形成数及卵巢癌细胞迁移、侵袭能力,采用WB观察卵巢癌细胞Wnt/β-catenin信号通路相关蛋白Wnt3a、β-连环蛋白(β-catenin)、细胞周期蛋白D1(Cyclin-D1)、基质金属蛋白酶7(MMP-7)的表达情况。结果siRNA-wee1组卵巢癌细胞wee1 RNA和蛋白表达水平均低于siRNA-NC组和Blank组(P<0.05),卵巢癌细胞集落形成数少于Blank组和siRNA-NC组(P<0.05),卵巢癌细胞迁移、侵袭能力低于Blank组和siRNA-NC组(P<0.05),Wnt/β-catenin信号通路相关蛋白Wnt3a、β-catenin、Cyclin-D1和MMP-7表达水平均低于siRNA-NC组和Blank组(P<0.05)。结论沉默wee1基因可抑制Wnt/β-catenin信号通路的激活,进而抑制卵巢癌细胞增殖、迁移和侵袭能力。     

Wnt/β-catenin信号通路在TNF-α诱导的心肌细胞损伤和凋亡中的作用研究

目的 建立心肌细胞炎症损伤模型,探讨Wnt/β-catenin信号通路在心肌细胞损伤和凋亡中的作用。方法 体外培养大鼠心肌细胞H9c2,用含肿瘤坏死因子-α(TNF-α)的细胞培养基诱导心肌细胞,建立炎症心肌细胞损伤模型。实验包括对照组、炎症组、DDK1不同浓度阻断组共5组。各组检测细胞活力和凋亡率,检测相关基因和蛋白表达;检测细胞培养液中LDH和AST及细胞中SOD浓度。结果 TNF-α诱导H9c2心肌细胞β-catenin、TCF7L2和CyclinD1基因和蛋白表达显著上调,细胞增殖受到抑制、细胞损伤和凋亡增加(P<0.05)。而在DDK1阻断Wnt通路后,相对于炎症组,β-catenin、TCF7L2和CyclinD1基因和蛋白表达显著下调,细胞活力上升、细胞损伤减轻、凋亡率降低(P<0.05)。相关性分析显示,β-catenin基因表达与细胞活力呈负相关,与LDH、AST活性呈正相关(P<0.05)。结论 在TNF-α刺激下,心肌细胞Wnt通路被显著激活,抑制Wnt通路基因表达可减轻细胞损伤和凋亡。     

MiR-144-3p靶向SGK3通过Hippo信号通路抑制卵巢癌的生长和侵袭

目的:探讨miR-144-3p对卵巢癌生长和侵袭的作用及机制。方法:RT-qPCR检测正常卵巢上皮细胞和卵巢癌细胞miR-144-3p与SGK3mRNA的表达,双荧光素酶报告检测靶向关系,将卵巢癌SKOV3细胞分为对照组(Control组)、模拟物对照组(mimic-NC组)、miR-144-3p高表达组(miR-144-3p mimic组)、SGK3高表达组(pc-SGK3组)、miR-144-3p和SGK3都高表达组(miR-144-3p+SGK3组),CCK-8法检测细胞增殖,克隆形成实验检测细胞生长,流式细胞术检测细胞周期和细胞凋亡,Transwell实验检测细胞侵袭,蛋白质印迹分析检测p-MST,p-LATS,p-YAP,MST,LATS,YAP蛋白表达水平;裸鼠后肢腹侧皮下注射SKOV3细胞悬液构建移植瘤,每周检测移植瘤体积,第30天颈椎脱位法处死裸鼠,完整取出皮下肿瘤,电子天平称重,蛋白质印迹分析检测SGK3,p-MST,p-LATS,p-YAP,MST,LATS,YAP蛋白表达水平。结果:MiR-144-3p在卵巢癌细胞中低表达,而SGK3高表达;miR-144-3p靶向负调控SGK3;miR-144-3p过表达能够明显减弱卵巢癌细胞增殖、减少每视野中卵巢癌细胞克隆数目,减短细胞周期,增加细胞凋亡率,减少侵袭细胞数目、上调p-MST/MST,p-LATS/LATS,p-YAP/YAP蛋白表达(P0.01),再加入SGK3高表达和Hippo信号通路抑制剂XMU-MP-1后均能逆转上述反应。结论:MiR-144-3p靶向SGK3通过Hippo信号通路抑制卵巢癌的生长和侵袭。     

Wnt信号通路对酒精性肝纤维化中肝星状细胞活化的影响以及整合素连接激酶的调节作用

目的:研究Wnt信号通路对酒精性肝纤维化中肝星状细胞活化的影响以及整合素连接激酶(integrin-linked kinase,ILK)的调节作用。方法:60只Wistar雄性大鼠,随机分为正常对照组和模型组,采用白酒辅以玉米油、吡唑混合食料灌胃的方法制备大鼠酒精性肝纤维化模型,于造模12周后,采用免疫组化法检测大鼠肝组织α-SMA、β-catenin蛋白的表达,并进一步通过逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测大鼠肝组织ILK mRNA的表达。结果:正常肝组织中有少量β-catenin、α-SMA蛋白和ILK mRNA的表达,模型组大鼠肝组织中β-catenin、α-SMA蛋白和ILKmRNA的表达明显升高(P<0.01)。β-catenin的表达量与α-SMA的表达呈正相关(r=0.913,P<0.01),ILK的表达量与β-catenin的表达亦呈正相关(r=0.880,P<0.01)。结论:酒精性肝纤维化发生发展过程中,Wnt信号通路在肝星状细胞活化的过程中可能发挥了重要的作用,ILK可能通过调节Wnt信号通路间接发挥了促进肝星状细胞活化的作用。