人BclGL基因慢病毒表达载体构建及其对T淋巴细胞凋亡的影响

目的 构建针对人BclGL的慢病毒表达载体,检测其对Jurkat T淋巴细胞系凋亡的影响,为进一步研究BclGL在细胞内信号转导及分子功能奠定基础.方法 RT-PCR方法扩增人全长BclGL基因,克隆于pGrP-N1质粒中构建BclGL绿色荧光蛋白融合基因(BclGL-GFP),将融合基因克隆于慢病毒载体FUGW并转染293FT细胞包装浓缩慢病毒颗粒.将浓缩慢病毒感染Jurkat细胞,同时设立PBS对照及FUGW病毒阴性对照组,流式细胞术及荧光定量PCR鉴定BclGL在Jurkat细胞中的表达,Annexin V-APC/PI双染检测细胞凋亡变化.结果 酶切及测序证实人BclGL慢病毒表达载体构建成功,转染Jurkat细胞72 h后Jurkat细胞凋亡明显增加.结论成功构建了高效稳定表达人BclGL的重组慢病毒转染系统,并证实其对Jurkat淋巴细胞的促凋亡效应,为进一步探讨BclGL的生物学功能奠定了基础.     

Gαs慢病毒载体的构建、鉴定与表达

目的:构建Gαs慢病毒表达载体并检测其表达性能,以便应用过表达技术进一步研究Gαs功能。方法:设计针对人Gαs DNA序列的带酶切位点引物,PCR扩增获得双链DNA后,与酶切后的FUW载体片段进行连接、转化,酶切及DNA测序鉴定重组克隆。提取阳性克隆质粒,转染293T细胞。用293T细胞制备慢病毒颗粒,感染293T细胞后收集细胞全蛋白,用QPCR、Western blot检测慢病毒系统过表达效果。结果:证实人Gαs正确插入慢病毒载体,人Gαs慢病毒过表达质粒及相应病毒颗粒能有效过表达Gαs。结论:人Gαs慢病毒表达系统的成功建立,为应用过表达技术研究人Gαs慢病毒功能打下了基础。     

BIRC5 shRNA慢病毒表达载体的构建与鉴定

目的:应用RNA干扰技术,以人BIRC5基因为靶基因,设计合成3对短发夹结构的互补DNA序列和一对阴性对照序列,构建慢病毒干扰载体并鉴定。方法:将设计合成的单链引物退火成双链oligo序列,连接入经AgeI和EcoR I双酶切线性化的pMAGic慢病毒质粒载体中,经转化DH5α感受态细胞并筛选出阳性克隆,采用PCR扩增和DNA测序鉴定阳性克隆。结果:PCR扩增产物经凝胶电泳阳性克隆得到335 bp条带,阴性克隆得到298 bp条带,DNA测序结果证实其含设计合成序列。结论:4对BIRC5 shRNA重组慢病毒表达载体构建成功,为研究靶向BIRC5 siRNA对肿瘤细胞增殖抑制与诱导凋亡作用及基因治疗研究奠定了实验基础。     

携EGFP的人Synoviolin基因慢病毒表达载体的构建与鉴定

目的构建携EGFP的人Synoviolin基因慢病毒表达载体。方法应用基因重组手段,SalⅠ/NotⅠ双酶切质粒pIRES2-EGFP-syno,得到含EGFP和人Synoviolin的基因片段,将其亚克隆至入门载体pENTR1A的多克隆位点内得到入门质粒pENTR1A-syno-egfp。采用LR重组酶将pENTR1A-syno-egfp和目的载体pLenti4/TO/V5-DEST进行重组反应,形成慢病毒表达载体pLenti4/TO/V5-DEST-syno-egfp。将pLenti4/TO/V5-DEST-syno-egfp与包装质粒混合,利用脂质体共转染293FT细胞,包装产生慢病毒,以293FT细胞GFP蛋白的表达水平测定病毒滴度。结果PCR,酶切及测序结果表明慢病毒表达载体pLenti4/TO/V5-DEST-syno-egfp构建成功,转染后的293FT细胞在荧光显微镜下观察可见强绿色荧光。包装的慢病毒原液滴度为1×10~8TU/ml。结论成功构建了EGFP和Synoviolin基因共表达的慢病毒表达载体,为Synoviolin基因的功能研究提供了高效稳定的转基因技术平台。     

类风湿性关节炎患者microRNA-146a的表达及与血清学指标的相关性

类风湿性关节炎(rheumatoid arthritis,RA)是常见的以关节滑膜慢性炎症为主要特征的自身免疫性疾病,其主要病理改变为关节滑膜明显增厚并有大量炎症细胞浸润,血管翳形成以及软骨组织的侵蚀与破坏[1].microRNA可被分泌释放到细胞外,参与多种炎性和自身免疫性疾病的发病过程[2].Micro-RNAs (miRNAs)是一类短的(大约20 ～ 22个核苷酸)非编码RNA,介导RNA干扰和在翻译水平抑制蛋白表达.miRNAs与自身免疫性疾病进程有关且可能参与RA新的调控机制[2-4].     

Beclin1 基因慢病毒表达载体的构建和鉴定

背景：Beclin1基因是哺乳动物的自噬调控基因。 目的：实验拟构建Beclin1 基因慢病毒过表达载体。 方法：聚合酶链反应扩增目的基因Beclin1 后插入慢病毒表达载体pLenex中,构建重组载体pLenex-Beclin1。使用聚合酶链反应、双酶切和DNA的测序方法对其进行鉴定,并与辅助包装质粒共感染293T细胞。慢病毒颗粒转染非小细胞肺癌A549细胞后,用蛋白质印迹法检测Beclin1 基因的过表达效率。 结果与结论：聚合酶链反应鉴定结果显示扩增的阳性片段已插入pLenex载体,聚合酶链反应、双酶切和DNA测序结果表明,重组慢病毒载体pLenex-Beclin1 的插入序列完全正确,重组慢病毒载体感染A549细胞后,细胞内Beclin1蛋白高效表达。结果证实,实验成功构建了Beclin1 基因慢病毒过表达载体。     

HIV-1包膜蛋白ENV慢病毒载体的构建及表达

目的:构建表达HIV-1包膜蛋白ENV的慢病毒载体,感染人胚肾细胞HEK293T,观察env基因在HEK293T中的表达。方法:通过点突变获得HIV-1 env完整基因,将env基因亚克隆至慢病毒穿梭载体pLVX-IRES-ZsGreen1的EcoRⅠ、XhoⅠ位点,构建重组质粒pLV-env,采用脂质体转染法转染HEK293T,经RT-PCR、Western blot检测目的基因表达,同时利用激光共聚焦技术对env基因的表达进行了定位。结果:成功获得了HIV-1 env基因,构建了重组慢病毒质粒pLV-env,RT-PCR、Western blot检测均表明外源基因能够表达,并具有抗原性,同时env基因表达后可以分泌到细胞膜表面膜上。结论:成功构建了含有HIV-1包膜蛋白env基因的重组慢病毒质粒,并验证了其表达,为下一步慢病毒的包装以及细胞模型和动物模型的构建奠定了基础。     

携人PTHLH基因慢病毒表达载体的构建

目的构建携带人甲状旁腺相关激素（PTHLH）基因的慢病毒表达载体pGC-FU/PTHLH。方法酶切载体pGC-FU,根据人PTHLH基因合成特定引物,扩增目的基因片段,将其克隆到pGC-FU质粒（含EGFP基因）上,菌落PCR鉴定及测序分析重组载体,使用Lipofectamine 2000诱导转染pGC-FU、pHelper1.0和pHelper2.0载体三质粒进入293T细胞包装慢病毒,并用带PTHLH的慢病毒感染293T细胞和鼻咽癌CEN1细胞确认慢病毒包装是否成功。结果菌液PCR产物琼脂糖凝胶电泳鉴定显示,与理论预计值阳性转化子735bp,阴性转化子198bp基本相吻合;PCR鉴定阳性的克隆进行测序和比对分析,结果完全匹配,进一步鉴定载体构建成功。分别将质粒包装系统共转染293T细胞,包装产生空白对照慢病毒（pGC-FU）和过表达PTHLH的慢病毒（pGC-FU/PTHLH）;或用携带PTHLH和EGFP基因的病毒上清感染CNE1细胞,48h后,倒置荧光显微镜下观察293T和CNE1细胞,均可见绿色荧光,转染成功。结论成功构建携人PTHLH基因慢病毒表达载体,为进一步研究PTHLH基因在鼻咽癌转移中的作用及鼻咽癌发病分子机制奠定了基础。     

构建内皮脂肪酶慢病毒表达载体及在HepG2细胞中的表达

背景：内皮脂肪酶主要由血管内皮细胞分泌并作用于血管内皮,内皮脂肪酶可能在动脉粥样硬化等疾病的发生发展中起重要作用,但目前机制尚不明确。 目的：构建内皮脂肪酶慢病毒表达载体,产毒感染HepG2细胞,评价重组载体提高内皮脂肪酶表达的效果。 方法：RT-PCR调取大鼠内皮脂肪酶基因,SpeⅠ、Eco RⅠ双酶切后,将内皮脂肪酶基因插入慢病毒载体PRRL.sin.CMV.eGFP中构建内皮脂肪酶过表达慢病毒表达载体PRRL.sin.CMV.EL-eGFP;使用PRRL.sin.CMV.EL-eGFP质粒及病毒包装系统于293FT细胞中包装产毒,用于感染HepG2细胞,RT-PCR及Western blot检测感染后HepG2细胞内皮脂肪酶mRNA及蛋白的表达。 结果与结论：酶切及测序鉴定证实内皮脂肪酶基因成功插入PRRL.sin.CMV.EL-eGFP慢病毒表达质粒;转染PRRL.sin.CMV.EL-eGFP慢病毒表达质粒后,HepG2细胞中可见内皮脂肪酶mRNA及蛋白的表达。说明重组PRRL.sin.CMV.EL-eGFP慢病毒可感染HepG2细胞,并使其表达内皮脂肪酶mRNA和蛋白。     

HPV16 E7基因慢病毒载体的构建及鉴定

目的构建HPV16 E7慢病毒表达载体。方法用RT-PCR方法从Caski细胞中扩增HPV16 E7基因的编码区序列,对扩增出目的片段酶切纯化后将目的片段交换连接入慢病毒表达质粒,酶切鉴定并测序正确后进行慢病毒包装和滴度测定。Western-blot验证3FLAG-E7融合蛋白在293 T细胞中的表达。结果成功获得HPV16 E7基因,成功将HPV16 E7克隆到慢病毒表达质粒中,且包装产生的慢病毒颗粒能成功表达3FLAG-E7融合蛋白。结论成功构建HVP16 E7和flag基因共表达的慢病毒表达载体,为进一步研究HPV16 E7基因的功能建立了高效稳定的转基因技术平台。     

大鼠神经母细胞特异性转移因子基因重组腺病毒载体的构建及鉴定

背景：研究表明,神经母细胞特异性转移因子(ASCL1)是神经发育过程中的关键调控因子,因此通过对成体细胞进行ASCL1基因修饰,有可能将成体细胞转分化为神经细胞,为视神经再生治疗提供新策略。 目的：构建携带鼠ASCL1基因的重组腺病毒表达载体,获得重组腺病毒pAd-rat-ASCL1-EGFP,以期为进一步研究ASCL1基因的功能奠定基础。 方法：用XhoⅠ和 EcoRⅠ将目的基因 ASCL1及带有增强型绿色荧光蛋白表达盒的腺病毒穿梭载体 pYr-adshuttle-4进行双酶切;回收酶切质粒的目的片段进行连接,产物转化至 DH5α感受态;提取质粒酶切鉴定正确后测序。然后通过LR体外同源重组将rat-ASCL1表达框构建至pAd/PL-DEST腺病毒表达载体,PacⅠ酶切线性化后用脂质体法转染HEK293细胞进行包装、扩增,采用PCR法对重组腺病毒进行鉴定,TCID50法测定病毒滴度,荧光显微镜观察病毒感染效率。 结果与结论：通过酶切鉴定和DNA测序鉴定,证实重组腺病毒载体pAd-rat-ASCL1-EGFP构建正确,PCR鉴定扩增出862 bp的目的条带,TCID50法测定病毒滴度为2×1010 pfu/mL。荧光显微镜观察HEK293细胞的病毒感染效率为80%以上。提示含ASCL1基因的重组腺病毒载体构建成功,获得的病毒具有高滴度,高效感染率,为下一步进行ASCL1基因功能研究和视神经再生治疗研究奠定了基础。 中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞;骨髓干细胞;造血干细胞;脂肪干细胞;肿瘤干细胞;胚胎干细胞;脐带脐血干细胞;干细胞诱导;干细胞分化;组织工程     

miR-146a对小鼠巨噬细胞IL-18表达的影响

目的:探讨miR-146a对小鼠单核-巨噬细胞株RAW264.7以及小鼠原代腹腔巨噬细胞Thl/Th2类细胞因子表达的影响。方法:体外培养的小鼠单核-巨噬细胞系RAW264.7细胞和腹腔新鲜分离的巨噬细胞分别瞬时转染miR-146a mimics、阴性对照mimics(NC mimics)、抑制性miR-146a(miR-146a inhibitor)和抑制性miR-146a阴性对照(NC in-hibitor)。转染后,利用real time PCR定量检测IL-18、IL-5和IL-10的表达情况。结果:RAW264.7细胞和原代腹腔巨噬细胞在转染miR-146a mimics后IL-18的表达水平明显降低(P<0.05),转染miR-146a inhibitor后IL-18的表达水平明显升高(P<0.05),但对IL-5和IL-10的表达,两种转染形式均没有影响。结论:巨噬细胞RAW264.7及原代巨噬细胞表达的miR-146a能够负向调控Thl类细胞因子IL-18的表达,但是不能调控Th2类细胞因子IL-5及IL-10的表达。     

雌激素通过miR-146a影响间充质干细胞的免疫调节功能

本研究用混合酶法分离培养人脐带间充质干细胞(MSC),检测在不同浓度17β-雌二醇(E2)作用下MSC中MicroR-NA的表达情况。进一步通过转染使MSC高表达miR-146a,并分析转染后MSC的表型、功能及相关因子的表达变化。结果显示,E2处理的MSC中IFN-β的表达没有发生明显变化,STAT1与IDO1的表达显著下调。同时,E2处理能够上调MSC对miR-146a的表达,降低其对miR-23b和miR-21的表达。miR-146a转染不影响MSC的表型,而显著降低STAT1和IDO的表达。提示E2可能通过影响MSC内miR-146a的表达改变其免疫调节功能。     

表达小鼠Notch1胞内段基因慢病毒载体的构建及鉴定

目的 Notch信号通路在进化中高度保守,在细胞的生长和分化方面起重要作用.构建小鼠Notch胞内段(NICD)慢病毒载体,为Notch信号通路的研究奠定了基础.方法 从C57BL/6J小鼠脊髓组织提取总RNA,逆转录合成cDNA,用PCR方法获取NICD的基因序列,构建慢病毒表达NICD载体,感染HEK293T细胞,实时定量PCR和Western blot分析NICD基因在靶细胞的表达.结果NICD基因在靶细胞的表达水平升高.结论 成功构建表达小鼠NICD基因的慢病毒载体,为今后相关实验研究奠定了基础.     

慢性血小板减少性紫癜患者microRNA-146a的表达及其意义

目的 研究microRNA-146a(miR-146a)在慢性免疫性血小板减少性紫癜(immune thrombocytopenic purpura,ITP)患者外周血单个核细胞(PBMC)的表达及其临床意义.方法 28例慢性ITP患者和28例健康对照者,荧光定量PCR(fluorescent quantitative PCR,FQ-PCR)检测PBMC中miR-146a的表达,ELISA检测血清中TNF-α、IL-2、IL-lβ和IFN-γ的表达水平;采用电转染技术将miR-146a前体(mimics)/抑制体(inhibitor)转染至ITP患者PBMC中,CCK-8法检测其对血小板诱导的细胞增殖反应的影响.结果 ITP患者PBMC的miR-146a表达较健康对照组显著降低,且与血小板计数呈正相关,与患者血浆TNF-α、IL-2和IFN-γ浓度呈负相关.转染miR-146a前体至ITP患者PBMC可抑制血小板诱导的IL-2合成以及PBMC增殖,转染miR-146a抑制体则可以促进IL-2的合成以及PBMC的增殖.结论 miR-146a参与了慢性ITP的发病机制,调控IL-2的表达,并介导了ITP患者PBMC的增殖,是慢性ITP潜在的治疗靶点.

Abstract：

Objective To investigate the increased expression of microRNA-146a(miR-146a) in peripheral blood mononuclear cells (PBMC) of patients with chronic immune thrombocytopenic purpura (ITP) and its clinical significance. Methods Twenty-eight patients with chronic ITP and 28 healthy controls matched with age and gender were enrolled in this study. Fluorescent quantitative PCR reaction was used to detect the relative expression of miR-146a in their PBMC. The serum concentration of TNF-α, IL-2,IL-1 β and IFN-γ were measured by ELISA. CCK-8 method was used to detect the proliferation ability of PBMC , which transfected with miR-146a mimics or inhibitor and then stimulated with platelet . Results The relative expression of miR-146a in ITP patients was higher than that of healthy controls. The increased expression of miR-146a was negatively correlated with the serum TNF-α, IL-2 and IFN-γ. The PBMC transfected with miR-146a mimics had reduced expression of IL-2 and proliferation when stimulated with platelet.In contrast, the opposite effect was observed with the miR-146a inhibitors transfection. Conclusion MiR146a was involved in the pathogenesis of chronic ITP by controlling IL-2 production and PBMC proliferation.Thus, it may be a potential therapy target for chronic ITP.     

CD146基因重组质粒的构建及蛋白表达

目的构建CD146原核、真核表达载体,证实融合蛋白在原核细胞的诱导表达以及在胃癌细胞内的表达和定位。方法提取人黑色素瘤细胞A875的总mRNA并进行反转。以反转录的cDNA为模板PCR扩增CD146全长编码基因,分别克隆至pCDNA3.1-myc/his以及pGEX-4T-3表达载体中。原核重组质粒鉴定后转入BL21细胞中并经了诱导表达及纯化,真核表达质粒转入胃癌MKN45细胞中,分别利用westernblot和激光共焦扫描显微技术检测了重组质粒的表达以及在胃癌细胞中的定位。结果 CD146全长基因序列克隆到原核、真核表达载体中,酶切鉴定片段为1930bp。原核诱导出了GST-CD146并进行了纯化,CD146在真核细胞中表达为113KD的糖蛋白,Westernblot检测到真核转染的myc/his-CD146表达,条带约为120KD,免疫荧光显示蛋白定位在胃癌MKN细胞膜。结论成功构建了CD146原核、真核表达载体,融合蛋白在胃癌MKN45细胞表达。     

rAAV2-EM>hGAD/EM>65重组载体的构建和功能检测

目的 构建rAAV2-hGAD65重组载体,观察其体内外功能。方法 应用RT-PCR的方法克隆hGAD65基因,与AAV载体连接得到重组载体(rAAV2-hGAD65)。包装重组腺相关病毒并检测病毒的滴度。体外感染成纤维细胞后,用免疫组织化学的方法检测GAD65在细胞中的表达水平,用高效液相色谱(HPLC)法检测培养上清中γ氨基丁酸(GABA)的含量。在体实验中,向丘脑底核(STN)立体定位注射rAAV2-hGAD65后,用HPLC方法检测黑质网状部(SNr)中的GABA含量。结果 应用RT-PCR方法成功地从人胚胎端脑组织中克隆出GAD65基因的cDNA,基因测序显示与基因库中人GAD65基因序列一致,亚克隆入AAV载体并包装后所得的病毒颗粒的滴度达到4.5×10¹¹/ml。组织化学检测感染大鼠肺成纤维细胞的效率约为80%,HPLC检测培养上清中GABA的含量为(45.66±6.07)nmol/L。STN立体注射rAAV2-hGAD65后,在STN可以检测到hGAD65的表达,SNr区GABA的含量由原来的(5.66±1.07)nmol/g升高到(12.66±2.59)nmol/g。结论 成功地克隆出了人GAD65基因,并构建了AAV重组载体。AAV病毒颗粒在体外能感染成纤维细胞并具有催化谷氨酸合成GABA的功能。在体内实验中,向STN注射rAAV2-hGAD65后,可以增加黑质网状部(SNr)中的GABA含量。     

Pre-miR-146a基因rs2910164位点单核苷酸基因多态性及miR-146a表达与类风湿关节炎相关性研究

目的 探讨pre-miR-146a基因rs2910164位点单核苷酸基因多态性及miR-146a表达与类风湿关节炎相关性.方法 采用聚合酶链反应-连接酶检测反应检测123例类风湿关节炎(RA)患者和220例健康对照者pre-miR-146a rs2910164位点基因多态性,应用实时荧光定量聚合酶链反应检测68例RA患者、10例骨关节炎(OA)患者及20例健康对照外周血单个核细胞中miR-146a的表达水平,并选取10例RA疾病活动患者行激素加免疫抑制剂正规治疗3个月后miR-146a表达水平的测定.收集并计算RA患者临床参数:发病年龄、性别、类风湿因子(RF)和抗环瓜氨酸肽(抗-CCP)抗体、RA疾病活动(DAS28≥3.2)、骨破坏(X＞Ⅰ期).统计学处理采用X2检验、方差分析、t检验和Pearson相关分析.结果 RA组pre-miR-146a rs2910164位点的基因型频率和等位基因频率与健康对照组比较,差异无统计学意义(P均＞0.05).RA患者pre-miR-146ars2910164位点基因型与发病年龄、性别、RF和抗-CCP抗体阳性率、RA疾病活动、骨破坏阳性率及miR-146a表达量均无相关性(P均＞0.05).RA患者组miR-146a的表达量高于健康对照组和OA组(P均＜0.01),后两组miR-146a的表达量无统计学差异(P＞0.05).RA疾病活动组miR-146a表达高于非活动组和对照组(P均＜0.01),后两组miR-146a的表达量无统计学差异(P＞0.05).RA疾病活动患者治疗后miR-146a表达下降(P＜0.05),DAS28评分降低(P＜0.01).RA患者组miR-146a的表达与红细胞沉降率(ESR,即血沉)、C反应蛋白(CRP)及DAS28评分之间呈正相关(P均＜0.01),与RF、抗-CCP抗体滴度无相关性(P均＞0.05).结论 我国汉族人群中,pre-miR-146a rs2910164位点多态性与RA的易感性、临床参数及miR-146a的表达无相关性,RA患者外周血单个核细胞miR-146a表达上调,其表达水平与RA病情活动有关,miR-146a的检测可能是RA病情活动的一个有用的判断指标.