鸡MxA基因的克隆、表达及生物学活性检测

目的：克隆鸡MxA基因，构建其原核表达质粒，并诱导其在大肠杆菌中表达融合蛋白。方法：采用RT-PCR方法从鸡成纤维细胞（CEF）中扩增MxA，将其克隆至克隆载体pMD18-T中，筛选阳性克隆后回收目的片段，将其克隆人原核表达质粒pGEX-6p—1，构建其重组表达质粒pGEX—MxA，以IPTG诱导表达，经SDS—PAGE、鸡胚新城疫病毒干扰试验和VSV-CEF微量细胞抑制试验进行分析、鉴定。结果：经RT—PCR扩增获得的MxA序列与GeneBank报道的序列一致，SDS—PAGE和干扰试验证实重组质粒可以表达出相应分子量为45000的蛋白，与GST—MxA融合蛋白分子量一致。结论：成功完成了鸡MxA基因的克隆及其原核表达质粒的构建，在大肠杆菌DIL5ct中经IPTG诱导表达了融合蛋白GST—MxA，为进一步探讨MxA的生物学活性，探索抗病毒药物的研发奠定了基础。     

PTK重组质粒的构建与表达

目的构建并表达出PTK重组蛋白,以鉴定酪氨酸蛋白激酶(PTK)的活性,筛选酪氨酸激酶的抑制剂.方法从PTK重组克隆载体上切下目的基因片段Abl-PTK使其连接到表达载体pGEX4T-2上,转化大肠杆菌DH5a,筛选鉴定出正确的转化子.转化菌株经IPTG诱导后进行表达并进行SDS-PAGE分析.结果经酶切和诱导表达鉴定,重组质粒pGEX4T-2-PTK构建成功,并高效表达了58KD的GST-PTK融合蛋白.结论PTK基因被成功地重组至融合蛋白表达载体中,并在大肠杆菌中获得高效表达.该研究为进一步纯化、鉴定PTK的活性,筛选PTK的抑制剂奠定了基础.     

幽门螺杆菌全长cagA基因和霍乱毒素B亚单位基因的克隆与表达

目的：构建表达幽门螺杆菌（Hp)细胞毒素相关蛋白（CagA)及粘膜免疫佐剂量霍乱毒素B亚单位（CTB）的重组质粒，并在大肠杆菌中表达获得基因重组蛋白。方法：用PCR方法从幽门螺杆菌扩增CagA基因片段，从霍乱弧菌扩增CTB基因片段，将它们转入原核载体质粒pGEMEX-1，在大肠杆菌DH5α中克隆，并在JM109DE3中表达。结果：重组质粒pEGEMEX-CTB的全长序列经分析与GenBank公布的序列相符；各表达蛋白经SDS－PAGE分析，相对分子量与文献相符；重组蛋白经Westem blot检测有较强的抗原性。结论：基因重组菌表达的融合蛋白有可能作为有效抗原用于幽门螺杆菌疫苗的研制及检测试剂盒的制备。     

hBDNF基因原核表达重组质粒的构建及其在大肠杆菌中的表达

我们按照hBDNF基因全长编码序列设计合成引物,从人基因组DNA中扩增出760bp的片段,反向插入到pGEM-3Zf( )载体上,获得pGEMBF18克隆,限制性酶分析和DNA序列测定均证实该克隆插入片段为hBDNF基因全长编码序列。从pGEMBF18克隆中获取hBDNF全长编码片段,与原核表达载体pGEX-5T连接,构建了p5TBF34原核表达重组质粒。重组质粒转化大肠杆菌JM109,经IPTG诱导表达,SDS-PAGE特异区带分子量为43kDa,此重组蛋白占菌体可溶性蛋白总量的7.53%,Western杂交证实该特异区带具hBDNF抗原活性。     

幽门螺杆菌oipA基因片段的克隆表达及抗原性分析

目的:分片段克隆表达幽门螺杆菌oipA基因,确定抗原性最强的重组蛋白肽段.方法:从Hp国际标准株NCTC11637中获取oipA全长基因,克隆至pGEM-T载体并鉴定正确,以重组pGEM-T/oipA为模板PCR扩增6个不同大小的oipA基因片段,与表达载体pET-42a连接,转化大肠杆菌BL-21,重组子经PCR、酶切、测序鉴定.IPTG诱导重组蛋白肽段的表达,经Western Breeze 化学发光法鉴定融合蛋白;优化诱导时间和IPTG浓度,诱导重组蛋白大量表达;Ni-NTA His*Bind树脂亲和纯化表达产物;羊抗Hp多克隆抗体,Western blot法检测纯化蛋白的抗原性,间接ELISA法筛选抗原性最强的重组肽段.结果:6条oipA基因片段在大肠杆菌中都得到了表达,表达的蛋白肽段均可被抗Hp多克隆抗体识别,具有抗原性,其中反应性最强的是最小的蛋白肽段.结论:oipA基因片段可在原核系统中表达,所获取的最小的肽段抗原性最强,可望制备检测血清相应抗体的试剂盒.     

流感病毒RNA聚合酶亚基PA6片断的克隆及表达

目的将流感病毒RNA聚合酶PA6亚基片段进行亚克隆、表达,获得重组的亚克隆多肽,为进一步研究PA6亚基功能奠定基础。方法以PA亚基cDNA为模板,用PCR方法扩增出PA6片段,应用定向克隆策略将扩增后片段与高效表达载体pQE32重组,阳性克隆重组质粒经酶切及测序鉴定,IPTG诱导各亚克隆系高效表达,优化表达条件。结果PCR法扩增出402bp的片段,酶切及测序鉴定获得正确的重组质粒,在E.coliM15中表达得到相对分子量约为17KD的重组蛋白,获得重组多肽。结论成功地亚克隆及表达了流感病毒RNA聚合酶PA6亚基。     

TAT-EGFP融合蛋白的表达纯化及穿膜活性的研究

目的在大肠埃希菌中高效表达TAT-EGFP融合蛋白并鉴定纯化,然后进行穿膜活性的研究。方法以本室前期构建的重组质粒pQE-EGFP为模板,采用PCR方法特异性扩增TAT-EGFP基因序列,随后克隆于原核表达载体pQE-31,所构建的重组质粒经测序鉴定后转化大肠埃希菌JM109,IPTG诱导表达;SDS-PAGE和Western blotting鉴定表达蛋白质,经Ni2+-金属螯合亲和层析纯化,将纯化蛋白加入体外培养的小鼠黑色素瘤B16细胞中,荧光显微镜下观察TAT蛋白的穿膜活性。结果成功构建了pQE-TAT-EGFP重组质粒的,转化大肠埃希菌JM109,经IPTG诱导,目的蛋白表达率为25%,SDS-PAGE、Western blotting初步测定目的蛋白的相对分子质量(Mr)约为30160,纯化得到了目的融合蛋白TAT-EGFP。并在体外培养的B16细胞中证实TAT-EGFP融合蛋白穿透生物膜的能力。结论通过对TAT-EGFP融合蛋白穿膜活性的分析,证实了TAT具有穿膜活性,为TAT-PEⅢ融合蛋白抑瘤活性的研究提供了理论依据,也为生物大分子药物进入组织细胞内发挥治疗作用奠定了基础。     

肿瘤抗原MAGE-3基因的克隆与原核表达

目的 克隆肿瘤抗原MAGE-3基因3’端657bp片段，对其编码的蛋白羧基端97-314aa进行原核表达。方法 从含人MAGE-3基因全长cDNA的pUC19／MAGE-3质粒中经聚合酶链式反应(PCR)扩增3’端657bp片段，并克隆入pGEX-4T-1载体，构建重组原核表达质粒pGEX／MAGE-3，对含有该质粒的大肠杆菌DH5α进行诱导表达。结果 从pUC19／MAGE-3重组质粒中扩增获得一条约660bp的条带，测序结果表明与GenBank公布的MAGE-3序列一致，成功地构建了pGEX／MAGE-3原核表达质粒，含有该质粒的大肠杆菌DH5α经异丙基-β-半乳糖苷(Isopropyl—beta—D—thiogalactopyranoside，IPTG)诱导后表达Mr为54000的谷胱甘肽巯基转移酶(Glutathione S-transferse，GST)融合蛋白。表达的融合蛋白约占菌体蛋白总量的28％。结论 成功地构建了pGEX／MAGE-3原核表达质粒，获得了MAGE-3蛋白羧基端97～314aa融合蛋白，为该蛋白应用于肿瘤免疫治疗奠定了基础。     

GST-GP302融合蛋白在大肠杆菌中的表达及其抗血清的制备

目的 :在大肠杆菌中表达血小板糖蛋白GPIbα之vWF结合区(GP30 2 )与谷胱甘肽S 转移酶GST的融合蛋白并制备其抗血清。方法 :将GP30 2片断插入GST融合表达载体 pGEX 4T 1,重组载体酶切鉴定后 ,在大肠杆菌中经IPTG诱导表达获得GST GP30 2融合蛋白 ,SDS PAGE分析表达产物。包涵体经变性复性后免疫新西兰白兔 ,制备抗血清 ,ELISA、Westernblot检测重组抗原的免疫活性。结果 :重组质粒酶切鉴定表明 ,GP30 2基因已正确插入到 pGEX 4T 1中 ,经IPTG诱导后 ,表达出相对分子质量 (Mr)约为 5 90 0 0的融合蛋白 ,获得了ELISA效价为 1× 10 -5的多克隆抗体。Westernblot证明所制备的多抗可以与血小板糖蛋白特异性结合。结论 :GP30 2片断在大肠杆菌中的成功表达及制备得到的多克隆抗体 ,为检测血小板糖蛋白GPIbα及其在其他体系中的表达提供了一种检测途径     

流感病毒RNA聚合酶亚基PA6片断的克隆及表达

目的 将流感病毒RNA聚合酶PA6亚基片段进行亚克隆、表达，获得重组的亚克隆多肽，为进一步研究PA6亚基功能奠定基础。方法 以PA亚基cDNA为模板，用PCR方法扩增出PA6片段，应用定向克隆策略将扩增后片段与高效表达载体pQE32重组，阳性克隆重组质粒经酶切及测序鉴定，IPTG诱导各亚克隆系高效表达，优化表达条件。结果 PCR法扩增出402bp的片段，酶切及测序鉴定获得正确的重组质粒，在E．coli M15中表达得到相对分子量约为17KD的重组蛋白，获得重组多肽。结论 成功地亚克隆及表达了流感病毒RNA聚合酶PA6亚基。     

人热休克蛋白70基因的原核表达

目的 表达人热休克蛋白70（HSP70）并进行鉴定。方法 用PCR方法扩增人HSP70基因片段，经T-A克隆法克隆到载体pUCm-T中，并进行DNA测序，将人HSP70基因片段从载体pUCm-T中酶切后，构建重组表达载体pGEX-4T-1-HSP70，并转化大肠杆菌JM109，用IPTG诱导，收集细菌，菌体裂解后进行SDS-PAGE及Western blot检测。结果 人HSP70基因的PCR产物约为1.9kb。序列测定结果证实，所获目的序列与文献[3]报道的相一致，经EcoRⅠ和XhoⅠ酶切鉴定证实。人HSP70基因已成功地克隆到表达载体pGEX-4T-1中，构建的表达载体pGEX-4T-1-HSP70，能很好地在大肠杆菌中表达相对分子质量（Mr)为96000并具有抗原特性的融合蛋白，结论 成功地克隆并表达了HSP70基因，为研究HSP70的结构。功能与临床应用提供了必要条件。     

人脑源性神经营养素-6基因的克隆及在原核细胞中的表达

目的 克隆人脑源性神经营养素－6（neurotrophin-6,NT-6)基因，并观察其在大肠杆菌中的表达情况。方法 从流产胎儿大脑皮层提取总RNA，用逆转录聚合酶链反应扩增得到人的NT－6基因cNDA片段；经酶切回收后克隆进pBK-CMV质粒，构建NT－6的表达载体。通过诱导，使NT－6基因在大肠杆菌中表达。结果 分离克隆了人脑源性NT－6基因，含该基因的大肠杆菌在异丙基－β－D－硫代半乳糖苷诱导的情况下，表达了特异性的蛋白质。结论 人脑源性NT－6基因的克隆表达为进一步研究NT－6的结构，功能及临床应用奠定了基础。     

OPG与MBP融合蛋白在大肠杆菌中的表达

目的 克隆人骨保护素（OPG）成熟肽段编码区基因，并在大肠杆菌中表达。方法 采用RT－PCR法，扩增人OPG成熟肽段编码区cDNA，并克隆入原核表达载体pMAL-c2x中，转化BL21（DE3）PlysS大肠杆菌感受态细胞，经0.1mmol/L IPTG诱导后，收集菌体蛋白，进行SDS－PAGE及Western blot鉴定。结果 获得人OPG成熟肽段编码区cDNA，以构建的原核表达载体pMAL-OPG转化菌株后，可表达人OPG和麦芽糖结合蛋白（MBP）的融合蛋白，相对分子质量（M）为85000。表达产物的蛋白量约为菌体总蛋白的13％。Western blot表明，融合蛋白能与抗人OPG多克隆抗体特异性结合。结论 获得人OPG成熟肽全长cDNA，并在大肠杆菌中以OPC－MBP融合蛋白的形式表达。     

肝癌抗原肽(EPVTKAEML)与人HSP70融合基因的构建及原核表达

目的:构建及原核表达肝癌抗原肽(EPVTKAEML)与人热休克蛋白70(HSP70)的融合基因.方法:采用加端PCR方法,将EPVTKAEML的基因序列融合到人HSP70基因的3′端;将融合基因克隆入原核表达载体pET-28a( )中,构建重组质粒pET-28a( )/EPVTKAEML-HSP70.经限制性内切酶BamH I、Xho I双酶切鉴定及序列测定后,转化E.coli BL21(DE3),经IPTG诱导表达融合蛋白,SDS-PAGE检测表达结果.结果:应用加端PCR方法扩增出约2.0 kb的目的片段,序列测定结果证实,EPVTKAEML的基因序列成功地融合到人HSP70基因的3′端.经BamH I、Xho I酶切鉴定证实,融合基因成功地克隆到原核表达载体pET-28a( )上;转入重组质粒的E.coli BL21(DE3)经IPTG诱导后,SDS-PAGE分析发现在相对分子质量(Mr)约72 000处有表达量明显增多的蛋白条带.结论:成功地构建并表达了肝癌抗原肽(EPVTKAEML)与人HSP70的融合基因.     

新基因MAGE-n表位肽与人HSP70融合基因的构建及表达纯化

目的构建MAGE-n159-167(QLVFGIEVV)表位肽与人热休克蛋白70(HSP70)的融合基因并表达纯化。方法应用PCR方法,将QLVFGIEVV的cDNA序列融合到人HSP70基因的3'端,将融合基因克隆入原核表达载体pET-28a(+)中,构建重组质粒pET-28a(+)QLVFGIEVV-HSP70;采用双酶切(Sac Ⅰ、Hind Ⅲ)及PCR鉴定后测序;转化大肠杆菌E.coli BL21(DE3),用IPTG诱导表达,Ni Sepharose6FF亲和填料进行分离纯化,SDS-PAGE检测表达及纯化结果。结果经PCR扩增成功获得约2.0kb的目的片段,重组体经Sac Ⅰ、Hind Ⅲ双酶切分析及PCR结果与预期结果一致,测序正确。转入重组质粒的E.coli BL21(DE3)经IPTG诱导、SDS-PAGE分析得到71kD左右的目的蛋白条带。用Ni Sepharose6FF亲和填料分离纯化,获得了纯化的融合蛋白。结论成功构建原核表达载体pET-28a(+)QLVFGIEVV-HSP70,并获得纯化的融合蛋白,为基于MAGE-n的肿瘤疫苗研制提供良好的抗原奠定了实验基础。     

睾丸肿瘤抗原MAGE-E1基因片段的克隆及其在大肠杆菌中的表达

目的：克隆及表达人胶质瘤特异性抗原MAGE-E1基因片段。方法：从人胶质瘤细胞系BT-325提取总RNA，用RT—PCR从中扩增出MAGE-E1基因片段。将MAGE—E1基因片段插入载体pGEM—Teasy中，经全自动序列分析仪测序正确后，再克隆至表达载体pGEX—4T—2中，构建重组表达载体pGEX—4T—2—MAGE—E1，并转化大肠杆菌进行表达。结果：用1mmoL／L异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导5h，MAGE—E1蛋白的表达即达高峰。SDS—PAGE及凝胶密度扫描分析表明，表达出MT约41000大小的蛋白，占菌体总蛋白35％。结论：该基因片段的高效表达为进一步制备其抗体，以及制备肿瘤疫苗奠定了基础。     

家兔MT—I基因克隆及其在大肠杆菌中的表达与分离

采用 RT- PCR方法扩增镉诱导后的家兔肝脏金属硫蛋白 - I(Metallothionein- I,MT- I)基因的 c DNA全长 ,克隆入原核融合表达载体 p QE4 0 ,转化大肠杆菌 M15。菌落印迹法检测阳性菌株 ;Western blotting分析重组融合蛋白的表达方式 ;经 SDS- PAGE电泳后 ,Im age Master VDS software分析融合蛋白诱导表达条件 ;并采用 Ni-NTA agarose纯化融合蛋白。结果发现 ,重组融合蛋白在原核细胞中表达存在可溶和不可溶 (包涵体 )两种形式 ,表达量随 IPTG诱导时间延长而增加 ,9h达高峰 (占菌体不溶性蛋白总量的 5 7.4 % ) ,经 Ni- NTA亲合层析纯化得到重组融合蛋白 ,为进一步分离目的蛋白单体并研制和开发这一产品提供了可靠依据     

His 标记 STAT4(565-748 氨基酸)肽段融合蛋白原核表达及纯化

目的:构建His 标记的人STAT4 C-端565-748 氨基酸肽段原核表达载体,埃希氏菌中诱导表达,并纯化蛋白。方法:PCR 扩增编码STAT4 C-端565-748 氨基酸肽段的基因片段,克隆到pET-28a 原核表达载体,转化感受态细菌BL21,IPTG诱导蛋白表达,经包涵体变性、复性、树脂纯化、透析。免疫印迹鉴定纯化的融合蛋白。结果:PCR 扩增获得目的片段,克隆到pET-28a,转化感受态细胞,IPTG诱导发现融合蛋白存在于包涵体。经变性、复性、树脂纯化和透析,免疫印迹实验发现融合蛋白表达、被纯化。结论:成功构建人STAT4(565-748aa)肽段原核表达质粒并获纯化融合蛋白。     

结核杆菌热休克蛋白70基因的克隆与原核表达

目的：克隆结核杆菌热休克蛋白70(TBhsp70)基因，并在大肠杆菌中表达。方法：利用PCR技术从结核杆菌H37Rv中扩增Hsp70基因，并将其克隆到pUC19中，进行测序。将得到的Hsp70基因克隆到表达载体pGEX-4T-1中，构建重组表达质粒pGEX—TBhsp70，在大肠杆菌DH5α中进行表达。结果：成功地克隆了TBhsp70基因。DNA测序证实，与GenBank公布的序列一致。含pGEX-TBhsp70基因表达质粒的大肠杆菌经IPTG诱导后，能够表达相对分子质量(MR)约为96000的融合蛋白。结论：获得了TBhsp70基因，成功地构建了原核表达质粒pGEX-TBhsp70，并在大肠杆菌得到表达，为其相关研究奠定了一定的基础。     

人β防御素4在大肠杆菌中的融合表达及其多克隆抗体的制备和鉴定

目的:构建人β防御素4(human β defensin 4,HBD4)基因的原核融合表达载体PGEX-4T-2/mHBD4,诱导GST-HBD4融合蛋白在大肠杆菌中表达,并制备其多克隆抗体.方法:从重组克隆载体PMD18-T/HBD4中扩增HBD4成熟肽编码基因,并克隆入PGEX-4T-2中,在IPTG诱导下,表达GST-HBD4融合蛋白.以表达的融合蛋白GST-HBD4作为免疫原免疫家兔制备抗GST-HBD4的抗血清,抗体效价及特异性分别用ELISA和Western blot法鉴定.结果:在大肠杆菌中成功表达Mr约为32 000的融合蛋白GST-HBD4.ELISA法检测抗血清的效价可达到1:128 000,Western blot分析抗血清可与原核表达的融合蛋白GST-HBD4特异结合.结论:在大肠杆菌中成功表达了GST-HBD4融合蛋白,并制备了GST-HBD4的抗血清,为进一步研究HBD4蛋白的结构和功能奠定了基础.