表皮生长因子受体拮抗剂靶向抑制胶质瘤细胞增殖的实验研究

目的探讨表皮生长因子受体(EGFR)拮抗剂-吉非替尼对人脑胶质瘤细胞的增殖抑制作用,为胶质瘤干细胞靶向治疗研究作准备。方法荧光定量PCR检测人脑胶质瘤细胞U251、GBM、SHG44及神经干细胞、脑肿瘤干细胞中EG-FR基因的表达。选择不同浓度的吉非替尼作用于U251细胞48h,MTT法检测药物对细胞的抑制率;流式细胞仪分析吉非替尼作用U251细胞后细胞增殖周期和细胞凋亡比率的变化。结果U251和脑肿瘤干细胞中都高表达EGFR。吉非替尼对U251细胞有明显的抑制作用,并呈浓度依赖性,IC50为19.0μM。以12.7μM、19.0μM和25.3μM吉非替尼处理U251细胞,随着药物浓度的增加,G0-G1期细胞比例和细胞凋亡率都逐渐升高。结论EGFR在U251细胞和脑肿瘤干细胞中都高表达,其拮抗剂吉非替尼对U251的细胞增殖有显著的抑制作用,为靶向治疗胶质瘤干细胞的研究开拓了思路。     

盐酸小檗碱诱导人脑胶质瘤细胞U251凋亡及其与HERG钾离子通道的表达相关研究

目的探讨盐酸小檗碱(ber)诱导人脑胶质瘤细胞U251凋亡及其与HERG钾离子通道表达相关性。方法使用不同浓度的ber处理人胶质瘤细胞U251,采用四甲基偶氮唑盐(MTT)染色法测定细胞增值率,Hoechst33258荧光染色法观察细胞形态学改变,流式细胞术测定细胞凋亡率,分别采用实时荧光定量PCR与Western Blotting检测HERG钾通道的RNA及蛋白的表达情况。结果 MTT法检测显示细胞抑制率呈浓度与时间依赖性,且随药物浓度增加而增大(P0.05),其24 h的半数抑制浓度(IC50))是(8.78±0.20)μmol/l;Hoechst33258荧光染色法检测表明处理组出现典型的凋亡特征;且流式细胞术检测结果表明随着ber的剂量增加U251细胞的早期凋亡率及晚期凋亡率逐渐增大(P0.05);RT-PCR与Western Bloting检测结果显示ber处理后U251细胞的HERG钾通道的RNA含量及蛋白的表达均上调,且随着药物浓度的增高而增高。结论在体外ber可诱导人胶质瘤细胞系U251的凋亡,并可能通过上调HERG蛋白的表达抑制U251增殖。     

I型γ-分泌酶抑制剂对恶性胶质瘤细胞株增殖及凋亡的影响

目的 探讨I型γ-分泌酶抑制剂(GSI-I)对U87、U251胶质瘤细胞的增殖抑制及诱导凋亡作用.方法 应用GSI-I作用于U87、U251胶质瘤细胞,通过MTT法观察GSI-I对上述两种细胞的增殖抑制作用,通过流式细胞仪检测GSI-I对该两种细胞细胞周期的影响及诱导凋亡的作用.结果RT-PCR及实时定量荧光RT-PCR结果显示,GSI-T可明显抑制胶质瘤细胞中Notch通路的活性,主要体现为Notch通路的靶基因Hes-1表达明显下调.MTT检测结果显示2.5μmol/L及以上浓度的GSI-I对U87及U251胶质瘤细胞有明显的增殖抑制作用.与对照组比较,差异有统计学意义(P<0.05),且该抑制作用呈剂量依赖型增加.流式细胞检测结果显示GSI-I主要使U87胶质瘤细胞的细胞周期阻滞在G1期而抑制细胞增殖,对于U251胶质瘤细胞则主要通过诱导凋亡来抑制增殖.结论 GSI-I可明显抑制U87及U251胶质瘤细胞的增殖并诱导凋亡,为恶性胶质瘤的临床治疗提供了理论参考依据.     

姜黄素通过Fas/FasL信号通路调控胶质瘤细胞增殖和凋亡

目的 探讨姜黄素通过Fas/FasL信号通路对胶质瘤细胞的增殖及凋亡产生影响.方法 以人胶质细胞瘤U87细胞为研究对象,采用细胞毒性试验检测姜黄素对U87胶质瘤细胞的细胞毒性作用.四甲基偶氮唑蓝(MTT)比色法、平板克隆实验(colony formation assay)观察姜黄素对胶质瘤增殖能力的影响;流式细胞术(FCM)及Caspase-3活性检测细胞凋亡;流式细胞术检测胶质瘤细胞周期;实时定量PCR、Western blot法检测细胞内Fas、FasL mRNA和蛋白的表达水平.结果 随着姜黄素浓度增加,胶质瘤细胞系的细胞毒性作用也增强(P＜0.05),24 h的IC50为14.28 μmol/L.流式细胞术检测姜黄素阻滞胶质瘤细胞周期于G舢压期.姜黄素作用胶质瘤后Fas和FasL在mRNA和蛋白表达水平上升(P＜0.05).姜黄索对胶质瘤细胞的增殖及细胞集落形成有抑制作用,并呈浓度和时间依赖性(P＜0.05).结论 姜黄素可能通过上调Fas/FasL通路抑制胶质瘤细胞增殖并促进凋亡.     

三氧化二砷对人脑SHG-44胶质瘤细胞作用的体外实验研究

目的 探讨三氧化二砷(As2O3)对人脑SHG-44胶质瘤细胞株的增殖抑制及诱导凋亡机制.方法 将不同浓度的As2O3与体外培养的SHG-44胶质瘤细胞相互作用后,采用MTT比色法检测As2O3对胶质瘤细胞的增殖抑制;倒置显微镜、荧光显微镜下观察吉姆萨及Hochest33258染色后细胞凋亡的形态学改变;流式细胞仪检测细胞凋亡及对SHG-44胶质瘤细胞周期影响.结果 MTT比色法检测到As2O3对SHG-44胶质瘤细胞增殖具有明显的抑制作用,并呈剂量依赖性和时间依赖性;倒置显微镜及荧光显微镜下可观察到给药组细胞生长密度低以及出现细胞凋亡的特征性改变;流式细胞仪检测到给药组细胞凋亡比率明显高于空白对照组(P＜0.05),并具有剂量依赖性及时间依赖性,同时将胶质瘤细胞阻滞在S期,抑制了细胞周期的进程.结论 As2O3对SHG-44胶质瘤细胞增殖具有明显的抑制作用、可诱导SHG-44胶质瘤细胞的凋亡,并抑制细胞周期进程.     

广西虎纹捕鸟蜘蛛毒素对胶质瘤细胞株U251增殖抑制作用的研究

目的 探讨广西虎纹捕鸟蜘蛛毒素对胶质瘤细胞株U251增殖抑制作用,并初步阐明其作用机制. 方法 以含10%胎牛血清RPMIl640培养液湿化孵育培养U251细胞.采用MTT法通过抑制率评价蜘蛛毒素对胶质瘤细胞的细胞毒作用,应用倒置相差显微镜及HE染色观察细胞形态及细胞核变化,采用TUNEL法检测蜘蛛毒素对U251细胞凋亡的影响. 结果 蜘蛛毒素能够抑制胶质瘤细胞株U251的增殖.其48 h及72 h的半量抑制浓度为82.60μg/mL和71.12μg/mL,且呈明显的量效及时效关系.HE染色观察到胶质瘤细胞核同缩、碎裂的凋亡征象.TUNEL法染色可见凋亡的胶质瘤细胞核染成棕黄色. 结论 广西虎纹捕鸟蜘蛛毒素能够抑制胶质瘤细胞U251增殖,其抑制作用可能是通过诱导胶质瘤细胞凋亡实现.     

白藜芦醇抑制U251人胶质瘤细胞增殖及其相关机制的探讨

目的 探讨白藜芦醇（Res）对U251胶质瘤细胞增殖和侵袭的抑制作用及其机制。方法 将不同浓度Res作用于U251胶质瘤细胞系，相差显微镜下观察其形态的变化，MTT法检测其对细胞生长增殖的抑制作用，流式细胞术（FCM）检测其对细胞周期的影响，用蛋白印迹（Western blot）检测Res处理前后U251细胞表皮生长因子受体（EGFR）、p53、p21、CDK4、CyclinD1、Bcl-2及caspase-3的表达，免疫组化分析MMP9、NFKB、P-AKT及AKT2的表达。结果 U251细胞经Res处理后，细胞形态发生一定变化，U251胶质瘤细胞的增殖被抑制，呈浓度和时间依赖性，细胞周期被阻滞在S期，Western blot检测显示EGFR、CyclinD1、CDK4、Bcl-2的表达降低，p21、p53、caspase-3蛋白表达升高，免疫组化检测显示MMP9，NFKB、P-AKT及AKT2的表达降低。结论 Res有可能通过调节EGFR及p53信号通路而抑制U251胶质瘤细胞的增殖和侵袭，诱导肿瘤细胞凋亡。     

PI3K抑制剂AZD8835对人脑胶质瘤细胞生物学功能的作用

目的探究PI3K抑制剂AZD8835体外对人脑胶质瘤细胞(U87细胞和U251细胞)生物学功能的作用。方法在U87细胞和U251细胞中加入不同浓度的AZD8835,应用CCK8法和EDU实验检测AZD8835对胶质瘤细胞增殖能力的影响,应用Transwell实验检测AZD8835对胶质瘤细胞侵袭能力的影响,应用流式细胞术检测AZD8835对胶质瘤细胞凋亡的影响。结果 AZD8835显著抑制胶质瘤细胞U87和U251增殖能力和侵袭能力,并诱导细胞凋亡,其对胶质瘤细胞生物学功能的影响呈明显剂量依赖性。结论 AZD8835能有效抑制胶质瘤细胞U87和U251增殖与侵袭,诱导细胞凋亡,从而发挥抗肿瘤作用。AZD8835可作为一种潜在提高胶质瘤疗效的辅助疗法。     

柯里拉京对胶质瘤U251细胞及其干细胞增殖活性影响初探

目的从胶质瘤U251细胞中分离肿瘤干细胞并探讨柯里拉京对胶质瘤U251细胞及其干细胞增殖活性和细胞周期的影响。方法使用免疫磁珠法联合无血清培养法分离肿瘤干细胞,50μg/ml柯里拉京分别干预U251细胞及U251干细胞12 h、24 h,CCK-8检测干预后细胞存活率改变,流式细胞术检测细胞周期变化,倒置显微镜观察干预前后细胞的形态学变化。结果胶质瘤U251细胞中含有少量CD133+细胞,在无血清培养基中呈悬浮、球形生长,具有典型的干细胞特性,在有血清培养基中能够自我分化为胶质瘤细胞;柯里拉京可明显抑制胶质瘤U251细胞及其干细胞的增殖,且对胶质瘤干细胞的抑制作用强于胶质瘤细胞(P0.05);柯里拉京可使胶质瘤U251细胞停留在G2/M期,使U251干细胞停留在S期(P0.05)。结论胶质瘤U251细胞中含有少量肿瘤干细胞;柯里拉京可抑制胶质瘤细胞及其干细胞的增殖,影响细胞周期,但其对U251细胞及其干细胞的细胞周期影响不一,机制可能存在差异。     

三氧化二砷对人胶质瘤U251细胞生长及端粒酶活性的影响

目的探讨三氧化二砷（As2O3）对人胶质瘤U251细胞的生长及端粒酶活性的影响。方法采用倒置显微镜和透射电镜观察As2O3处理后U251细胞形态变化;四甲基偶氮唑蓝比色法观察As2O3对U251细胞增殖的影响;流式细胞术检测细胞凋亡;端粒重序列扩增酶联免疫吸附实验（TRAP-ELISA）结合聚丙烯酰胺凝胶电泳（TRAP-PAGE）银染法检测As2O3处理后U251细胞端粒酶活性变化。结果倒置显微镜下观察到：As2O3处理后的U251细胞逐渐变圆、脱壁,细胞间接触变松,细胞质中颗粒增多,增殖变慢,细胞周围碎片增多;透射电镜下见较多典型凋亡细胞。1～8μmol/LAs2O3明显抑制U251细胞增殖,诱导其凋亡;并使端粒酶活性逐渐下降,该作用呈浓度和时间依赖性。结论 As2O3对人胶质瘤U251细胞株生长具有显著抑制作用,其机制可能与As2O3能够抑制U251细胞的端粒酶活性密切相关。     

RNA干扰PDGF-B基因对胶质瘤U251细胞凋亡和增殖的影响

目的利用RNA干扰(RNA interference,RNAi)技术特定沉默胶质瘤U251细胞株的血小板源生长因子-B(PDGF-B)基因,观察其对U251细胞株细胞凋亡和增殖的影响。方法利用脂质体将针对PDGF-B基因的siRNA转染进入U251细胞,利用实时荧光定量多聚核苷酸链式反应(RTPCR)检测PDGF-B基因表达;Western blot检测显示siRNA转染组PDGF-B蛋白表达,采用MTT法检测胶质瘤U251细胞的增殖,应用流式细胞计数观察抑制PDGF-B基因后胶质瘤U251细胞的凋亡情况。结果 RT-PCR检测PDGF-B基因表达明显下降;Western blot检测显示siRNA转染组PDGF-B蛋白表达明显抑制(抑制率60%),MTT结果显示siRNA转染组U251细胞增殖较对照组明显降低;流式细胞学检测提示降低PDGF-B在胶质瘤细胞的表达能抑制胶质瘤细胞的有丝分裂,促进细胞的凋亡。结论构建针对胶质瘤细胞PDGF-B的RNA干扰质粒并转染人胶质瘤U251细胞株后,可明显抑制U251细胞株PDGF的表达,对人胶质瘤U251细胞株有明显的生长抑制和促进凋亡作用。     

mTOR通路抑制剂依维莫司对不同胶质瘤细胞自噬作用的影响

目的 探讨mTOR抑制剂依维莫司对人脑胶质瘤细胞自噬作用的影响. 方法 体外培养胶质瘤细胞株87-MG、U251、SHG-44,给予不同浓度的依维莫司(0.1、0.5、1、10、20、100nmol/L)作用4-6d后用MTT法检测细胞的增殖并分析各细胞株的半数抑制浓度(IC50)值.Hoechst33342/PI荧光双染检测IC50的依维莫司作用48 h后细胞凋亡;单丹磺酰尸胺(MDC)荧光染色检测细胞自噬囊泡的形成;流式细胞术检测细胞周期的变化.Western blotting测定IC50的依维莫司作用24h后细胞磷酸化mTOR、p70S6K、4E-BP-1蛋白及非磷酸化mTOR、p70S6K蛋白的表达. 结果 MTT结果显示U87-MG、SHG-44、U251细胞的生长均受到明显抑制,IC50分别为0.1、0.5、10nmol/L;Hoechst 33342/PI荧光双染结果显示细胞没有发生明显的凋亡,可能为细胞白噬;MDC染色显示IC50的依维莫司作用后,细胞中荧光颗粒增加,荧光强度增强;流式细胞术检测显示3种细胞均有特异性的G0/G1期细胞阻滞;Western blotting检测显示随着依维莫司剂量的增加,胶质瘤细胞中磷酸化mTOR、p70S6K、4E-BP-1的表达水平均明显减少,非磷酸化4E-BP-1的表达水平减少,而非磷酸化p70S6K无明显变化. 结论 mTOR抑制剂依维莫司可以促进胶质瘤细胞的自噬,mTOR通路可能为潜在的新的胶质瘤的治疗靶点.     

Notch受体阻断剂MW167抑制U87胶质瘤细胞增殖的作用研究

目的 探讨Notch受体阻断剂MW167对胶质瘤细胞系U87增殖及凋亡的影响.方法 采用四甲基偶氮唑蓝(MTT)法检测MW167对体外培养的胶质瘤细胞系U87的增殖抑制作用.流式细胞仪AnnexinV-FITC和PI双染检测凋亡率.结果 MTT法检测显示MW167能明显抑制U87细胞的增殖并呈剂量依赖关系:流式细胞仪检测显示MW167可诱导U87胶质瘤细胞发生凋亡并呈剂量依赖关系.结论 MW167明显抑制U87胶质瘤细胞的增殖并诱导其发生凋亡,提示Noah受体阻断剂MW167对人脑胶质瘤的治疗具有潜在的临床应用价值.     

姜黄素诱导自噬抑制脑胶质瘤U87细胞增殖的研究

目的研究姜黄素对脑胶质瘤U87细胞增殖的抑制作用及机制。方法采用10、20、40、60、80μmol/L姜黄素分别处理U87细胞72h后,MTT法检测姜黄素对U87细胞增殖的影响。流式细胞术检测40μmol/L姜黄素处理前后U87细胞周期和凋亡变化。提取40μmol/L姜黄素处理前后不同时间点U87细胞总蛋白,Westernblot检测自噬相关蛋白LC3的表达。结果姜黄素呈剂量依赖性抑制U87细胞增殖(P0.05),半数抑制浓度(IC50)为42.44μmol/L。姜黄素诱导G2-M期细胞周期阻滞,实验组G2-M期细胞比例为(47.71±2.67)%,对照组为(17.96±0.88)%(P0.01);实验组细胞凋亡率为(3.93±0.82)%,对照组为(1.80±0.65)%,两组差异无统计学意义(P0.05)。姜黄素给药12、24、48h,LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值分别为(0.89±0.004)、(0.93±0.01)、(1.09±0.02),高于对照组(0.76±0.04)(P0.05);3-MA能减弱姜黄素对U87细胞增殖的抑制作用。结论姜黄素通过诱导自噬抑制脑胶质瘤U87细胞的增殖。     

华蟾素诱导人胶质瘤U87细胞凋亡的作用机制研究

目的 探讨华蟾素(Cinobufacini)对人胶质瘤U87细胞凋亡的促进作用及其机制。方法 将体外培养的胶质瘤U87细胞分为对照组、华蟾素组(依华蟾素水平不同分为3个亚组),MTT法测定细胞增殖率,流式细胞仪测定细胞凋亡率,Hoechst 33258核染色法观察细胞核凋亡,透射电镜观察细胞形态学的变化,Western blot法检测胶质瘤U87细胞内Cleaved Caspase-3及Cleaved Caspase-9的蛋白表达水平。结果 华蟾素对胶质瘤U87细胞增殖有抑制作用; 流式细胞仪及Hoechst 33258核染色法的检测显示,随着华蟾素作用浓度的递增,胶质瘤U87细胞凋亡率呈剂量依赖性递增; 华蟾素作用后可使Cleaved Caspase-3及Cleaved Caspase-9蛋白的表达水平升高。结论 华蟾素通过改变Cleaved Caspase-3及Cleaved Caspase-9蛋白的表达水平来抑制胶质瘤U87细胞增殖并促进其凋亡。     

隔蛋白7对胶质瘤细胞系U251细胞周期的影响

目的 检测SEVT7对胶质瘤细胞系U251的细胞周期、增殖、侵袭以及凋亡的影响.方法 流式细胞术分析转染SEPT7对细胞周期的影响,Western blot检测细胞周期因子表达变化,MTT法和Annexin V法评价SEFT7对U251细胞的增殖活性和凋亡的影响,Martrigel三维立体培养分析转染SEPT7后U251细胞侵袭能力的变化.结果 SEPT7使U251细胞G0/G1期阻滞,S期细胞比例(SPF)降低,增殖活性和侵袭能力明显受到抑制,并可诱发细胞凋亡.结论 SEPT7抑制U251细胞侵袭、增殖,促进凋亡.结果 提示,SEPT7是对胶质瘤具有抑制作用的基因.     

芹菜素对胶质瘤U87细胞的抗增殖作用及其机制研究

目的探讨芹菜素对人胶质瘤细胞的抑制作用及其分子学机制。方法人胶质瘤U87细胞给予0、20、40μmol/L芹菜素,通过MTT评价细胞增殖,流式细胞仪检测细胞凋亡。进一步U87细胞转染Bak1siRNA,24h后给予芹菜素刺激,体外观察细胞的增殖和细胞凋亡情况,Western blot检测Bak1表达。结果芹菜素可有效抑制胶质瘤细胞生长,诱导其凋亡。抑制Bak1表达后,芹菜素抑制胶质瘤增殖能力下降,未见细胞发生凋亡。结论芹菜素抑制胶质瘤细胞生长促进其凋亡是通过活化Bak1蛋白实现的。     

胶质瘤干细胞的结肠癌转移相关基因1表达与替莫唑胺耐药的相关性

目的探讨结肠癌转移相关基因1(MACC1)表达与胶质瘤干细胞对替莫唑胺(TMZ)耐药的相关性。方法采用实时定量荧光PCR和Western blot方法测定U87胶质瘤细胞来源的干细胞(GSCsU87)、U251胶质瘤细胞来源的干细胞(GSCs-U251)及U87和U251细胞的MACC1 mRNA、蛋白表达水平。通过实时定量荧光PCR和Western blot检测RNA干扰对MACC1的沉默效应。用流式细胞术和CCK-8方法测定MACC1沉默对TMZ诱导的细胞毒性和细胞凋亡的影响。结果胶质瘤干细胞GSCs-U87和GSCsU251中MACC1 mRNA和蛋白表达水平显著增高(均P 0.05)。shRNA-MACC1可以显着抑制MACC1表达(均P 0.05)。用不同浓度的TMZ处理后,与对照组GSCs-U87和GSCs-U251相比,TMZ对MACC1沉默的GSCs-U87和GSCs-U251细胞毒性显著增加,且MACC1沉默的胶质瘤干细胞的凋亡数增高。结论 MACC1基因的沉默可增强TMZ对胶质瘤细胞的凋亡和生长抑制作用,从而增加其对TMZ化疗的敏感性。     

F90对胶质母细胞瘤细胞的作用及机制研究

目的探讨表皮生长因子受体（EGFR）抑制剂F90对胶质母细胞瘤（GBM）细胞的抑制作用及其机制。方法采用MTT法检测F90对．GBM细胞的抑制作用，流式细胞术检测细胞凋亡和免疫印迹法（Western Blot）检测蛋白表达。结果F90能明显抑制U251和SHG-44细胞的生长，半数抑制浓度（IC50）分别为（5．8±113）和（5．1±1．2）μmol／L，且呈一定的剂量相关性。F90可以诱导U251细胞的凋亡，抑制U251细胞EGFR的磷酸化及其丝裂原活化的蛋白激酶（MAPK）通路下游信号的活化，下调Bcl-2蛋白的表达，上调P53蛋白的表达。结论F90能有效抑制某些GBM细胞在体外的生长，与Iressa作用强度相当，有可能成为一种新的治疗GBM的药物。     

CEP55在人胶质瘤组织的表达及对人胶质瘤U251细胞增殖和凋亡的影响

目的检测中心体相关蛋白55(CEP55)在人胶质瘤组织中的mRNA和蛋白表达水平;抑制人胶质瘤U251细胞中CEP55表达,观察其对U251细胞增殖、凋亡的影响。方法实时荧光定量聚合酶连锁反应(q-PCR)、蛋白质印记法(Western Blot)检测40例不同级别人胶质瘤组织和10例正常脑组织中CEP55的表达;RNAi抑制U251胶质瘤细胞CEP55基因表达,采用细胞增殖毒性检测试剂盒(CCK-8)和胸腺嘧啶核苷类似物(edu)检测CEP55对U251细胞增殖的影响,采用流式细胞仪分析CEP55对细胞凋亡的影响。结果 CEP55在40例人胶质瘤组织中表达显著高于正常脑组织(P0.01),但高级别胶质瘤CEP55的表达与低级别胶质瘤没有显著差异(P0.05)。在RNAi抑制U251细胞CEP55表达后,细胞的增殖显著受抑(P0.01),细胞的凋亡显著增加(P0.01)。结论人胶质瘤组织细胞较正常脑组织CEP55表达明显增高,抑制CEP55的表达抑制人胶质瘤U251细胞的增殖,同时促进人胶质瘤细胞的凋亡。