脐血CD34+细胞巨核系定向诱导分化的研究

目的研究TPO与SCF、IL-11协同在体外促进入脐血CD34+细胞向巨核系增殖分化的效应.方法利用流式细胞仪分离纯化脐血CD34+细胞,在含血清液体培养体系中、细胞因子诱导下培养14 d.采用流式细胞术测定不同时间点培养体系中CD41+细胞的比例;同时采用甲基纤维素半固体集落培养测定CFU-MK的数量.结果经14 d培养,TPO+SCF+IL-11组可使CD41+细胞和CFU-MK数量分别扩增40.83±12.41倍、7.86±2.63倍,明显高于TPO组的28.69±8.27倍、4.48±1.25倍.结论在体外SCF和IL-11可以协同增强TPO诱导脐血CD34+细胞向巨核系增殖分化的作用.     

脐血CD34+细胞向内皮细胞定向诱导分化的实验研究

目的探讨人脐血CD34 细胞体外分离、纯化、诱导扩增和分化为内皮细胞的可行性,并检测其表型。方法采集新鲜脐血经抗凝处理及无菌包装,Ficoll密度梯度离心法得单个核细胞,磁珠分选方法(MACS)分离出CD34 单个核细胞,M-199培养基中诱导分化,细胞形态学观察CD34 和CD34-细胞生长情况,流式细胞仪检测内皮细胞CD31表型,免疫组化验证蛋白水平表达。结果细胞形态学观察发现,刚分离的CD34 和CD34-单个核细胞呈圆形,形态小。CD34 细胞培养3d后有明显集落形成,7d后呈梭行细胞,出现典型线样排列结构。经诱导培养后,内皮细胞表型CD31阳性率为(70.03±10.27)%。免疫组化染色证实了内皮特异性成分ecNOS和flk-1/KDR蛋白水平的表达。而CD34-细胞单独培养,少部分细胞贴壁,呈现出不规则形态。结论MACS法分离脐血CD34 细胞,体外诱导扩增和分化后贴壁细胞具有内皮细胞形态,通过流式细胞仪和免疫组化验证了贴壁细胞中大部分细胞具有内皮系标志物表达。     

脐血CD34+细胞向内皮细胞定向诱导分化的实验研究

目的探讨人脐血CD34+细胞体外分离、纯化、诱导扩增和分化为内皮细胞的可行性,并检测其表型.方法采集新鲜脐血经抗凝处理及无菌包装,Ficoll密度梯度离心法得单个核细胞,磁珠分选方法(MACS)分离出CD34+单个核细胞,M-199培养基中诱导分化,细胞形态学观察CD34+和CD34-细胞生长情况,流式细胞仪检测内皮细胞CD31表型,免疫组化验证蛋白水平表达.结果细胞形态学观察发现,刚分离的CD34+ 和CD34-单个核细胞呈圆形,形态小.CD34+细胞培养3 d后有明显集落形成,7 d后呈梭行细胞,出现典型线样排列结构.经诱导培养后,内皮细胞表型CD31阳性率为(70.03±10.27)%.免疫组化染色证实了内皮特异性成分ecNOS和flk-1/KDR蛋白水平的表达.而CD34-细胞单独培养,少部分细胞贴壁,呈现出不规则形态.结论 MACS法分离脐血CD34+细胞,体外诱导扩增和分化后贴壁细胞具有内皮细胞形态,通过流式细胞仪和免疫组化验证了贴壁细胞中大部分细胞具有内皮系标志物表达.     

脐血CD34~+细胞体外短期培养扩增研究

为寻找更有效的体外扩增脐血CD34 + 细胞的造血细胞因子组合 ,采集健康产妇脐带血 ,用免疫磁珠法分选CD34 + 细胞。采用SCF、FLT3 L、TPO和IL 34种具有早期作用的细胞因子的不同组合进行脐血CD34 + 细胞短期无血清液体培养 ,观察培养前后有核细胞、CD34 + 细胞、CD34 + /CD38- 细胞、CFU GEMM、CFU GM和BFU E数量的变化。结果在 3种不同的细胞因子组合中 ,同时应用SCF、FLT3 L、TPO和IL 34种细胞因子培养 7d的扩增效果最好。突出的发现是在这种条件下CD34 + /CD38- 细胞亚群达到平均 1 97.9倍的扩增效果。提示 :SCF、FLT3 L、TPO和IL 34种细胞因子是脐血CD34 + 细胞体外扩增理想的细胞因子组合     

脐血CD34+细胞体外诱导分化为树突状细胞及其扩增

目的 探索脐血CD34+细胞体外诱导分化为树突状细胞及其扩增、培养大量树突状细胞(DCs)的方法.方法 Ficoll分离脐血单个核细胞,免疫微磁珠法分离纯化CD34+细胞,以rhIL-4、GM-CSF、rhSCF、rhFlt-3 Ligand、TGF-β1及TNF-α体外诱导培养14 d,进行形态学观察、表型检测及上清液IL-12测定.结果 体外培养14 d后,细胞呈现典型的成熟DCs形态学及表型特征:胞体表面粗糙,可见大量突起,高水平表达CD1a、CD11c、CD40、CD80、CD83、CD86和MHCⅡ类分子;同时,IL-12浓度随着培养时间的增加而升高,且在加入TNF-α刺激成熟后,IL-12浓度较未成熟时显著升高(P＜0.05).结论 体外联合运用rhIL-4、GM-CSF、rhSCF、rhFlt-3Ligand、TGF-β1、TNF-α, 能够成功诱导脐血CD34+细胞分化为大量活力好的DCs.     

脐血CD34+细胞体外扩增和分化调节的研究

目的：探讨脐血体外扩增的最佳造血生长因子组合及时间。方法：脐血CD34^ 细胞培养于含不同造血生长因子组合的无血清培养液。对其有核细胞数（NC）、表面抗原以及集落形成能力进行监测。结果：同对照组相比，扩增组的NC和CD34^ 细胞均有不同程度的扩增，扩增高峰分别为第10d和第6d；其中含SCF、IL-3、IL-6、TPO、Flt3-L、G-CSF及Epo的E组扩增的细胞数最多。第6d，CD34^ 细胞、NC及CFC总数分别扩增了9.90、101.80和31.18倍，第10d分别累积扩增了3.56、357.42和73.11倍。而D组（含SCF、IL-3、IL-6、TPO及Flt3-L）扩增的细胞中CD34^ 及CD34^ CD38^-含量最高。提示E组细胞分化较D组明显。结论：体外扩增可望解决单份脐血造血干/祖细胞数量不足的问题，但扩增中应注意其过度分化，扩增时间以6-10d为宜。     

脐血CD34+细胞体外扩增和分化调节的研究

目的探讨脐血体外扩增的最佳造血生长因子组合及时间.方法脐血CD34+细胞培养于含不同造血生长因子组合的无血清培养液.对其有核细胞数(NC)、表面抗原以及集落形成能力进行监测.结果同对照组相比,扩增组的NC和CD34+细胞均有不同程度的扩增,扩增高峰分别为第10d和第6d;其中含SCF、IL-3、IL-6、TPO、Flt3-L、G-CSF及Epo的E组扩增的细胞数最多.第6d,CD34+细胞、NC及CFC总数分别扩增了9.90、101.80和31.18倍,第10d分别累积扩增了3.56、357.42和73.11倍.而D组(含SCF、IL-3、IL-6、TPO及Flt3-L)扩增的细胞中CD34+及CD34+CD38-含量最高.提示E组细胞分化较D组明显.结论体外扩增可望解决单份脐血造血干/祖细胞数量不足的问题,但扩增中应注意其过度分化,扩增时间以6～10d为宜.     

人脐血CD34+细胞体外诱导分化为树突状细胞及其扩增

目的 采用脐血CD34+细胞在rhGM-CSF、rhTNF-α诱导下体外分化扩增为成熟树突状细胞.方法 应用CD34+干细胞分选试剂盒以及免疫磁珠法从脐血中分离CD34+细胞,用rhGM-CSF、rhTNF-α联合诱导分化发育14 d,成为成熟DC,观察细胞形态及检测CD83分子表达.结果 50 ml脐带血可分离出CD34+细胞约1.1×106,在rhGM-CSF、rhTNF-α诱导下CD34+干细胞培养2周,约扩增10～20倍.CD34+干细胞培养第3 d开始出现集落,第8～9天集落最大,CD34+干细胞分化发育为有树突状突起的成熟DC,表面分子CD83阳性率为81.7%.结论 体外联合运用rhGM-CSF、rhTNF-α,能够成功诱导脐血CD34+细胞分化为大量成熟的DCs.     

人参总皂苷体外定向诱导CD34+细胞分化为粒系血细胞的研究

目的研究人参总皂苷(TSPG)协同造血生长因子对CD34 细胞体外定向诱导分化为粒系血细胞的影响。方法应用阴性磁性分选策略,以StemsepTM系统从正常人骨髓细胞中分离CD34 造血干/祖细胞(HSC/HPC),通过甲基纤维素半固体培养法检测TSPG诱导CD34 HSC/HPC向粒系祖细胞集落(CFU-GM)增殖与分化的能力;在SCF IL-3 GM-CSF G-CSF(SIGG)液体培养体系中加入不同剂量的TSPG,检测对CD34 HSC/HPC增殖形成CFU-GM的影响以及CD33 细胞比例的变化。结果TSPG(10～50μg/mL)均能提高CD34 细胞形成CFU-GM的集落产率,以TSPG20μg/mL效果最为明显;不同质量浓度的TSPG协同造血生长因子在液体培养体系中诱导CD34 细胞2周,观察粒系血细胞的分化,TSPG10～70μg/mL均可不同程度地提高细胞总数、CFU-GM扩增倍数及CD33 细胞比例,TSPG20μg/mL是液体培养诱导CD34 细胞向粒系分化的最佳质量浓度。结论TSPG协同造血生长因子能促进CD34 细胞定向诱导分化为粒系血细胞。     

脐血CD34+细胞体外扩增的实验研究

目的：探讨用体外扩增脐血造血干细胞进行成人脐血移植的可能性。方法：从１５份新鲜脐血标本中纯化ＣＤ３４＋细胞，将其接种于含２０％的胎牛血清（ＦＢＳ）的ＩＭＤＭ培养基中，分别加入由Ｆｌｔ３配体（Ｆｌｔ３　ｌｉｇａｎｄ，ＦＬ）、干细胞因子（ｓｔｅｍ　ｃｅｌｌ　ｆａｃｔｏｒ，　ＳＣＦ）、血小板生成素（ｔｈｒｏｍｂｏｐｏｉｅｔｉｎ，　ＴＰＯ）及白细胞介素６（ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ１，ＩＬ－６）组成的三组细胞因子组合（Ａ组：ＦＬ＋ＴＰＯ；Ｂ组：ＦＬ＋ＳＣＦ＋ＴＰＯ；Ｃ组：ＦＬ＋ＳＣＦ＋ＴＰＯ＋ＩＬ－６）培养扩增１４ｄ。结果：①各组对各阶段造血细胞均有扩增效果，其中Ｂ、Ｃ组优于Ａ组（Ｐ＜０．０５，Ｐ＜０．０１）；②　经体外１４ｄ的培养扩增后，单份脐血可产生足够量的造血干细胞用于成人脐血移植。结论：脐血ＣＤ３４＋细胞经体外扩增可用于成人脐血移植。     

脐血CD34+细胞的体外扩增研究

目的:探讨造血生长因子不同组合方式对脐血CD34+造血干/祖细胞(HSC/HPC)的扩增作用.方法:应用StemsepTM阴性分选系统分离纯化CD34+细胞,在体外液体培养体系中经不同组合细胞因子进行扩增1～3w.结果:FL+Tpo+SCF+IL-3+GM-CSF+G-CSF+Epo组合的扩增效果最佳,可分别扩增细胞总数、造血祖细胞集落总数(CFCs)、CD34+细胞达1627.57±52.93、56.78±8.13、41.09±4.11倍.FL和Tpo具有明显的协同扩增早期祖细胞的作用,CFCs和CD34+细胞在1～2w维持在较高水平,以后逐渐衰退.结论:合理的细胞因子组合在大量扩增造血细胞的同时也有助于早期造血祖细胞的自我更新,把握适宜的扩增时机,将有助于扩增细胞在质和量上满足移植和基因治疗等的要求.     

骨髓增生异常综合征中骨髓CD34~+、CD34~-细胞凋亡和增殖的实验研究

目的:分析骨髓增生异常综合征(MDS)患者骨髓CD34+细胞和CD34-细胞凋亡和增殖情况,从该角度探讨MDS的发病机制。方法:流式细胞术分析20例高危MDS、20例低危MDS患者及10例正常对照者骨髓CD34+细胞的比例,CD34+细胞和CD34-细胞凋亡、增殖的百分率,计算各组中的凋亡/增殖(A/P)比。结果:(1)MDS患者CD34+细胞的比例明显高于对照组,其中高危组CD34+细胞的比例明显高于低危组(P<0.05),而低危组与对照组比较无显著差异;(2)CD34+,CD34-细胞的凋亡率在MDS低危组中均为最高,明显高于MDS高危组和对照组,在低危组中,CD34-细胞的凋亡率(80.36±1.82)%明显高于CD34+细胞(54.75±2.18)%(P<0.05),而在高危组中,CD34+,CD34-细胞的凋亡率无显著差异;(3)CD34+细胞的增殖率在MDS高危组中最高,明显高于低危组和对照组,而CD34-细胞的增殖率在MDS高危和低危组间无显著差异,在高危组中,CD34+细胞的增殖率(50.67±3.37)%明显高于CD34-细胞的(30.99±1.96)%(P<0.05);(4)无论CD34+,CD34-细胞的A/P值在MDS低危组中均明显高于高危组和正常对照组,而在MDS各亚组中,CD34-细胞的A/P值明显高于CD34+的A/P值(P<0.05)。结论:CD34+细胞百分率随MDS危险度增加而逐渐增加,在低危组中以CD34-细胞的凋亡占主导,随着病情进展,在高危组中则以CD34+细胞的增殖占主导,提示异常的凋亡和增殖在MDS的发生和发展中起重要作用。     

脐血CD34＋细胞向内皮细胞诱导分化的体外研究

目的：探讨从脐血中分离CD34＋细胞,并诱导、鉴定其分化为内皮细胞的方法。方法：羟乙基淀粉沉降、密度梯度离心两步法制备脐血单个核细胞,免疫磁珠分选法（MACS）获得CD34＋细胞,在含有细胞因子的M199培养基中诱导。观察细胞形态变化,摄取Dit标记的乙酰化低密度脂蛋白（Dil—AcLDL）的情况,流式鉴定细胞表面标志。结果：分选CD34＋细胞纯度在91％以上,培养3d有明显集落形成及部分细胞贴壁,14d贴壁细胞呈条索状,逐渐增多后呈铺路石样改变。流式检测贴壁细胞表达血管内皮细胞特异性标志物CD144、vWF、CD31、CD34,而白细胞共同抗原CD45为阴性表达,与成熟的脐静脉内皮细胞表达率相近。免疫荧光发现贴壁细胞呈现红色荧光,提示细胞摄取Dil—AcLDL,证明CD34＋细胞分化为有功能的内皮细胞。结论：脐血中存在CD34＋细胞且用两步法和MACS可获得高纯度CD34＋细胞,在特定条件下可分化为内皮细胞。     

肾母细胞瘤基因衍生肽诱导细胞毒性T淋巴细胞对白血病患者骨髓CD34+细胞的体外杀伤效应

目的 探讨肾母细胞瘤基因(WT1)衍生肽负载树突状细胞(DC)诱导细胞毒性T淋巴细胞(CTL)对白血病CD34+细胞的体外清除效应.方法 合成一段针对HLA-A*0201锚位的WT19聚肽,体外负载来源于HLA-A*0201*健康人的DC后,诱导产生WT1肽特异性CTL(A组),以噻唑盐(MTT)比色法观察其对WT1表达阳性白血病患者(HLA-A* 0201+者3例,HLA-A*0201-者3例)骨髓CD34+细胞、健康人(HLA-A*0201+者2例,HLA-A*0201-者1例)外周血CD34+细胞和白血病NB4、K562及U937细胞株的体外杀伤效应,粒细胞-巨噬细胞系集落形成试验观察其对白血病患者骨髓CD34+细胞和健康人外周血CD34+细胞粒细胞-巨噬细胞系集落形成单位(CFU-GM)形成的影响.设立单独DC诱导CTL(B组)和IL-2诱导T细胞(C组)作为对照.结果 在效靶比为20:1时,A组CTL对3例HLA-A*0201+白血病患者骨髓CD34+细胞和NB4细胞的杀伤活性(分别为55.3%±2.8%,67.1%±3.2%、49.4%±3.8%和55.0%±3.7%)明显高于对3例HLA-A*0201-白血病患者骨髓CD34+细胞、健康人外周血CD34+细胞及K562、U937细胞的杀伤活性(均<20%),并明显高于B组和C组CTL(均P＜0.01).2例HLA-A*0201+白血病患者骨髓CD34+细胞经A组CTL处理后CFU-GM集落相对形成率分别为17.8%±4.0%和20.8%±3.4%,明显低于经B组CTL处理后(分别为88.9%±3.4%和91.8%±5.7%,均P＜0.01);HLA-A*0201-白血病患者骨髓CD34+细胞、健康人外周血CD34+细胞经A组和B组CTL处理后CFU-GM集落相对形成率差异尤统计学意义.结论 WT1肽特异性CTL能够以HLA-1类抗原限制方式杀伤高表达WT1基因的白血病CD34+细胞,且能特异性抑制其CFU-GM集落形成,WT1基因的表达产物可以作为清除白血病CD34+细胞靶点.     

脐血CD34+细胞体外诱导分化为树突状细胞及其扩增

目的探索脐血CD34 细胞体外诱导分化为树突状细胞及其扩增、培养大量树突状细胞(DCs)的方法。方法Ficoll分离脐血单个核细胞,免疫微磁珠法分离纯化CD34 细胞,以rhIL-4、GM-CSF、rhSCF、rhFlt-3Ligand、TGF-β1及TNF-α体外诱导培养14d,进行形态学观察、表型检测及上清液IL-12测定。结果体外培养14d后,细胞呈现典型的成熟DCs形态学及表型特征:胞体表面粗糙,可见大量突起,高水平表达CD1a、CD11c、CD40、CD80、CD83、CD86和MHCⅡ类分子;同时,IL-12浓度随着培养时间的增加而升高,且在加入TNF-α刺激成熟后,IL-12浓度较未成熟时显著升高(P<0.05)。结论体外联合运用rhIL-4、GM-CSF、rhSCF、rhFlt-3Ligand、TGF-β1、TNF-α,能够成功诱导脐血CD34 细胞分化为大量活力好的DCs。     

多种细胞因子组合对脐血干/祖细胞体外扩增的影响

目的　探讨在体外培养液中不同细胞因子组合对脐血 CD34+ 细胞的扩增作用以及扩增后的 CD34+ 细胞的造血功能。方法　用 FL、SCF、TPO、IL - 3、TL - 6组合成不同的实验组 ,对脐血中分离纯化的 CD34+ 细胞经 6d的短期体外扩增 ,扩增后经流式细胞仪分析 ,L TC- IC、祖细胞集落群计数 ,从而求得较好的细胞因子组合组。结果CD34+ 细胞扩增倍数为 3 .1～ 8.6倍 ,16份脐血 CD34+ 细胞数达到 10× 10 6 以上的细胞总数 ;扩增的 CD34+ 细胞再造血功能与原始 CD34+ 细胞无显著差异。FL是扩增组合中不可缺少的细胞因子 ,同时还证实 TPO与其他细胞因子组合有扩增 CD34+ 细胞的作用 ,但单独使用 TPO稍长时间会使 CD34+ 细胞过多向巨核细胞分化。结论　 FST3 6细胞因子组合能使部份单位体积的脐血 CD34+细胞体外扩增达一定数量 ,为干细胞移植于成人提供了一定的实验依据与方法     

体外扩增对脐血CD34+细胞粘附特性和趋化功能的影响

目的 探讨在体外扩增过程中,脐血(UCB)干／祖细胞(HSPC)的粘附特性和趋化功能的变化。方法 从新鲜UCB标本中纯化的CD34^ 细胞接种于无血清无基质悬浮扩增体系,分别于培养7、10和14d从扩增细胞中再次纯化CD34^ 细胞,比较扩增前后CD34^ 细胞的几种与归巢密切相关的功能特性,包括归巢相关粘附分子(CAM)的表达,粘附功能和趋化功能。结果 (1)表达各种粘附分子的CD34^ 细胞亚群的数量在扩增过程中明显增加(15～72倍),而且扩增后CD34^ 细胞表面粘附分子CD44、CDlla、CD49e和CD49d的表达与原代CD34^ 细胞持平或升高,CD62L、CD54和CD31的表达则有不同程度的下调;(2)在前10d的扩增中,CD34^ 细胞与FN间的自发粘附率和SDF-1诱导粘附率均呈上升趋势,0、7和10d分别为28％和63％、60%,和70％、63％,和90%,;(3)扩增1周后,CD34^ 细胞的体外迁移能力无明显变化。结论 所建立的短期培养体系可以支持扩增1周的UCB HSPC保持原有粘附和趋化功能,而继续扩增则可能在某种程度上不利于细胞这些能力的保持。     

人脐血CD34+细胞体外DEXTER基质细胞培养的动态观察

目的 动态观察人脐血CD34^ 细胞DEXTER基质细胞培养的情况。方法 应用MACS磁珠分离系统分离脐带血CD34^ 细胞，按照DEXTER法行脐血基质细胞培养，观察不同时间、不同细胞因子组合基质细胞的生长状态。结果 SCF及SCF BFGF组合可促进基质细胞集落的生成，脐血基质细胞在生长情况、组成成分、细胞形态等方面与骨髓基质细胞有不同的生物学特性。结论 脐血CD34^ 细胞在生长因子的辅助下能促进基质细胞集落的形成，有望成为新的基质细胞来源。     

胚胎与成人骨髓CD34~+细胞RUNX1相关基因及Notch信号通路的比较研究

目的 了解引产儿胚胎与成人骨髓CD34+细胞生物学活性,寻找新的造血干细胞来源RUNX1相关基因和Notch信号通路差异.方法 RT-PCR检测引产儿胚胎和成人骨髓CD34+细胞RUNX1、Hes-1、SLC9A3R1、Notch1、Notch2、HLA-C、PDCD1、PKC-βI的mRNA表达水平.结果 引产儿胚胎骨髓CD34+细胞RUNX1、Hes-1、SLC9A3R1、Notch1、Notch2、HLA-C、PDCD1和PKC-βI的mRNA表达水平与成人组比较差异均无统计学意义(P>0.05).结论 引产儿胚胎骨髓CD34+细胞具有与成人骨髓CD34+细胞相似的生物学活性,可以作为实验中正常对照使用,满足实验需要.