日本血吸虫40 kDa热休克蛋白对巨噬细胞活化的影响

目的构建pGEX 6P 1 SjHSP40(SjHSP40)融合表达载体并在大肠埃希菌(Escherich coli)内进行原核表达及重组蛋白纯化,以探讨SjHSP40对巨噬细胞活化的影响。方法以PCR方法扩增SjHSP40基因片段,将其克隆入原核表达质粒pGEX 6P 1,经测序验证后转化入E.coli BL21(DE3)中。重组蛋白经异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达后以Glutathione Sepharose 4B亲和柱进行纯化。所得产物GST SjHSP40进行十二烷基磺酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS PAGE)、Westernblot鉴定。将此融合蛋白负载巨噬细胞48 h后,用流式细胞术检测巨噬细胞表面分子。结果测序结果表明,本研究成功构建了pGEX 6P 1 SjHSP40原核表达载体,经IPTG诱导表达出融合蛋白。Western blot显示该融合蛋白能被抗GST抗体特异性识别。与GST等对照组相比,此融合蛋白负载的巨噬细胞表面共刺激分子(CD40、CD80、CD86)及MHCⅡ分子表达显著上调。结论 SjHSP40可显著上调巨噬细胞表面共刺激分子(CD40、CD80、CD86)及MHCⅡ分子的表达,提示其可在一定程度上使巨噬细胞活化。     

日本血吸虫热休克蛋白60 kDa的免疫原性及保护性研究

目的研究日本血吸虫热休克蛋白60 kDa(SjHSP60)免疫原性,评价其免疫保护性及可能机制。方法通过在线生物信息学软件预测SjHSP60的B细胞表位,随后用SjHSP60免疫BALB/c小鼠后检测特异性抗体水平和淋巴细胞增殖以评估其免疫原性,进一步通过攻击感染实验观察其免疫保护效果;最后分选免疫小鼠的CD4~+CD25~+调节性T细胞(Treg)与CD4~+CD25~-T细胞共培养,通过细胞增殖实验检测CD4~+CD25~+Treg细胞的抑制功能。结果生物信息学预测结果显示,SjHSP60中存在多个B细胞表位的优势区段。SjHSP60可在小鼠体内诱导特异性抗体(P0.01),也可诱导小鼠脾细胞发生增殖(P0.01)和分泌IFN-γ(P0.01);但攻击感染实验显示,SjHSP60免疫小鼠体内虫荷(P0.05)、卵荷(P0.05)均未显著减少。体外共培养实验表明,SjHSP60可显著增强小鼠CD4~+CD25~+Treg细胞的免疫抑制功能(P0.01)。结论SjHSP60对宿主免疫系统可发挥"双刃剑"作用,即在诱导特异性抗感染免疫应答的同时又可增强免疫抑制功能,从而削弱了其免疫保护作用。     

血吸虫23kDa膜内在蛋白的研究现状

血吸虫的２３ｋＤａ抗原是一种膜内在蛋白。宿主针对此抗原能产生可识别的特异性抗体；２３ｋＤａ抗原可诱导宿主保护性免疫的产生，为有价值的诊断抗原及候选疫苗，本文对２３ｋＤａ蛋白的合成情况，表达阶段，结构特点，免疫学及分子生物学特征等方面作一概述。     

日本血吸虫22.6kDa膜相关蛋白Th1型表位的免疫学鉴定

目的鉴定日本血吸虫22.6 kDa膜蛋白（Sj22.6）的Th1型表位,为构建短肽疫苗奠定基础。方法采用合成肽Sj22.6-P4、无关肽（对照）及PBS免疫C57BL/6小鼠2次（间隔7 d）,末次免疫后7～10 d取脾分离单个核细胞,用合成肽Sj22.6-P4、无关肽及PBS刺激培养,3H-TdR掺入法检测淋巴细胞的增殖效果,酶联免疫吸附试验（ELISA）检测其细胞培养上清中IFNγ-、IL-4及IL-2水平。运用流式细胞技术三色标记法检测经合成肽Sj22.6-P4、无关肽及PBS免疫2次的C57BL/6小鼠脾淋巴细胞内的Th1、Th2细胞因子。结果合成肽Sj22.6-P4可刺激经该抗原肽免疫2次的C57BL/6小鼠淋巴细胞增殖,与PBS组相比,增殖指数（SI）均〉2。与无关肽对照组相比,细胞培养上清中IL-2、IFN-γ分泌水平增高,其中IL-2分泌水平差异有统计学意义（P〈0.05）,IFN-γ差异无统计学意义（P〉0.05）,而IL-4分泌水平明显降低（P〈0.05）。合成肽Sj22.6-P4免疫组小鼠脾脏CD4＋T细胞中分泌IFN-γ细胞的百分比显著增高,分泌IL-4细胞的百分比显著降低（P均〈0.05）。结论合成肽Sj22.6-P4是C57BL/6小鼠特异的Th1型表位。     

抗日本血吸虫重组蛋白20.8kDa抗原单克隆抗体的建株

以日本血吸虫重组蛋白 2 0 .8k Da抗原免疫 BAL B/ c小鼠 ,制备单克隆抗体。每鼠注入蛋白 10 0μg,共免疫 3次 ,第1次加福氏完全佐剂 ,第 2、 3次加福氏不完全佐剂 ,间隔 3wk。融合前 ,于免疫的 BAL B/ c小鼠尾静脉注射 5 0 μg血吸虫重组蛋白 2 0 .8k Da抗原 ,4 d后取脾脏与骨髓瘤细胞 SP2 / O融合 ,11d后检测 ,融合率为 13.5 4 % (2 6 / 192 )。EL ISA检测培养上清 ,筛选阳性孔 ,经 3次克隆 ,获得 6株阳性杂交瘤细胞株。将这 6株细胞上清浓缩 10倍 ,用琼脂双扩散法测得免疫球蛋白亚类为 Ig G1 4株 ,Ig M2株。将 6株细胞扩增后注…     

寄生虫热休克蛋白及其在血吸虫方面的研究进展

本文以ＨＳＰ７０和ＨＳＰ９０为例，简述了热休克蛋白的功能及基因表达调控，寄生虫热休克蛋白与参寄生虫分化并增强其毒力，作为免疫原诱导宿主保护免疫力等方面的作用；并简述了血吸虫ＨＳＰ７０的研究进展。     

日本血吸虫热休克因子基因结构特征及其可变剪切亚型分析研究

目的克隆、鉴定日本血吸虫热休克因子(Sj-hsf),并分析其基因结构特征和可变剪切亚型。方法以日本血吸虫尾蚴感染新西兰白兔,42 d后剖杀,以灌注法收集雌虫、雄虫及感染兔肝脏,以Trizol法提取总RNA。以RT-PCR扩增日本血吸虫雌虫、雄虫、虫卵总RNA,获得Sj-hsf开放阅读框(ORF)全长片段和Sj-hsf可变剪切区域片段,并进行克隆、酶切及测序鉴定。用DNAMAN 8.0、Inter Pro、Mega 6结合日本血吸虫和曼氏血吸虫基因组数据库以及Gen Bank等网络分析平台,分析Sj-hsf的基因结构特征、功能结构域、可变剪切模式以及不同物种间HSF序列的同源性和进化树。结果自雌虫、雄虫、虫卵扩增获得靶片段,并克隆获得阳性重组质粒,其中含Sj-hsf ORF的p BSj HSFf-F、p BSj HSFf-M、p BSj HSFf-E以及含可变剪切片段的p BSj HSFs-F、p BSj HSFs-M、p BSj HSFs-E,酶切及测序鉴定正确。序列分析显示Sj-hsf具有3种剪切亚型:Sj-hsf-isoform1(2 050 bp)、Sj-hsf-isoform2(2 086 bp)、Sj-hsf-isoform3(2 111 bp),Gen Bank登录号分别为KU954546、KX119143、KX119144,均位于日本血吸虫基因组SJC-S000780,有8个外显子,在雌虫、雄虫和虫卵阶段3种亚型均存在,以Sj-hsf-isoform1表达量高。Sj-HSF-isoform1(671 aa)、Sj-HSF-isoform2(683 aa)具有HSF特征性DBD(DNA Binding Domain)、HR-A/B和HR-C结构域,Sj-HSF-isoform3(282 aa)提前终止,无HR-C结构域。进化树分析表明Sj-HSF三种剪切亚型隶属HSF1,与曼氏血吸虫HSF近源。结论日本血吸虫雌虫、雄虫、虫卵阶段均存在3种剪切亚型的HSF,以Sj-HSF-isoform1表达量高。本研究为进一步阐明Sj-HSF调控Sj-HSPs等应激防御体系的分子机制奠定了基础。     

日本血吸虫22.6kDa重组蛋白对小鼠的免疫保护性研究

目的:研究日本血吸虫(中国大陆株)22.6 kDa 抗原作为血吸虫病疫苗候选分子的潜能,并探讨Sj22.6/Sj26 GST 融合蛋白作为复合疫苗的可能性。方法:用亲和层析法制备Sj22.6/Sj26 GST融合蛋白。将这两种蛋白分别免疫BALB/c小鼠后进行攻击感染试验。结果:Sj22.6 重组蛋白和Sj22.6/Sj26 GST 融合蛋白分别可诱导小鼠产生32.1% (P< 0.005) 和34.9% (P< 0.02)的成虫减虫率, 28.4% (P< 0.02)和45.1% (P< 0.005)的总减卵率。结论:rSj22.6 与Sj22.6/Sj26 GST融合蛋白均有疫苗应用价值     

佐剂对日本血吸虫31／32kDa蛋白保护性免疫力的影响

本实验用纯化的日本血吸虫３１／３２ｋＤａ蛋白辅以ｐｏｌｙａｌｐｈａｏｌｅｆｉｎ（ｐａｏ）佐剂免疫小鼠，同时比较了Ｓｊ３１／３２蛋白辅以福氏完全佐剂对小鼠保护性免疫力的影响。     

日本血吸虫中国大陆株23 kDa膜蛋白DNA疫苗诱导小鼠保护性免疫的研究

目的　研究日本血吸虫中国大陆株 2 3kDa膜蛋白 (SjC2 3)DNA疫苗诱导C5 7BL/6小鼠免疫保护作用。方法　将全长的SjC2 3基因克隆到真核表达载体pcDNA3.1,构建DNA疫苗 pcDNA3.1 SjC2 3。制备SjC2 3及IL 12的两个亚单位 p35、p4 0的DNA疫苗和对照 pcDNA3.1。 4 8只C5 7BL/6小鼠随机分为A、B、C 3组。A组小鼠肌注 10 0 μgpcDNA3.1;B组注射 10 0 μg pcDNA3.1 SjC2 3;C组肌注 pcDNA3.1 SjC2 3、pcDNA3.1 p35及pcDNA3.1 p4 0各 10 0 μg的混合物。每隔 2周各免疫 1次 ,共 3次。第 8周每鼠感染 4 5± 2条 /只尾蚴 ,4 5d后剖杀 ,计数成虫及肝内虫卵。采用免疫组化法检测SjC2 3及 p35、p4 0在小鼠局部组织内的表达 ;用脾细胞培养法检测经rSjC2 3 HD刺激后 ,攻击前、后小鼠脾细胞IL 2、IL 4、IL 10和IFN γ的水平。用Westernblotting检测血清中抗SjC2 3抗体。结果　SjC2 3以及p35、p4 0在免疫小鼠股四头肌细胞膜和细胞浆均获得表达。IL 2和IFN γ的水平攻击前、后在B组和C组均明显升高。Westernblotting检测抗SjC2 3抗体结果表明 ,免疫后两周 ,B组 8/10份血清为阳性 ,C组 9/10份血清阳性。B组和C组分别获得 2 6 .9%和 35 .4 %的减虫率 ,C组显著高于B组 (P <0 .0 5 ) ;减卵率分别为 2 2 .2 %和 2 8.4 %。结论　SjC     

日本血吸虫21.7kDa膜蛋白的表达及特性分析

目的　对日本血吸虫中国大陆株 2 1 .7kDa膜蛋白分子 (SjC2 1 .7)进行体外重组表达 ,纯化并分析其免疫特性。　方法　将SjC2 1 .7分子基因亚克隆到表达载体 pGEX 4T 3中构建重组表达质粒。重组质粒转化大肠杆菌 ,经IPTG诱导 ,表达GST SjC2 1 .7融合蛋白 ,用亲和层析及蛋白酶切制备纯化的重组SjC2 1 .7分子。将重组SjC2 1 .7免疫小鼠制备抗血清 ,用Westernblotting分析其免疫特性。　结果　SjC2 1 .7分子基因被成功地克隆到表达质粒 pGEX 4T 3中 ,并获得能表达GST SjC2 1 .7融合蛋白的转化子。纯化的重组SjC2 1 .7蛋白免疫昆明鼠能产生高效价的抗体。该重组蛋白能被免疫鼠血清和重感染兔血清所识别 ,免疫鼠血清能识别成虫抗原 (AWA)中相应分子量的蛋白质条带。　结论　本研究获得具有较好免疫原性的重组SjC2 1 .7蛋白质分子 ,为进一步研究其免疫保护性作用奠定了基础     

日本血吸虫热休克蛋白70诱导BALB/c小鼠皮肤炎症反应的实验研究

目的 目的 观察重组日本血吸虫热休克蛋白70 （rSj648/hsp70） 诱导BALB/c小鼠皮肤炎症反应的变化情况。 方法 方法 BALB/c小鼠经腹部皮内分别免疫注射LPS （20 μg/只）、 rSj648/hsp70 （100 μg/只）, 同时设PBS处理组为空白对照。通过苏木素伊红 （HE） 染色观察免疫后第1、 2、 4、 7天小鼠腹部皮肤的炎症反应变化, 并利用Real?time PCR方法检测不同时间点各组小鼠皮肤组织IFN?γ mRNA的表达水平。 结果 结果 通过HE染色观察发现LPS组小鼠腹部皮肤组织在免疫后第1天炎症细胞浸润明显, 之后炎症反应开始逐渐减轻; 与LPS组相比较, rSj648/hsp70组小鼠腹部皮肤炎症反应强度大, 持续时间长,直至免疫后第7天炎症反应仍明显。Real?time PCR结果显示, 免疫后第1天, LPS组和rSj648/hsp70组小鼠皮肤组织的IFN? γ mRNA表达水平均升高, 之后LPS组逐渐降低, 而rSj648/hsp70组直至免疫后第7天仍持续高表达。 结论 结论 rSj648/hsp70 能使小鼠皮肤出现较强的以诱导产生IFN?γ为主的Th1优势免疫应答, 进一步提示了HSP70高表达可能与致弱尾蚴诱导宿主产生抗感染免疫力有关。     

Anti-fecundity immunity induced in pigs vaccinated with recombinant Schistosoma japonicum 26kDa glutathione-S-transferase

We have recently reported (Liu et al. 1995) that immunization of mice with recombinant 26kDa GST (reSjc26GST) induces a pronounced anti-fecundity effect after experimental infection with Chinese Schistosoma japonicum. A similar vaccination trial was thus carried out on pigs, important reservoirs for schistosomiasis japonica, using purified, reSjc26GST and reSjp26GST from Schistosoma japonicum with alum as adjuvant; in general, similar results were obtained with the two sources of recombinant 26 kDa GST. Some protection in terms of worm reduction, significant with males, against challenge infection was observed in vaccinated pigs. Moreover, prior to challenge, levels of specific anti-re26GST antibodies in the vaccinated pigs were significantly higher than in non-vaccinated pigs as determined by GST-ELISA. The most striking feature of the vaccine trial was the significant reduction in the number of eggs, especially mature eggs, in the livers of vaccinated animals. The results indicate that immunization with recombinant Sj26GST can provide some reduction in worm burden following exposure of pigs to reinfection with S. japonicum. In addition, reSj26GST can induce an anti-fecundity effect, thereby reducing pathology, coupled with a delay or interruption of the development of immature to mature eggs in the liver. As a consequence, vaccination with SJ26GST would also prove useful in affecting the transmission of schistosomiasis japonica.     

日本血吸虫(中国大陆株)22.6kDa重组抗原对小鼠免疫保护性的初步研究

目的：为研究日本血吸虫（中国大陆株）22．6kDa抗原的免疫保护性。方法：将其编码cDNA经PCR扩增后亚克隆入载体质粒PGEX—1λt进行表达，并用重组抗原免疫了一批昆明鼠。结果：与对照组相比，重组抗原免疫小鼠获得了38．93％的减虫率。结论：证明重组的日本血吸虫22．6kDa抗原可诱导宿主抗血吸虫感染的部分保护力。     

日本血吸虫22.6kDa抗原T细胞表位的重组、表达及初步鉴定

目的　鉴定日本血吸虫中国大陆株22.6kDa抗原(Sj22.6)的T细胞表位。　方法　用计算机软件预测Sj22.6分子的T细胞表位,设计并合成其编码核苷酸,定向克隆入融合表达载体pET32c(+),转化大肠杆菌BL21感受态细胞,经酶切及测序鉴定出重组克隆。阳性克隆经IPTG诱导表达,表达产物用NTA柱纯化。用纯化后的表位肽融合蛋白体外刺激C3H小鼠脾单个核细胞,3HTdR掺入法检测其增殖。　结果　用计算机软件预测获得Sj22.6抗原的4个候选表位肽,并成功克隆入pET32c(+)。其重组体均可表达分子量约20kDa的融合蛋白,用NTA柱纯化后经12%聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDSPAGE)显示单一条带。其中P4、P5、P6融合蛋白能有效刺激小鼠脾单个核细胞增殖。　结论　从Sj22.6抗原中初步鉴定出P4、P5、P63个T细胞表位     

日本血吸虫生殖相关蛋白SjWD40的虫体免疫定位

目的研究抗重组日本血吸虫生殖相关蛋白WD40(SjWD40)多克隆抗体对天然SjWD40的结合活性,观察SjWD40在虫体内的定位。方法从阳性钉螺体内逸出尾蚴,感染家兔,于感染后42 d剖杀收集成虫和虫卵制备石蜡切片,利用抗重组蛋白SjWD40多克隆抗体,通过间接免疫荧光方法探讨SjWD40在虫体内的分布。结果SjWD40广泛分布于雌虫的卵黄腺、雄虫的睾丸,虫卵的毛蚴体壁,尾蚴的头腺、钻腺、腺管等部位。结论免疫荧光染色法确定SjWD40蛋白主要分布于血吸虫成虫的生殖腺、毛蚴体壁及尾蚴腺体等组织。