限制性片段长度多态性分析方法应用于中国麻疹野病毒基因型别的鉴定

目的　建立和应用麻疹野病毒基因型快速诊断方法 ,及时监测麻疹流行株基因型动态 ,尽早发现异型输入病例。方法　应用一种适用于我国现流行麻疹野病毒的基因型别筛查、定型的分析方法 ,即逆转录 聚合酶链反应 限制性片段长度多态性分析方法 (RT PCR RFLP) ,对吉林省 2 0 0 1～ 2 0 0 3年分离到、经中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所国家麻疹实验室用脱氧核糖核酸 (DNA)序列分析证实为H1基因型的 9株野病毒进行验证。结果　 9株麻疹病毒分离阳性株的RT PCR-RFLP基因分型结果与核酸序列分析结果完全一致 ,均为H1基因型。并应用该方法对吉林省 2 0 0 3年分离的 2株麻疹病毒进行基因型别鉴定 ,亦为H1基因型。同时对 2 0 0 1～ 2 0 0 3年的 46份麻疹病例的临床标本 ,应用新建立的RT-PCR-RFLP方法直接进行麻疹病毒核糖核酸 (RNA)提取、RT-PCR反应及基因型别鉴定。 46例临床标本经直接RT-PCR扩增后的 31例RT-PCR阳性产物 ,经RFLP法酶切、电泳结果均为H1基因型。结论　RFLP分析方法是一种快速、简便又经济实用的中国麻疹野病毒基因定型筛查方法 ,对快速掌握麻疹病毒基因型流行动态及地理分布 ,以及麻疹野病毒的输入、变异情况 ,具有广泛应用的意义和价值     

我国新型恙虫病立克次体目标基因的PCR／RFLR和序列分析研究

为查明江苏恙虫病立克次体（Ｒｔ）流行株目标基因序列特征，构建Ｒｔｔｓａ５６ｋＤａ群、型特异引物，用ＰＣＲ技术进行检测、分型，将群引物扩增产物进行ＲＦＬＰ分析和热循环自动双向测序法进序列测定。结果所构建的Ｒｔｔｓａ５６ｋＤａ的群、型引物具有Ｒｔ的特异性；江苏地区Ｒｔ流行株型别与日本Ｋａｗａｓａｋｉ型相似；群引物扩增产物经ＲＦＬＰ分析，证明该片段ＤＮＡ无ＨｈａⅠ酶切位点；碱基序列测定结果与Ｋａｗａｓａｋｉ型相应ＤＮＡ片段的碱基序列同源性为９６．８７％，而与其它５株Ｒｔ同源性均少于５２％；该片段的ＨｈａⅠ酶切位点ＧＣＧＣ变异为ＧＴＧＣ结构。结果表明江苏地区Ｒｔ株型属于日本Ｋａｗａｓａｋｉ型，但有遗传差异，是我国新发现的株型     

2006～2009年广西麻疹野病毒基因型分析

目的了解2006~2009年广西麻疹野病毒基因特征,为控制和消除麻疹提供依据。方法采集2006~2009年广西麻疹患者的咽拭子标本33份,用EB病毒转化的狨猴淋巴母细胞(B95a)分离到麻疹病毒13株,通过逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR),从分离到的麻疹病毒株中扩增出核蛋白基因羧基末端450个核苷酸片段,再对扩增产物进行核苷酸序列测定和基因分型。结果 13株麻疹病毒均属H1基因型H1a亚型。结论 2006~2009年广西流行的麻疹野病毒基因型均为H1基因型,H1a为流行优势株。     

湖北省不同地区汉坦病毒的基因型研究

目的 对分离自湖北省不同地区的30株汉坦病毒(HV)RNAM片段进行分析,以了解湖北省不同地区HV的基因特征及基因组功能.方法 参考HV的基因文库软件设计M片段G₁区型特异性引物,用适合于湖北省HV分型的逆转录-半巢式聚合酶链反应(RT-heminestedPCR),并结合限制性内切酶酶切图谱分析,对湖北省不同地区分离的30株HV进行分型、酶切.结果 分离于湖北省不同地区的30株HV的分型结果为汉滩型21株、汉城型9株.21株汉滩型靶基因被HinfⅠ、HaeⅢ消化的图形与标准株76/118株的图形一致,未见与H-114株相似的图形,其中武汉和洪湖各有l株靶基因HaeⅢ消化只见1个片段;应城、江夏、黄陂和麻城各有1株靶基因HinfⅠ消化有3个片段.另外21株汉滩型靶基因除前述的应城毒株外均被HincⅡ消化.9株汉城型靶基因不能被HaeⅢ消化;HinfⅠ消化只见2个片段,而EcoRⅠ消化却见2个片段,与R22株消化的图形不一致.结论 湖北省HFRS流行为混合疫区;汉城型M片段基因稳定,汉滩型M片段基因不稳定,且在湖北地区具有一定的地理聚族性.     

合肥市71例麻疹病例麻疹病毒基因型分析

摘要:目的 掌握合肥市2012-2013年71例麻疹病例麻疹病毒流行特征及其基因分型。方法 应用病原分子学逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR),检测麻疹IgM抗体阳性麻疹病例咽拭子样本。扩增麻疹病毒N基因COOH末端的634个核苷酸片段,扩增产物纯化后测序,基因分析采用 MEGA 5.03软件。结果 2012、2013年麻疹病例麻疹病毒基因分析分别为8、63例,合计71例,RT-PCR扩增阳性麻疹毒株分别为2、23株,合计25株,研究分析均为H1a基因亚型。基因序列分析显示25株麻疹毒株分为2条传播主链,核苷酸平均变异为0%~2.4%(核苷酸差异0~11 bp)。25株麻疹毒株与Chin9322/H1a参考株核苷酸变异0.4%~1.6%(核苷酸差异2~6 bp),与S191疫苗株核苷酸变异7.6%~8.7%(核苷酸差异34~39 bp)。结论 H1a基因亚型是合肥市近年来麻疹传播流行优势毒株,毒株之间遗传变异程度小同源性高。     

北京丰台区2013年春季流行麻疹野病毒的基因型分析

目的了解丰台区流行的麻疹野病毒的基因特征,为控制和消除麻疹提供依据。方法采集2013年春季疑似麻疹爆发和散发患者咽拭子标本分离病毒,通过逆转录-聚合酶链反应（RT—PCR）,从分离到的麻疹病毒中扩增出核蛋白（nucleoprotein,N）基因c末端634个核苷酸片段,再对扩增产物进行核苷酸序列测定和分析,并以C末端450个核苷酸片段构建基因亲缘关系树,进行遗传距离分析。结果共分离麻疹病毒39株,测序后为H1基因型（28株）和D8基因型（11株）。结论丰台区2013年春季麻疹流行株仍属于H基因组,Hl基因型,Hla亚型。此外北京市丰台区首次发现D8基因型麻疹野病毒。     

一起麻疹爆发的病毒分离及基因型鉴定

目的了解宁夏回族自治区流行麻疹野病毒的基因型。方法2004年5月,青铜峡市某小学发生麻疹爆发,收集了3份病人急性期咽拭子标本和11份血标本,分离咽拭子中的麻疹病毒,使用逆转录-聚合酶链反应检测分离到的麻疹病毒核蛋白(N)基因,对扩增后的N基因片段进行核苷酸序列测定,并分析鉴定基因型。结果宁夏回族自治区首次分离到2株麻疹病毒;酶联免疫吸附试验捕捉法检测病人血清的IgM抗体,阳性率为100%;序列分析结果表明,这2株麻疹病毒均属于H1基因型。结论2004年引起青铜峡市麻疹流行的病毒为H1基因型。     

中国4城市慢性乙型肝炎病毒感染者中B基因亚型分布

目的了解北京、石家庄、温州和深圳4城市慢性乙型肝炎（乙肝）病毒（HBV）感染者中B基因亚型（Ba和Bj）的分布情况。方法应用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性分析（PCR-RFLP），对北京（18例）、石家庄（22例）、温州（34例）、深圳（27例）市101例乙肝患者血清标本，经多对型特异性引物巢式PCR鉴定为B基因型慢性HBV感染者的血清标本进行B基因亚型分析，并对部分血清标本以PCR产物直接测序法确定其亚型，以验证PCR-RFLP的准确性。结果经PCR-RFLP分析101例均为Ba亚型，未发现Bj亚型，其中30例经测序分析也证实为Ba亚型。结论4城市的HBV／B主要为Ba亚型。     

吉林省乙型肝炎病毒基因型分型及临床研究

目的了解吉林省乙型肝炎病毒(HBV)的基因型流行及分布情况,探讨HBV基因型与其预防治疗的临床意义。方法采用多对型特异性引物套式聚合酶链反应(nest-PCR)对吉林省194份HBV阳性血清进行分型,并研究HBV与预防和治疗的关系。结果在194例HBV血清阳性标本中,B型16例,C型172例,B、C混合型6例,未发现其它型别的病毒。结论在吉林省HBV的基因型主要为C型,B、C混合型也占了一定比例。C型与肝硬化和肝癌关系密切,混合型与慢性肝炎关系密切。     

中国1998～2004年G9型轮状病毒分子流行病学研究

目的研究中国流行的轮状病毒(Rotavirus,RV)G9型毒株的分子流行病学特征。方法在中国9个地区收集5岁以下腹泻患儿粪便标本,应用酶联免疫吸附试验(ELISA)方法检测RV,对阳性标本用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)分型,选择G9型毒株进行VP7基因全长克隆测序和分子流行病学分析。结果1998~2004年共检测出RV1 268份,其中45份为G9型(3.5%),昆明最多(34/45),其次是兰州(8/45)、长春(2/45)、卢龙(1/45),北京、郑州、杭州、福州、广州未检测到G9型毒株。对35份G9型标本进行P分型鉴定:15份为P[8]型,12份为P[6]型,5份为P[4]型,1份为P[8 4]混合型,2份未能分型。中国1998~2000年以P[8]G9毒株流行为主,而2001年后以P[6]G9毒株为主。22株G9型病毒VP7基因序列比对结果表明,中国流行的G9型毒株彼此同源性高,同属G9第3亚型。结论中国流行的RV G9型株与世界各地的流行株同源性较高,国内传播范围扩大的趋势值得关注。     

湘南地区梅毒螺旋体基因分型的初步研究

目的 了解湘南悔毒螺旋体（Treponema pallidum.TP）的分子亚型的分布，为梅毒分子流行病学研究提供依据。方法 收集湘南地区疑似硬下疳的标本52例，经TP polA PCR筛选后，阳性者用PCR扩增各标本中TP的arp和tpr基因．酶切tpr基因扩增产物．分析各TP菌株arp基因长度和tpr基因的限制性片段长度多态性（RFLP），进行分型：结果 TP polAPCR阳性者43例，可用于分型者38例，分为10个亚型，其中14d亚型为16例，其它亚型包括10d（2），12a（2），12g（1），13d（4），14a（3），14b（2），14f（2），15d（5），16d（1）。结论 湘南地区存在TP的多亚型，以14d亚型为主（占42．1％）。     

1995～1997年中国部分地区麻疹病毒流行株基因型分析

本文报道以反转录二步多聚酶链反应方法 (RT -PCR)直接测定麻疹病人唾液、尿液标本中的麻疹病毒 (MV)血凝基因 (H)、核衣壳基因 (N)。以RT -PCR产物纯化后进行MV 4 50ntH、2 82ntN基因核苷酸片段测序分析 ,测序结果一致表明 ,1995～ 1997年期间中国部分地区MV流行株存在两种基因型。其中一种基因型只发现 1株 ,与EDw54株相同 ,另一种基因型占流行株的绝大多数 (称新基因型 ) ,与其它国家以前报道的MV流行株基因型的N基因最大差异为 15.4 %与EDw54、疫苗株相差8.8% ;H基因最大差异是 10 .8%。     

乙型肝炎病毒C基因启动子变异检测方法的建立

目的 建立乙型肝炎病毒（HBV）C基因启动子（BCP）变异的限制性片断长度多态性（RFLP）检测方法,更好地了解BCP变异的发生与乙型病毒性肝炎（乙肝）的病情、预后以及治疗的影响。方法 结合引物设计软件Primer Premier5.0,选定保守区域,设计了2对最佳引物,建立了HBV BCP变异检测PCR-RFLP的实验方法。结果 对34例不同乙肝患者进行BCP变异检测发现：肝硬化（LC）组和慢性乙型肝炎（CHB）组中发生变异的例数明显高于无症状感染者（Asl）（χ2值分别为6.39和3.98,P〈0.05）。并且HBeAg（-）组发生变异的例数明显高于HBeAg（＋）组（χ2=4.60,P〈0.05）,结论该方法操作简便、敏感度与特异性高、结果 可靠,并可用于较大范围调查该变异株的流行情况,为临床进一步诊断和治疗提供了科学的依据,同时对人们进一步了解HBVBCP变异的发病机制具有重要意义。