脐血CD34+细胞的体外扩增研究

目的:探讨造血生长因子不同组合方式对脐血CD34+造血干/祖细胞(HSC/HPC)的扩增作用.方法:应用StemsepTM阴性分选系统分离纯化CD34+细胞,在体外液体培养体系中经不同组合细胞因子进行扩增1～3w.结果:FL+Tpo+SCF+IL-3+GM-CSF+G-CSF+Epo组合的扩增效果最佳,可分别扩增细胞总数、造血祖细胞集落总数(CFCs)、CD34+细胞达1627.57±52.93、56.78±8.13、41.09±4.11倍.FL和Tpo具有明显的协同扩增早期祖细胞的作用,CFCs和CD34+细胞在1～2w维持在较高水平,以后逐渐衰退.结论:合理的细胞因子组合在大量扩增造血细胞的同时也有助于早期造血祖细胞的自我更新,把握适宜的扩增时机,将有助于扩增细胞在质和量上满足移植和基因治疗等的要求.     

脐血造血细胞体外扩增巨核细胞的研究

目的探讨在体外用不同的细胞因子组合在不同的培养时间对脐血CD 34+细胞向巨核系分化以及扩增的作用.方法细胞因子分为TPO(T)、TPO+SCF+IL-6+IL-3(TS36)、TPO+SCF+IL-6+IL-3+FL(TSF 36)等3组.将脐血CD 34+细胞在体外经14 d的诱导分化和扩增,在扩增后通过流式细胞仪、集落培养和免疫组化等方法检测培养物中CD41+细胞百分率、扩增倍数和巨核祖细胞集落形成单位(CFU-MK)产率和扩增倍数以发现较好的细胞因子组.并比较了TSF 36组细胞因子在第7 d和第14d时的CD 41+细胞百分率及CFU-MK产率及它们的扩增倍数.结果CD 41+细胞占培养细胞的比率3组细胞因子在14 d分别为77.5±3.5%、14.4±3.2%、21.3±1.7%;CD 41+细胞扩增倍数3组细胞因子分别为75.2±13.2倍、212.4±70.8倍、378.6±74.7倍;每104个细胞可形成CFU-MK分别为56.7±7.0个、22.0±3.0个、24±4.0个;扩增倍数分别为5.9±2.3倍、14.6±0.6倍、19.5±2.4倍.TSF 36组细胞因子在扩增CFU-MK和CD 41+细胞方面均有最强的作用,其第14 d的CD 41+细胞百分率及CFU-MK产率均低于第7 d,但扩增倍数均高于第7 d.结论TSF 36细胞因子组合能使脐血CD34+细胞向巨核系进行分化和大量扩增,其巨核细胞扩增倍数第14 d高于第7 d,但巨核细胞纯度降低.这一结果进一步为临床应用巨核细胞体外扩增回输提供了实验基础.     

多种细胞因子组合对脐血干/祖细胞体外扩增的影响

目的　探讨在体外培养液中不同细胞因子组合对脐血 CD34+ 细胞的扩增作用以及扩增后的 CD34+ 细胞的造血功能。方法　用 FL、SCF、TPO、IL - 3、TL - 6组合成不同的实验组 ,对脐血中分离纯化的 CD34+ 细胞经 6d的短期体外扩增 ,扩增后经流式细胞仪分析 ,L TC- IC、祖细胞集落群计数 ,从而求得较好的细胞因子组合组。结果CD34+ 细胞扩增倍数为 3 .1～ 8.6倍 ,16份脐血 CD34+ 细胞数达到 10× 10 6 以上的细胞总数 ;扩增的 CD34+ 细胞再造血功能与原始 CD34+ 细胞无显著差异。FL是扩增组合中不可缺少的细胞因子 ,同时还证实 TPO与其他细胞因子组合有扩增 CD34+ 细胞的作用 ,但单独使用 TPO稍长时间会使 CD34+ 细胞过多向巨核细胞分化。结论　 FST3 6细胞因子组合能使部份单位体积的脐血 CD34+细胞体外扩增达一定数量 ,为干细胞移植于成人提供了一定的实验依据与方法     

造血生长因子对脐血单个核细胞的体外增殖效应

目的 :探讨不同造血生长因子组合对人脐血造血细胞的体外增殖效应 .方法 :采用免疫荧光染色和祖细胞集落测定 ,观察人脐血单个核细胞 (MNC)经多种造血生长因子的不同组合作用 2wk后其有核细胞、CD34+ 细胞和祖细胞数量的变化 ,并用脾结节形成实验和骨髓祖细胞培养等观察其在小鼠体内的短期造血能力 .结果 :脐血MNC分别与A(SCF /IL 3/IL 6 /G CSF/GM CSF) ,B(SCF/IL 3/IL 6 /FL/EPO) ,C(SCF/IL 3/IL 6 /EPO ) ,3种造血生长因子组合悬浮培养 2wk ,有核细胞、CD34+ 细胞和祖细胞数量增加 .有核细胞总数在B组因子作用下增加最显著 [(2 6± 5 )倍 ],而CD34+ 细胞数量在A组因子作用下增加最明显 [(8± 2 )倍 ].3种因子组合对不同种类祖细胞的增殖效应不同 ,其中A组因子主要刺激早期混合系祖细胞CFU Mix扩增 [(11± 2 )倍 ],B组因子主要刺激粒单系祖细胞CFU GM扩增 [(2 2± 3)倍 ],C组因子主要刺激早期红系祖细胞BFU E扩增 [(13± 4 )倍 ].此外 ,给受照小鼠输注A组因子作用后的人脐血细胞 ,13d在小鼠脾脏形成脾结节 (CFU S) ,30d从小鼠骨髓检出造血祖细胞(CFU GM和CFU E) ,造血细胞数量与从输注新鲜脐血细胞的小鼠体内检出的结果无显著性差异 (P >0 .0 5 ) .结论 :造血细胞生长因子对人脐血单个核细胞具有体外     

人参总皂苷体外定向诱导CD34+细胞分化为粒系血细胞的研究

目的研究人参总皂苷(TSPG)协同造血生长因子对CD34 细胞体外定向诱导分化为粒系血细胞的影响。方法应用阴性磁性分选策略,以StemsepTM系统从正常人骨髓细胞中分离CD34 造血干/祖细胞(HSC/HPC),通过甲基纤维素半固体培养法检测TSPG诱导CD34 HSC/HPC向粒系祖细胞集落(CFU-GM)增殖与分化的能力;在SCF IL-3 GM-CSF G-CSF(SIGG)液体培养体系中加入不同剂量的TSPG,检测对CD34 HSC/HPC增殖形成CFU-GM的影响以及CD33 细胞比例的变化。结果TSPG(10～50μg/mL)均能提高CD34 细胞形成CFU-GM的集落产率,以TSPG20μg/mL效果最为明显;不同质量浓度的TSPG协同造血生长因子在液体培养体系中诱导CD34 细胞2周,观察粒系血细胞的分化,TSPG10～70μg/mL均可不同程度地提高细胞总数、CFU-GM扩增倍数及CD33 细胞比例,TSPG20μg/mL是液体培养诱导CD34 细胞向粒系分化的最佳质量浓度。结论TSPG协同造血生长因子能促进CD34 细胞定向诱导分化为粒系血细胞。     

不同细胞因子组合对脐带血AC133+细胞体外扩增效率的影响

目的探讨不同细胞因子组合对脐带血AC133+细胞体外扩增效率的影响.方法采用免疫荧光标记法,使用流式细胞仪测定新鲜分离的、不同培养条件下体外培养7、14d的脐带血AC133+细胞的扩增效率.结果新鲜脐带血AC133+细胞的比例为(0.93±0.2)%.短期液体扩增培养后,脐带血AC133+细胞的比例发生明显变化,其中在细胞因子SCF、FL和IL-3组合下,AC133+细胞的细胞数及扩增倍数与SCF、FL和IL-11组合相比较,差异非常显著(P＜0.01).结论在体外短期扩增培养中,早期效应细胞因子能显著上调脐带血AC133+细胞的比例;用SCF、FL和IL-3组合扩增脐带血造血干/祖细胞,能够获得更高的体外扩增效率.     

脐血CD34+细胞巨核系定向诱导分化的研究

目的研究TPO与SCF、IL-11协同在体外促进入脐血CD34+细胞向巨核系增殖分化的效应.方法利用流式细胞仪分离纯化脐血CD34+细胞,在含血清液体培养体系中、细胞因子诱导下培养14 d.采用流式细胞术测定不同时间点培养体系中CD41+细胞的比例;同时采用甲基纤维素半固体集落培养测定CFU-MK的数量.结果经14 d培养,TPO+SCF+IL-11组可使CD41+细胞和CFU-MK数量分别扩增40.83±12.41倍、7.86±2.63倍,明显高于TPO组的28.69±8.27倍、4.48±1.25倍.结论在体外SCF和IL-11可以协同增强TPO诱导脐血CD34+细胞向巨核系增殖分化的作用.     

人脐带血造血干细胞的分离和体外扩增

目的 :通过对人新鲜脐带血造血干细胞的体外分离 ,探讨不同细胞生长因子的体外培养体系对CD34+ 细胞的扩增作用。方法 :用SCF、FL、GM CSF、IL 3、IL 6、G CSF、TPO组合成不同的实验组 ,对脐血中分离的CD34+ 细胞进行 2 1d的体外培养 ,扩增后经流式细胞仪分析 ,从而求得细胞培养较好的细胞因子组合。结果 :不同细胞因子组细胞培养孔CD34+ 细胞比例在培养 7d时已经开始上升 ,10d时继续上升 ,到 14d达高峰 ,继续培养 18d ,CD34+ 细胞比例逐渐下降 ,但仍高于培养前水平 ,培养 2 1d ,CD34+ 持续下降。总细胞数在第一周即扩增 35 .32倍 ,10～ 14d总细胞数扩增 331.7倍 ,2 1d总细胞数扩增 4 2 2 .2倍 ,SCF +IL 3+IL 6 +TPO +FL细胞因子组合对总细胞扩增最多 ,SCF +IL 3+IL 6 +GM CSF +G CSF对总细胞扩增略少 ,其次是SCF +TPO +FL细胞因子组合 ,最少为SCF +IL 3+IL 6 +GM CSF细胞因子组合 ,细胞涂片染色观察 ,体外培养 14d ,细胞胞体小 ,胞浆量少 ,胞核体积大 ,规则 ,为早期造血干细胞。结论 :体外HSC培养 ,细胞因子对细胞的增殖有明显的作用 ,但不同的细胞因子组合对细胞的扩增作用有明显的不同     

胎儿骨髓基质细胞与外源性细胞因子的协同造血支持作用

目的 :探讨胎儿骨髓基质细胞与外源性细胞因子的协同造血支持作用。方法 :联合应用胎儿骨髓基质细胞与外源性细胞因子如重组人干细胞因子 (rh SCF)、IL - 3、IL - 6、粒巨噬细胞集落刺激因子 (GM- CSF)、粒细胞集落刺激因子 (G- CSF)、促红细胞生成素 (EPO)等先后对成人骨髓单个核细胞及 CD34 + 富集细胞培养 5 d至 2周。结果 :胎儿骨髓基质细胞与上述细胞因子具有良好的协同作用 ,CD34 +富集细胞以胎儿骨髓基质细胞 +SCF+IL- 3+IL- 6 +G- CSF+EPO培养 2周 ,可使细胞总数、粒 -单系造血祖细胞 (CFU- GM)、早期红系造血祖细胞 (BFU- E)及 CD34 +细胞分别扩增 (119.6± 30 .9)倍、(5 4.6± 17.4)倍、(2 5 .2± 4.4)倍、(11.1± 4.2 )倍。结论 :胎儿骨髓基质细胞可协同上述外源性细胞因子支持成人骨髓造血祖细胞的有效扩增     

脐血造血干/祖细胞体外扩增的实验研究

目的探讨因子组合FL+TPO+SCF+IL-6对脐血CD34 +细胞的体外扩增效应.方法采用Mini-MACS分离纯化出CD34+细胞, 在无基质接触的液体悬浮培养体系培养,通过间接免疫荧光染色、流式细胞仪技术、集落形成试验等动态测定细胞扩增情况.结果培养4周后,FL+TPO+SCF+IL-6组细胞总数、集落形成数均比扩增前显著增加(P＜0.05),并且能维持一定比例的CD34+、Th y-1+细胞;SCF+IL-3+IL-6+GM-CSF+EPO组在第2周时集落形成数已降低,第4周时集落形成数、CD34+细胞基本检测不到.结论与经典因子组合SCF+IL-3+IL-6+G M-CSF+EPO相比,因子组合FL+TPO +SCF+IL-6能在较长时间内有效扩增脐血造血干/祖细胞, 是一个优化组合方案.     

干细胞来源的胰岛素分泌细胞的研究进展

Ⅰ型糖尿病是由于胰岛β细胞被自身免疫系统攻击、破坏,不能正常释放胰岛素,导致血糖升高.患者需终生注射胰岛素,由于给药过程缺乏理想的血糖感应系统,常导致糖尿病大血管病变、糖尿病肾病、糖尿病视网膜病变、神经病变及糖尿病足等慢性并发症的发生,是糖尿病死亡的主要原因[1].为了有效控制血糖,防止糖尿病并发症的发生,提高糖尿病患者的生存质量,目前主要采用两种治疗策略来改进胰岛素的治疗,一是胰岛素输入方式的改进:临床上广泛应用的胰岛素泵就是通过24 h不停地向患者体内输入微量胰岛素,模拟正常胰岛素分泌模式,控制血糖水平,减少并发症的发生.其次是寻找方法替代被患者自身免疫系统破坏的胰岛素分泌细胞,包括胰腺或胰岛移植、对非β细胞进行基因修饰以及对干细胞的诱导分化.70年代初,Lacy等成功地证明了移植胰岛细胞能够改善糖尿病大鼠的高血糖状态,胰岛细胞移植开始蓬勃开展起来.     

大鼠骨髓间充质干细胞向表皮细胞分化的初步研究

目的体外分离培养骨髓间充质干细胞,并探索表皮细胞生长因子诱导MSCs分化的潜能及条件.方法采用直接贴壁法,分离培养大鼠股骨和胫骨骨髓间充质干细胞,应用免疫细胞化学法检测细胞CD44、CD106、CD29、CD90、CD34等,对分离的细胞进行鉴定.以10～40 ng/ml的表皮生长因子处理第3代MSCs,观察细胞角蛋白的表达.用Western blot方法摸索integrin β1的表达与MSCs分化状态的关系.结果原代培养的骨髓间充质细胞CD44、CD106、CD29、CD90免疫细胞化学染色为阳性,CD34为阴性,符合骨髓间充质干细胞特征.MSCs经不同浓度的EGF体外诱导7 d后,免疫细胞化学结果显示,EGF浓度为30 ng/ml和40 ng/ml时,细胞角蛋白出现阳性表达;体外诱导14 d,呈角蛋白染色阳性的细胞比例进一步增加,同时integrin β1表达量下降.结论体外培养的MSCs在EGF诱导下,具有分化为表皮细胞的倾向,同时integrin β1可能在MSCs分化中具有一定的作用.     

鼠胶质瘤细胞上清液诱导人骨髓间充质干细胞向神经元样细胞的分化

目的：分离培养人骨髓间充质干细胞(MSCs),探讨鼠胶质瘤细胞上清液对其向神经元样细胞的诱导分化。方法：利用Percoll梯度分离法,培养人MSCs。采用鼠胶质瘤细胞上清液对MSCs进行诱导分化。观察人MSCs经诱导后细胞的形态变化,采用免疫细胞化学方法检测神经元烯醇化酶(NSE)、神经丝蛋白(NF)、胶质纤维酸性蛋白(GFAP)的表达。 结果：诱导24 h后,细胞胞体收缩呈锥形或球形,有突起长出,细胞间突起相互连接,交错成网,为典型的神经元样形态。免疫细胞化学结果显示,经诱导培养后的神经元样细胞的胞体及部分突起NSE和NF染色呈强阳性表达,而GFAP 染色呈阴性。诱导组出现NSE阳性的细胞率为(79.5±3.2)%,而对照组出现NSE阳性的细胞率为(12.1±2.0)%,两组之间比较差异有显著性 (P<0.01)。诱导组出现NF阳性的细胞率为(41.2±2.4)%,而对照组为阴性。结论：鼠胶质瘤细胞上清液可以诱导MSCs向神经元样细胞分化。     

CIK、DC-CIK细胞杀伤胃癌MKN-28细胞的作用比较

目的研究细胞因子诱导的杀伤细胞(CIK)与树突状细胞(DC)共培养后对胃癌MKN-28细胞株的杀伤作用。方法取正常人外周血,分离出外周血单个核细胞(PBMC),加入不同的细胞因子分别诱导出DC和CIK细胞,共培养成DC-CIK细胞,以MTS法测定不同组CIK细胞对MKN-28杀伤活性。结果与单纯CIK细胞相比较,DC-CIK组细胞增殖速率明显提高(P<0.05);具有更强的杀伤胃癌MKN-28细胞株的活性(P<0.05),效靶比为20.0∶1时,DC-CIK组对MKN-28的杀伤活性为(38.02±2.06)%,>CIK组的(29.78±1.84)%,差异有统计学意义。结论 DC-CIK细胞是一种增殖活性和细胞毒作用均高于单纯CIK细胞的免疫活性细胞。     

Expansive effects of aorta-gonad-mesonephros-derived stromal cells on hematopoietic stem cells from embryonic stem cells

Background Hematopoietic stem cells (HSCs) give rise to all blood and immune cells and are used in clinical transplantation protocols to treat a wide variety of refractory diseases, but the amplification of HSCs has been difficult to achieve in vitro. In the present study, the expansive effects of aorta-gonad-mesonephros (AGM) region derived stromal cells on HSCs were explored, attempting to improve the efficiency of HSC transplantation in clinical practice.Methods The murine stromal cells were isolated from the AGM region of 12 days postcoitum (dpc) murine embryos and bone marrow（BM）of 6 weeks old mice, respectively. After identification with flow cytometry and immunocytochemistry, the stromal cells were co-cultured with ESCs-derived, cytokines-induced HSCs. The maintenance and expansion of ESCs-derived HSCs were evaluated by detecting the population of CD34+ and CD34+Sca-1+cells with flow cytometry and the blast colony-forming cells (BL-CFCs), high proliferative potential colony-forming cells (HPP-CFCs) by using semi-solid medium colonial culture. Finally, the homing and hematopoietic reconstruction abilities of HSCs were evaluated using a murine model of HSC transplantation in vivo.Results AGM and BM-derived stromal cells were morphologically and phenotypically similar, and had the features of stromal cells. When co-cultured with AGM or BM stromal cells, more primitive progenitor cells (HPP-CFCs ) could be detected in ESCs derived hematopoietic precursor cells, but BL-CFC’s expansion could be detected only when co-cultured with AGM-derived stromal cells. The population of CD34+ hematopoietic stem/progenitor cells were expanded 3 times,but no significant expansion in the population of CD34+Sca-1+ cells was noted when co-cultured with BM stromal cells. While both CD34+ hematopoietic stem/progenitor cells and CD34+Sca-1+ cells were expanded 4 to 5 times respectively when co-cultured with AGM stromal cells. AGM region-derived stromal cells, like BM-derived stromal cells, could promote hematopoietic reconstruction and HSCs’ homing to BM in vivo.Conclusions AGM-derived stromal cells in comparison with the BM-derived stromal cells could not only support the expansion of HSCs but also maintain the self-renewal and multi-lineage differentiation more effectively. They are promising in HSC transplantation. Chin Med J 2005; 118(23):1979-1986     

基质细胞对髓性白血病细胞的促分化作用

髓性白血病存在着骨髓基质细胞的异常。本文从基质细胞对骨髓造血细胞的支持作用、基质细胞异常与髓性白血病的关系、基质细胞对髓性白血病细胞株的促分化作用以及细胞因子对髓性白血病的促分化作用等几个方面对国内外文献进行了综述,阐明基质细胞对髓性白血病细胞的促分化作用,并描述基质细胞的应用前景。     

肝干细胞--肝卵圆细胞的研究进展

对于肝卵圆细胞的研究已有一定时间，但近几年才明确其属于干细胞范畴，笔者简要综述了肝卵圆细胞的特征、来源、调控分化及与肝病的关系。     

Differentiation of Bone Marrow Mesenchymal Cells to Neural Cells

Summary： To explore the possibility and condition of differentiation of bone marrow mesenchymal ceils （BMSCs） to neural ceils in vitro, BMSCs from whole bone marrow of rats were cultured. The BMSCs of passage 3 were identified with immunocytochemical staining of CD44 （ ＋ ）, CD71 （ ＋ ） and CD45（-）, There were type I and type H ceils in BMSCs. Type I BMSCs were spindlehaped and strong positive in immunocytochemical staining of CD44 and CD71, whereas flat and big type H BMSCs were lightly stained. The BMSCs of same passage were induced to differentiate into neural ceils by β-mercaptoethanol （BME）. After induction by BME, the type I BMSCs withdrew to form neuron-like round soma and axon-like and dendrite-like processes, and were stained positively for neurofilament （NF）. The type H BMSCs did not change in the BME medium and were negatively or slightly stained of NF.     

SNL细胞作为饲养层细胞培养人胚胎干细胞

目的为便于人胚胎干细胞(ES细胞)的培养和研究,寻找一种建系细胞作为人ES细胞的饲养层细胞。方法以小鼠成纤维细胞系SNL细胞作为饲养层细胞培养人ES细胞株hES1。传代17代后,检测hES细胞表面特异性标志,包括碱性磷酸酶(AKP)、Oct-4、阶段特异性胚胎抗原(SSEA)-3和SSEA-4的表达;同时观察细胞的多向分化潜能。结果hES1细胞在SNL细胞饲养层上能持续生长。经多次传代后持续表达人ES细胞表面特异性标志,其注射于重症联合免疫缺陷小鼠皮下仍能形成畸胎瘤组织。结论SNL细胞能够作为饲养层细胞用于人ES细胞的培养,且操作更方便;该细胞已转染了耐受新霉素的基因,为将来对人ES细胞基因操作时进行药物筛选提供了可能。     

SNL细胞作为饲养层细胞培养人胚胎干细胞

目的 为便于人胚胎干细胞(ES细胞)的培养和研究,寻找一种建系细胞作为人ES细胞的饲养层细胞.方法 以小鼠成纤维细胞系SNL细胞作为饲养层细胞培养人ES细胞株hES1.传代17代后,检测hES细胞表面特异性标志,包括碱性磷酸酶(AKP)、Oct-4、阶段特异性胚胎抗原(SSEA)-3和SSEA-4的表达;同时观察细胞的多向分化潜能.结果 hES1细胞在SNL细胞饲养层上能持续生长.经多次传代后持续表达人ES细胞表面特异性标志,其注射于重症联合免疫缺陷小鼠皮下仍能形成畸胎瘤组织.结论 SNL细胞能够作为饲养层细胞用于人ES细胞的培养,且操作更方便;该细胞已转染了耐受新霉素的基因,为将来对人ES细胞基因操作时进行药物筛选提供了可能.