游离缘指甲DNA检测异基因造血干细胞移植后供受者嵌合状态的变化

目的 探讨异基因造血干细胞移植(allogeneic hematopoietic stem cell transplantation,allo-HSCT)后用患者指甲游离缘标本进行短片段重复序列(short tandem repeat,STR)基因分型和供受者嵌合率检测的适用性,并观察移植后患者指甲中供受者嵌合状态变化.方法 选取2009年7月至2011年9月在北京市道培医院行allo-HSCT的25例患者及25名供者.采集患者及其供者外周血、骨髓、指甲游离缘和口腔黏膜标本.提取标本中基因组DNA,进行15个STR位点的基因分型和嵌合状态分析.将患者分为2组:第1组包括12例患者,在接受allo-HSCT后1个月内分别同时采集患者的指甲游离缘标本和口腔黏膜标本,并做嵌合状态的比较;第2组包括13例患者,观察患者行allo-HSCT后3个月指甲标本中的嵌合状态,并对其中3例患者进行多次指甲标本采集和嵌合状态检测.结果 在第1组12例患者中,指甲标本均检测为患者自身的STR基因型;在4份口腔黏膜标本中检测到供受者混合嵌合状态,供者STR基因型所占比例分别为16.7％、32.1％、35.8％和60.7％.在第2组13例患者中,5例患者存在供受者细胞的混合嵌合状态,即受者指甲中出现供者的STR基因型,嵌合率在6.7％至82.6％之间.3例行allo-HSCT后多次检测指甲嵌合率的患者中,1例始终未检测到供者基因型的嵌合,另2例患者中检测到持续存在的供者基因型的嵌合.结论 移植后1个月内采集的指甲游离缘标本可用于患者STR基因型鉴定和供受者嵌合率分析,优于口腔黏膜标本.供者的移植物中具有可以分化成为皮肤组织的细胞,部分患者移植后皮肤中可长期存在供者来源细胞的嵌合状态.     

STR-PCR定量检测嵌合体供者嵌合率准确性探讨

目的探讨用荧光标记复合扩增短串联重复序列(STR-PCR)结合序列分析仪毛细管电泳法检测嵌合体供者细胞嵌合率的准确性。方法采集健康献血者外周血按白细胞比例两两混合制备不同供受者比例的体外嵌合体模型,对15个STR位点进行荧光标记复合扩增,扩增产物进行序列分析仪毛细管电泳,计算嵌合率。结果实验测得嵌合率与扩增前样本嵌合率呈显著直线相关,r=0.999 7,最小检出供者细胞嵌合率<1%。供者嵌合率≥5%的嵌合体模型嵌合率的检测值与理论值差别无统计学意义(P>0.05),<5%的模型嵌合率检测值与理论值差别有统计学意义(P<0.05)。结论荧光标记复合扩增STR基因结合序列分析仪毛细管电泳检测嵌合率方法个体识别力高、特异、敏感,当供者嵌合率≥5%时能准确反映异基因造血干细胞移植后患者的嵌合状态。     

Profiler体系用于异基因造血干细胞移植植活测定

目的探讨应用Profiler体系进行短串联重复序列（STR）基因位点检查在异基因造血干细胞移植中的作用。方法采用荧光标记STR-PCR复合扩增、毛细管电泳基因分型技术，对11例异基因造血干细胞移植的供者和受者移植前、后STR基因进行检测，了解造血干细胞的植入情况。结果11例异基因造血干细胞移植受者移植后STR基因型与受者移植前STR基因型不同，与供者STR基因型完全相同，提示供者造血干细胞的植入。结论应用Profiler体系进行STR基因位点检查可用于判断异基因造血干细胞移植的植入情况。     

STR-PCR分析嵌合体在同种异基因造血干细胞移植中的应用

利用荧光标记的多重PCR扩增短串联重复序列（STR-PCR）结合毛细管电泳检测供者细胞嵌合率（DC）,以探讨该方法的连续检测对异基因造血干细胞移植（allo-HSCT）后转归的预警作用,采集27例清髓性外周血干细胞移植患者移植前、移植后不同时段的外周血或骨髓,DNA样本用Profiler Plus和Cofiler Plus商品化试剂盒扩增后,用ABI310遗传分析仪进行毛细管电泳,确定基因位点及峰面积,根据基因型的差异选择嵌合率计算公式。结果表明：两种试剂盒测得的DC嵌合率一致;在27对中能区别出供受差别的STR位点,Profiler Plus为6.3（4-9）个,Cofiler Plus为4.9（2-6）个。26例患者均在移植后28天出现供者细胞,1例患者未出现供者细胞。14例患者DC100%,均获得持久植入,至今仍无白血病生存;另有9例患者出现不稳定混合嵌合（MC）状态（DC为0%-90.2%）,其中5例为血液学复发。27例病人中有6例死亡。上述5例复发患者均在出现临床症状前发生DC量下降;供者细胞完全嵌合组移植物抗宿主病（GVHD）的发生率高于MC组。结论：动态检测DC可用于移植动力学研究,对移植物早期植入或被排斥、疾病复发以及GVHD的发生均有预警作用,对早期实施临床干预治疗有重要的指导意义。     

嵌合体的动态定量检测在异基因造血干细胞移植中的应用

目的　建立荧光标记的多重PCR扩增短串联重复序列 (STR PCR)结合毛细管电泳 ,定量检测供体细胞 (DC)嵌合率的方法 ,并探讨该方法的连续定量检测对异基因造血干细胞移植 (allo HSCT)后转归的预警作用。方法　采集 31例接受骨髓移植 (BMT)或非清髓外周血干细胞移植 (NST)患者移植前、移植后不同时段的外周血或骨髓。DNA样本用ProfilerPlus商品化试剂盒扩增后 ,用ABI 310遗传分析仪进行毛细管电泳 ,确定基因位点及峰面积 ,根据供受体基因型的差异选择嵌合率计算公式。结果　 31例患者中 15例 (48.4 % )为性别相合移植 ,只能通过STR PCR进行嵌合体的定量分析 ;性别不合移植患者用STR PCR和荧光原位杂交两种方法定量测得的DC嵌合率一致 ;31对供受体中能区别出供受差别的STR位点有 6 .7(2～ 10 )个 ,所有患者均在移植后 7天 ( 7天 )出现供体来源的细胞 ,BMT组 7天、 14天和 1个月DC中位数均明显低于NST组 ,而在移植中后期无显著性差异。 2 1天时BMT和NST患者均达稳定嵌合 ,DC在 92 %以上 ;中位随访 17(3.5～ 2 9.0 )个月 ,2 6例患者DC≥90 % ,均获得持久植入 ,至今均为无白血病生存。另有 5例患者出现不稳定混合嵌合 (MC)状态 (DC为2 7.3%～ 6 2 .7% ) ,其中 4例复发 ,1例出现移植物被排斥。上述 5例患者均     

多供体造血干细胞移植术后的嵌合率定量检测

本研究旨在建立检测多供体造血干细胞移植术后供体细胞嵌合率(DD-CHM%)的计算模型并简化计算方法。以接受异基因造血干细胞移植的血液系统疾病患者为研究对象,采用STR-PCR结合毛细管电泳的方法,检测移植术后供体细胞嵌合率。结果表明:在混合嵌合状态下,同一个体来源的等位基因的双峰面积和高度是近似的,可以互相替代;对构建的计算模型中各等位基因的峰面积进行赋值,得到的嵌合率准确值和近似值在可接受的计量系统自身误差范围内(5%-20%)是基本没有差异的。结论:在混合嵌合状态下,来自于同一个体的等位基因在STR位点上的非共享峰是可以替代共享峰面积,此设想可以用作于计算多供体造血干细胞移植术后嵌合率的检测;在计算位点选择上,受体位点的选择比供体位点选择更为重要,能更加有效的简化计算步骤,并能更准确的得到供体细胞嵌合率的结果。     

HLA-B位点不合两份脐血混合移植植入状态的动态观察

目的动态观察分析两份HLA不全相合异基因混合脐血移植后的植入状态.方法一例成人急性髓细胞白血病患者采用了两份HLA-B位点不全相合非血缘脐血移植(脐血1有核细胞数为2.5×107/kg,脐血2有核细胞数为1.53×107/kg),对其移植前、移植后15天、30天、52天和69天的外周血进行HLA及STR基因两种遗传学标记物的检测.采用PCR-SSP基因分型试剂盒对HLA-B位点进行差异分析,用"Profiler Plus"及"Cofiler"试剂盒检测15个STR位点,对移植前后的检测结果进行对比分析.结果 HLA及STR检测均显示移植后15天、30天基因型为完全两份脐血的嵌合型,移植后52天、69天只表达脐血1的基因型.结论两份脐血移植初期可同时植入,而后其中有核细胞数高的一份脐血可长期植入.HLA及STR基因作为植入证据为临床脐血混合应用及治疗提供了直接的实验依据.     

造血干细胞移植植入存活检定技术的应用性研究

目的 探讨荧光标记短串联重复(STR)复合扩增技术在造血干细胞移植(SCT)存活检定中的应用价值。方法 用荧光标记引物对15个STR位点和1个性别位点牙釉质蛋白基因(amelogenin)进行聚合酶链反应(PCR)复合扩增，再用DNA自动测序仪对PCR产物进行分离及分型，并对30例移植后病人做存活鉴定检测。结果 有20例移植后病人的15个STR位点的分型完全表现供者源性，与受者移植前不同；3例表现为供／受体干细胞混合嵌合状态，7例未表现出供者源性细胞在受者体内的植入。结论 荧光标记STR复合扩增体系特异性强，个体识别力高，检测灵敏、快速、简便，可作为SCT存活的可靠指标。     

PCR-STR用于异基因造血干细胞移植后的骨髓和外周血嵌合状态的监测及作用

目的用PCR-STR检测观察比较异基因造血干细胞移植术后,骨髓和外周血嵌合状态和植入状态。方法提取17例异基因造血干细胞移植术中的供者外周血及受者移植前后各阶段外周血和骨髓的DNA,PCR PCR-STR检测扩增15个基因位点,和1个性别位点AMEL。用遗传分析仪进行毛细管电泳,确定基因位点,根据基因型的差异选择嵌合率计算公式,分析植入情况和嵌合状态。结果12名患者完全植入,骨髓和外周血的PCR-STR结果一致;1名患者骨髓PCR-STR显示为持续未植入,外周血PCR-STR显示为短期混合植入;4名患者骨髓和外周血PCR-STR显示嵌合状态时间不一致,骨髓PCR-STR显示嵌合状态时间明显早于外周血(P<0.05)。结论PCR-STR是分析异基因造血干细胞移植后供体是否植入的灵敏、准确度高的方法,骨髓嵌合状态的变化的出现早于外周血,混合嵌合状态对白血病复发有预警作用,骨髓嵌合状态的早期变化对实施临床干预治疗尤为重要。     

四川汉族人群15个短串联重复序列基因座遗传多态性分析

目的获得15个短串联重复(short tandem repeat,STR)基因座在四川汉族人群中的群体遗传学数据。方法654份血样采自四川地区无血缘关系的汉族个体。Chelex法提取DNA,PCR复合扩增,自动基因分析仪电泳,收集电泳结果数据,基因扫描分析软件计算扩增产物片段相对大小,基因分型软件进行样本基因型分型。结果全部样本的每个STR基因座都获得了清晰的基因型分型结果。15个STR基因座的基因型分布符合Hardy-Weinberg平衡。15个STR基因座的杂合度介于0.6101—0.8654之间。累计非父排除率和累计个人识别率为0.999998766和>0.999999999。结论经1次扩增电泳可获得15个STR基因座的基因型分型结果,累计非父排除率和累计个人识别率较高,适合作为四川汉族人群的遗传标记,用于人类学、疾病连锁分析、法医学亲权鉴定和个体识别等领域的研究。     

HLA-B位点不合两份脐血混合移植植入状态的动态观察

目的动态观察分析两份HLA不全相合异基因混合脐血移植后的植入状态。方法一例成人急性髓细胞白血病患者采用了两份HLA-B位点不全相合非血缘脐血移植(脐血1有核细胞数为2.5×107/kg,脐血2有核细胞数为1.53×107/kg),对其移植前、移植后15天、30天、52天和69天的外周血进行HLA及STR基因两种遗传学标记物的检测。采用PCR-SSP基因分型试剂盒对HLA-B位点进行差异分析,用“ProfilerPlus”及“Cofiler”试剂盒检测15个STR位点,对移植前后的检测结果进行对比分析。结果HLA及STR检测均显示移植后15天、30天基因型为完全两份脐血的嵌合型,移植后52天、69天只表达脐血1的基因型。结论两份脐血移植初期可同时植入,而后其中有核细胞数高的一份脐血可长期植入。HLA及STR基因作为植入证据为临床脐血混合应用及治疗提供了直接的实验依据。     

适合移植后嵌合物定量分析的信息STR位点谱的建立及其应用

本研究选取8个STR位点作为嵌合物定量分析的信息STR位点谱,评估其作为异基因造血干细胞移植（HSCT）后移植物嵌合状态的定量监控指标的作用。采集15对移植供受者血样,提取DNA,分别合成标记D3S3045、D4S2366、D4S2639、D5S818、D13S317、D18S1002、D20S481、D22S689的引物,建立PCR扩增体系,在ABI3100仪上检测这些位点的扩增片段．筛选得到理想的信息位点;制备梯度供者／受者DNA混合品和移植后不同日期采集的标本,进行信息位点的检测;获取峰高或峰面积进行移植嵌舍率的计算。结果显示,根据梯度混合DNA的结果获得标准曲线,计算得到的嵌合率和配制浓度中的嵌合比例基本一致;用峰高和峰面积同时计算,两者基本一致;成功获得了15例移植后病人的嵌舍状态变化数据,并帮助诊断了1例复发病人。结论：本研究建立的信息STR位点谱及检测方法,可以较准确地定量监控嵌合状态,成功用于临床干细胞移植工作,与商品化试剂相比,更便宜,在使用上更灵活。     

STR峰高与峰下面积在干细胞移植后状态判断的应用探讨

目的 探讨短串联重复序列（STR）信息位点的峰高与峰下面积在异基因造血干细胞移植后嵌合状态判断中的作用,寻找适合于异基因造血干细胞移植状态判断的指标.方法 分别采集两名无关供者及M2患者及其HLA全相合供者两组血标本,以白细胞含量为依据制备不同比例混合血样,提取DNA,使用STR试剂盒,建立PCR扩增体系,在ABI3100仪上检测扩增片段,筛选得到理想的信息位点,获取其峰高及峰面积进行移植嵌合率的计算.结果 各筛选位点以峰高或面积得出的模拟嵌合率间差异均无统计学意义,且各位点模拟嵌合率与制备的浓度梯度之间的相关系数均在0.9965以上.结论 峰高或峰下面积均可作为嵌合状态的定量监控指标.     

短串联重复序列基因位点检测对移植早期GVHD的诊断价值

目的 探讨短串联重复序列(STR)基因位点检测对移植早期GHVD的诊断价值.方法 10名白血病患者在移植前和移植后1、3、5、7、9、11、14、30 d采用STR检测的方法,并分析其检测结果.结果 其中7名患者STR基因位点检测,从最初的供者基因嵌合状态到30d最后1次检测,都是完全独立植入.另外3名患者嵌合状态从最初为零到无法检出,均有GVHD的发生.结论 STR基因位点检测反应供者基因植入的情况,提示患者复发和GVHD的发生,对临床早期诊断和治疗有一定的指导意义.     

异基因造血干细胞移植后复发慢性髓系白血病患者嵌合体和融合基因的动态观察

本研究利用STR—PCR结合RT—PCR定量和定性检测异基因造血干细胞移植（allo—HSCT）后患者嵌合体和融合基因的表达，分析其植入和微小残留病变情况，评价其对复发的预测价值。采用STR—PCR结合毛细管电泳进行定量检测嵌合体供体细胞嵌合率，采用RT—PCR方法检测融合基因转录本bcr／abl mRNA。结果表明：4例患者在移植后28天均为100％供者型嵌合，融合基因bcr／abl mRNA均为阴性。但在以后的随访过程中发现4例患者在不同时间出现不稳定混合嵌合（MC）状态（DC为0％-80．4％），融合基因bcr／abl mRNA阳性；其中2例复发后一直处于混合嵌合状态，另外2例在临床干预治疗后又转变为完全嵌合状态，目前处于分子生物学缓解状态。上述4例复发患者均在出现临床症状前发生供体细胞嵌合率（DC）下降；融合基因表达阳性。结论：STR—PCR在敏感范围内，其结果与RT—PCR的结果符合率高，两种技术的结合是一种检测异基因造血干细胞移植后供体是否植入的有效手段，对判断疾病复发及GVHD均有预警作用，对实施临床干预治疗有重要指导价值。     

用荧光标记短串连重复复合扩增技术监测骨髓移植存活

目的探讨荧光标记短串联重复(STR)复合扩增技术监测骨髓移植存活的价值,为观测骨髓移植疗效提供可靠方法。方法用荧光标记引物对D12S391、D18S865、D20S161这3个STR位点进行PCR复合扩增,用ABI310遗传分析仪对扩增后产物进行分离和分型,并对56例移植后病人做移植物存活鉴定检测。结果有52例移植后病人的3个STR位点的分型完全表现供者源性,与受者移植前不同;4例表现为供/受体干细胞混合嵌合状态。结论荧光标记STR复合扩增体系特异性强,成本低,个体识别力高,检测灵敏、快速、简便,结合临床判断可作为骨髓移植效果评定的有力指标。     

异基因造血干细胞移植后嵌合状态与白血病复发关系的研究

目的 探讨异基因造血干细胞移植（allo HSCT）后嵌合状态与白血病复发的关系。方法 回顾性分析2014年1月至2018年6月于我院行清髓性allo HSCT的成人白血病患者73例,采用短串联重复序列 聚合酶链反应（STR PCR）检测移植后+30、+60、+90天受者骨髓的供受者细胞嵌合率,分析嵌合率与复发的关系。结果 移植后+90天复发组嵌合率低于非复发组。移植后+60 d、+90 d低嵌合患者有较高的复发率（P=0.021,0.027）。多因素分析显示移植前疾病状态、+60d嵌合率、+90d嵌合率是白血病患者行allo HSCT后复发的独立危险因素。结论 Allo HSCT后嵌合状态对复发具有预测价值,+60、+90天低嵌合患者有较高的复发率。     

多重荧光定量PCR快速诊断唐氏综合征患儿

摘要:目的：探讨用多重荧光定量聚合酶链反应（QF-PCR）对唐氏综合征（DS）患儿进行快速诊断的可行性。 方法：对21号染色体上D21S1442、D21S1432、D21S11、D21S1435、D21S1412和D21S1809 6个短串联重复序列（STR）位点进行多重QF-PCR扩增,PCR产物进行毛细管电泳,用GeneMapper软件对STR DNA进行多态性分型,并对患儿外周血进行淋巴细胞培养和染色体核型分析。 结果：6个STR位点检测198例DS患儿的敏感性为99.0%,特异性为100%;181例标准型DS患儿共检出180例,检出率为99.5%;14例异位型DS患儿的检出率为100%;2例嵌合型DS患儿,检出1例;另检出1例特殊核型DS患儿。 结论：多重QF-PCR检测具有快速、准确等特点,可用于DS患儿的临床诊断。     

13个STR基因座在四川人群遗传多态性分布

目的 对四川人群的13个短串联重复（short tandem repeat,STR）基因座进行遗传多态性调查。方法 310份血样采自四川地区无血缘关系个体。Chelex法提取DNA,PCR复合扩增,自动基因分析仪电泳收集电泳结果数据,基因分型软件进行样本基因型分型。结果 13个STR基因座的基因型分布符合Hardy Weinberg平衡。累计非父排除率和累计个人识别率为0.999 991 728和〉0.999 999 999。结论 上述13个STR基因座的累计非父排除率和累计个人识别率较高,适合作为四川人群的遗传标记,用于法医学亲权鉴定和个体识别等领域的研究。     

异基因造血干细胞移植后细胞嵌合状态动态监测的临床意义

目的 研究异基因造血干细胞移植(allo-HSCT)后各系细胞嵌合状态与移植物植入、急性移植物抗宿主病(aGVHD)、移植物被排斥和疾病复发的关系.方法 对65例患者进行allo-HSCT,在移植后定期采集所有患者的外周血和骨髓.用流式细胞术分选了65例患者的CD3+T淋巴细胞,52例分选了CD3-CD56+CD16+NK细胞,32例分选了CD15+粒细胞,20例分选了CD19+B淋巴细胞.进行PCR扩增短串联重复序列检测各系细胞嵌合状态.结果 移植后NK细胞早期植入比例(55.5%)最高,T细胞最晚(+21 d)达到完全供者嵌合状态.+7 d T淋巴细胞供者嵌合比例(DC)≥70%和+14 d T淋巴细胞DC≥95%属aGVHD发生的高危患者.除急性淋巴细胞白血病外,出现移植物被排斥的分子生物学征象者和疾病复发者,都以T淋巴细胞供者嵌合状态下降为主.在过继免疫治疗中,动态检测嵌合状态可以判断疗效和指导进一步的治疗.结论 allo-HSCT后T淋巴细胞嵌合状态动态检测可以早期预测发生aGVHD的高危患者、判断移植物植入、发现移植物被排斥和疾病复发并指导免疫调节治疗的时机和疗效.