siRNA特异性抑制K562细胞Livin基因表达及其诱导凋亡作用

本研究探讨小分子RNA干扰技术抑制livin基因表达对白血病细胞系K562细胞凋亡的影响。设计合成livin特异性小干扰RNA(siRNA),核转染K562细胞,培养转染后的K562细胞,用RT-PCR检测livin mRNA的表达,Western blot检测Livin蛋白的表达。以未转染细胞作对照,同时转染带有增强型绿色荧光蛋白的载体作为阳性对照,用流式细胞术检测其细胞绿色荧光以确定转染效率。用膜联蛋白Ⅴ及碘化丙锭双染法检测细胞凋亡率。结果表明,电穿孔的转染效率可达50%。siRNA既可以抑制livin mRNA表达,也可以抑制livin蛋白表达。特异性siRNA转染细胞后48 h细胞凋亡率为(27.41±2.30)%,与对照组(9.63±0.89%)比较明显提高(P<0.05)。结论:SiRNA可以抑制livin基因的表达,并能抑制livin基因的抗凋亡作用。     

SH2B1沉默对胃癌SGC-7901细胞增殖、凋亡及PI3K/AKT通路的影响

目的研究沉默SH2B1基因表达对胃癌SGC-7901细胞增殖、凋亡及3-磷酸肌醇激酶(PI3K)/蛋白质丝氨酸苏氨酸蛋白激酶(AKT)通路的影响。方法体外培养胃癌SGC-7901细胞,采用SH2B1 siRNA转染SGC-7901细胞作为研究组,采用国际通用的与所有基因均无同源序列的non-target siRNA转染作为阴性对照组(NC组),以未经处理的胃癌SGC-7901细胞作为空白对照组(BC组),48h后收集各组转染成功细胞,采用荧光定量聚合酶链反应(qRT-PCR)检测SH2B1 mRNA表达情况,采用蛋白质印迹法(Western Blot)检测SH2B1蛋白表达情况;采用细胞计数试剂盒(CKK-8)检测细胞增殖情况,采用流式细胞仪检测细胞凋亡,同时检测Ki67、增殖细胞核抗原(PCNA)、Caspase-9、PI3K、AKT、p-AKT蛋白表达情况。结果研究组SGC-7901细胞SH2B1蛋白及mRNA表达量较BC组和NC组明显降低,差异有统计学意义(P<0.05);转染后,siRNA组SGC-7901细胞增殖明显受到抑制、平板克隆形成率较BC组和NC组明显降低,凋亡率明显升高,差异均有统计学意义(P<0.05);与BC和NC组比较,研究组SGC-7901细胞PI3K、p-AKT蛋白、Ki67及PCNA蛋白呈低表达,差异有统计学意义(P<0.05),Caspase-9蛋白呈高表达,AKT蛋白表达差异无统计学意义(P>0.05)。结论沉默SH2B1基因表达可能通过抑制PI3K/ATK信号通路激活,抑制SGC-7901细胞增殖,促进凋亡。     

肌醇5'磷酸酶基因突变对K562细胞周期蛋白和Akt磷酸化的影响

目的 从分子水平探讨肌醇5'磷酸酶(SHIP)基因突变对人白血病细胞系K562细胞周期及其相关基因表达的影响.方法 应用携带野生型和突变型SHIP及绿色荧光蛋白的慢病毒及空载体慢病毒质粒转染K562细胞,通过流式细胞术检测K562/SHIP细胞转染效率、细胞增殖指数及细胞周期变化;MTT法检测细胞增殖活性改变,实时荧光定量PCR(FQ-PCR)检测SHIP mRNA水平变化,Western blot检测各组K562细胞SHIP、细胞周期蛋白(cyclin)D1、p21WAF1/CIPI、P27KIP1蛋白表达水平及Akt磷酸化变化.结果 野生型SHIP基因能明显抑制K562细胞增殖,并产生明显的G0/G1期阻滞[G0/G1期细胞分别为(34.2±7.8)%和(0.7±8.3)%,P<0.01];但SHIP基因点突变并未影响K562细胞增殖及细胞周期改变[G0/G1期细胞分别为(33.4±4.2)%和(36.3±6.7)%,P>0.05].Western blot结果发现转染野生型SHIP基因后K562细胞Akt磷酸化和cyclin D1表达水平明显下降(P<0.01),p21WAF1/CIPI、p27KIP1表达增高,而突变型SHIP基因对Akt磷酸化水平和细胞周期蛋白表达几乎没有影响(P>0.05).结论 ①野生型SHIP基因通过下调K562细胞Akt磷酸化水平,进而抑制其下游cyclin D1表达,上调p21WAF1/CIPI和p27KIP1基因表达,导致细胞周期阻滞在G0/G1期,抑制K562细胞增殖;②SHIP基因突变体(TTC→CTC,Phe→Leu)丧失了对K562细胞的增殖抑制作用,提示SHIP基因对K562细胞增殖的负调控作用有赖于其基因结构和功能正常.     

活化Chk1引起的G2/M期阻滞在调节K562/A02细胞耐药中的机制探讨

本研究探讨活化的Chk1对白血病细胞周期及凋亡的影响,探究Chk1调控肿瘤细胞耐药的机制.以慢性粒细胞白血病细胞系K562及其耐药细胞系K562/A02(耐阿霉素)为研究对象,与阿霉素共孵育后,用流式细胞术检测细胞周期分布,RT-PCR检测Chk1mRNA表达水平,Western blot检测转染前后Chk1磷酸化水平;靶向Chk1shRNA抑制细胞内Chk1的表达后,用流式细胞术检测阿霉素作用后细胞的凋亡情况.结果表明阿霉素致K562/A02细胞阻滞在G2/M期的细胞百分率为(54.12±0.57)%,显著高于K562细胞(36.99±1.28)%; Chk1mRNA表达水平在K562与K562/A02细胞间无显著差异; Chk1磷酸化水平在K562/A02细胞为0.79 ± 0.56,在K562细胞为0.27 ± 1.47,其差异有统计学意义.转染Chk1shRNA后,两株细胞的Chk1磷酸化水平显著下降.转染组K562、K562/A02细胞凋亡率分别是空载体转染组的1.30倍和3.84倍.结论 Chk1的活化水平调控着K562/A02细胞对阿霉素的敏感性.     

CD44基因沉默对K562/A02细胞逆转耐药及生物学活性的研究

本研究旨在探讨CD44基因表达抑制对白血病多药耐药细胞株K562/A02耐药性及生物学活性的影响。根据CD44基因表达序列设计有效的RNA干扰片段,将其插入质粒表达载体中,获得针对CD44mRNA的特异性siRNA真核质粒(pGCsiRNA-CD44),转染K562/A02细胞。用实时荧光定量RT-PCR检测K562/A02细胞CD44、mdr-1和bcl-2mRNA的表达;用MTT法检测阿霉素对K562/A02细胞的半数抑制浓度(IC50);流式细胞术(FACS)检测细胞周期;Hochest33258染色荧光显微镜观察细胞凋亡的形态学变化。结果表明:针对CD44基因的siRNA真核质粒可有效沉默K562/A02细胞的CD44基因:与对照组相比,转染了4条pGCsiRNA-CD44质粒的K562/A02细胞CD44表达均明显受抑,以转染了siCD44-1的细胞中抑制最强。转染pGCsiRNA-CD44质粒48小时后,K562/A02细胞CD44mRNA表达水平下降64.1%(p0.05),同时mdr-1与bcl-2mRNA的表达量较对照组分别下降了25.6%与50.8%;K562/A02细胞IC50为(17.97±1.61)μg/ml,无义序列质粒转染后阿霉素对K562/A02细胞的IC50为(16.95±1.72)μg/ml,pGCsiRNA-CD44转染后IC50明显降低为(8.77±1.63)μg/ml(p0.01)。转染48小时后,G0/G1期细胞比例提高了10.7%;细胞出现核固缩、核边集、凋亡小体等改变。结论:特异性CD44siRNA可显著抑制K562/A02细胞CD44基因的表达,抑制细胞增殖,诱导其凋亡,并有效逆转K562/A02细胞的多药耐药性。     

RNA特异性干扰bcr-abl融合基因联合p27基因克隆对K562细胞的影响

本研究旨在探讨RNA干扰抑制慢性髓系白血病bcr-abl融合基因表达,以及RNAi和p27基因克隆联合作用对K562细胞的细胞增殖、细胞周期及凋亡等的调控作用。以细胞系K562为研究对象,合成并转染针对K562细胞bcr-abl融合基因融合位点的21nt siRNA,应用Northern blot法检测bcr-abl融合基因的表达,Western blot法检测BCR-ABL蛋白及凋亡相关蛋白BCL-xL的表达;同时应用RT-PCR扩增p27基因,构建P27-pcDNA3.1载体,转染p27基因入缺失p27基因的K562细胞,经筛选得到G418抗性的K562细胞株;经Western blot证实有P27蛋白表达后,联合应用RNA干扰及p27基因克隆,通过MTT法及流式细胞仪等检测联合作用后对K562细胞的细胞增殖、细胞周期及凋亡等的调控作用。结果表明,RNA干扰组K562细胞bcr-abl融合基因的表达水平明显下降,转染24小时时有18.4%的K562细胞发生凋亡,细胞凋亡相关蛋白BCL-xL的表达水平下调,出现明显的G1期阻滞;表达外源性P27蛋白的P27-pcDNA3.1-K562细胞株生长速度明显慢于对照K562细胞株。流式细胞仪检测显示,G0/G1期细胞增多,S期细胞明显减少;RNA干扰与p27基因克隆联合作用于K562细胞后,凋亡细胞比例明显上升(33.4%)。MTT法显示,细胞存活率较单纯p27-K562细胞组及RNA干扰-K562细胞组均明显下降(p0.01和p0.05)。结论:特异性siRNA分子可以抑制bcr-abl融合基因的表达,诱导K562细胞分化或凋亡。RNA干扰联合p27基因克隆对抑制K562细胞增殖及促凋亡方面具有协同作用。     

DLL4/Notch1配体过表达抑制K562细胞生长机制研究

本研究旨在探讨Notch1信号通路的配体delta-like ligand4（DLL4）基因过表达对K562细胞增殖的影响及其可能的作用机制.采用脂质体介导将含配体DLL4基因的质粒pBudCE4.1-DLL4转染K562细胞,通过RT-PCR和Western blot检测转染48 h后DLL4基因的mRNA及蛋白表达,同样检测转染后Notch1受体胞内区（NICD）、下游靶基因Hesl的mRNA及蛋白表达;通过Western blot检测与Notch信号通路相关的细胞转录因子YY1、原癌基因C-MYC及抑癌基因Rb蛋白的表达水平;用CCK-8法检测转染后细胞的增殖情况;用流式细胞术检测转染质粒48 h后各组细胞的凋亡情况.结果表明,DLL4基因转染后的K562细胞中DLL4、NICD及下游靶基因Hesl的mRNA及蛋白表达量比对照组明显增多（P＜0.05）,说明DLL4的过表达激活了Notch1信号通路;Western blot方法检测显示,DLL4的转染增加了细胞转录因子YY1、原癌基因C-MYC及抑癌基因Rb蛋白的表达,从而抑制了K562细胞的生长,诱导细胞周期停滞于G1期及细胞凋亡的增加.结论：外源性DLL4基因过表达可有效活化K562细胞内Notch1信号通路,可能通过YY1、C-MYC及Rb等Notch信号通路相关基因的高表达诱导K562细胞的生长减慢及细胞凋亡.     

硝普钠诱导K562细胞凋亡过程中STAT3/P38MAPK活化及端粒酶hTERT-mRNA表达的研究

为了研究外源性一氧化氮供体硝普钠（SNP）诱导K562细胞凋亡过程中STAT3及P38MAPK活化及端粒酶hTERT—mRNA表达的变化，探讨硝普钠诱导K562细胞凋亡机制，用Annexin—V／PI双标记、DNA片段原位末端标记法、DNA凝胶电泳、DNA含量及细胞周期分析等方法检测细胞凋亡。用流式细胞术测定经硝普钠干预后瞄62细胞磷酸化P38MAPK和磷酸化STAT3的表达，同时利用实时荧光PCR定量检测端粒酶hTERT—mRNA表达的变化。结果表明：K562细胞经硝普钠作用后出现典型的细胞形态改变，DNA片段化，显现亚G1峰Ⅱ并显著增加。Annexin—V／PJ和DNA片段原位末端标记表达增加。这些均证实NO能诱导瞄62细胞凋亡，大部分细胞阻滞于G0／G1期。SNP诱导K562细胞凋亡过程中，磷酸化P38MAPK和磷酸化STAT3的表达随SNP浓度的增加而表现为先增强后下降；瞄62细胞与2．0mmol／LSNP孵育不同的时间内，磷酸化P38MAPK的表达在12小时时达到高峰并持续至48小时，72小时后表达下降；磷酸化STAT3的表达在24小时时达高峰，48小时后表达即显著下降；端粒酶hTERT—mRNA的表达随SNP作用的浓度增加和时间延长而显著下调。结论：SNP能诱导K562细胞凋亡，其机制可能与P38MAPK的活化、抑制端粒酶逆转录酶和STAT3的活化有关。     

siRNA真核表达载体对白血病K562/ADR细胞凋亡的实验研究

目的特异性siRNA真核表达载体pSilenceneoMDR1和pSilenceneoGSTπ对白血病多药耐药细胞K562/ADR凋亡的影响。方法特异性siRNA真核表达载体pSilenceneoMDR1、pSilenceneoGSTπ共转染K562/ADR细胞,同时以空载体pSilencer2.1U6转染K562/ADR细胞(mock)作为对照。流式细胞仪检测细胞凋亡;MTT法检测阿霉素的半数抑制浓度(IC50)。结果流式细胞仪显示空载体pSilencer2.1U6转染细胞凋亡率为(11.65±4.06)%,pSilenceneoMDR1和pSilenceneoGSTπ共转染组细胞凋亡率(44.98±11.27)%,重组质粒转染组与空质粒转染组比较,差异有统计学意义,P<0.01。K562/ADR细胞对阿霉素的耐药指数为24,空载体转染后耐药指数为23,pSilenceMDR1、pSilenceGST共转染后耐药指数降低为7,半数抑制浓度(IC50)值分别从转染前(1.16±0.38)mol/ml下降为(0.33±0.04)mol/ml,重组质粒转染组与空质粒转染组比较,差异有统计学意义,P<0.01。结论siRNA真核表达载体pSilenceMDR1和pSilenceneoGSTπ可以诱导K562/ADR细胞发生凋亡,并且可有效逆转K562/Adr细胞株的多药耐药。     

酪氨酸激酶抑制剂通过下调Mcl-1和Bcl-xl诱导K562细胞凋亡

本研究观察酪氨酸激酶抑制剂STl571对CML细胞增殖和凋亡以及抗凋亡蛋白Mcl—l表达的影响，探讨Mcl一1在BCR／ABL抗凋亡信号传导中的作用。应用STl571处理慢性髓系白血病K562细胞株，采用台盼蓝拒染法和MTT法检测STl571对K562细胞增殖的影响，用AnnexinV和碘化丙锭双染法及流式细胞术检测K562细胞凋亡情况，蛋白印迹法检测STl571对细胞内蛋白酪氨酸磷酸化水平和凋亡相关蛋白表达的影响。结果发现：STl57l可有效地抑制K562细胞增殖并诱导K562细胞凋亡，这种作用呈剂量和时间依赖性，同时降低细胞内蛋白酪氨酸磷酸化水平和下调抗凋亡蛋白Mcl—l和Bcl-xl的表达。STl571抑制K562细胞增殖和诱导凋亡与抗凋亡蛋白Mcl—l和Bcl—xl的表达下调一致。结论：STl571通过阻断CML细胞内信号传导途径，下调Mcl—l和Bcl—xl的表达，抑制K562细胞增殖并诱导凋亡，表明Mcl—l和Bcl—xl一起在CML抗凋亡过程中发挥重要作用.     

shRNA干扰CIAPIN1基因表达促进K562细胞粒系分化

目的探讨靶向干扰CIAPIN1基因表达对慢性粒细胞白血病（CML）细胞系K562粒系分化的影响。方法针对CIAPIN1基因设计并构建短发卡RNA（shRNA）真核表达载体,转染K562细胞并作为干扰组,以无关序列shRNA处理的K562细胞作为对照组。采用Real-time PCR及Western blot技术鉴定干扰效率;采用瑞氏染色和电镜分别观测K562细胞形态学和超微结构的改变;采用Real-time PCR方法检测粒系分化标志基因中性粒细胞胞浆因子1（NCF1）、血清黏蛋白1（ORM1）以及粒系分化转录因子CCAAT/增强子结合蛋白（C/EBPα）、低氧诱导因子1α（HIF1α）mRNA水平的改变;流式细胞术检测K562细胞表面分化抗原CD11b表达的改变;Western blot技术检测ERK1/2、JNK、p38MAPK及Akt磷酸化水平的改变。结果与对照组相比,干扰组的CIAPIN1基因表达被有效抑制（P〈0.05）;K562细胞的形态和超微结构趋向成熟粒细胞阶段;NCF1、ORM1、C/EBPα及HIF1αmRNA表达水平升高（P〈0.05）;CD11b表达升高（P〈0.01）;ERK1/2磷酸化水平升高（P〈0.05）,而JNK、p38MAPK及Akt磷酸化水平未见明显改变。结论抑制CIAPIN1基因表达能促进K562细胞向成熟的粒细胞阶段分化,ERK1/2磷酸化水平的升高可能参与了该分化过程。     

核糖体蛋白L6对K562/A02细胞耐药性及凋亡的影响

本研究观察核糖体蛋白L6（RPL6）基因表达的改变对白血病细胞耐药性的作用及其可能的机制。通过RT-PCR方法获得RPL6 cDNA序列,用真核表达载体pcDNA3.1（＋）分别构建正向插入和反向插入的RPL6 cDNA重组质粒。以脂质体将正义RPL6 cDNA真核表达质粒转染K562细胞,将反义RPL6 cDNA真核表达质粒转染K562/AO2细胞。以MTT、流式细胞术和荧光分光光度计观察RPL6对化疗药物耐药性、凋亡和caspase-3的作用。结果表明：转染正义RPL6 cDNA真核表达质粒后,K562细胞对阿霉素的耐药性增强到原来的325%,凋亡和caspase-3活性明显降低（P〈0.005）;转染反义RPL6 cDNA真核表达质粒后,K562/A02细胞对阿霉素的耐药性降低原来的38%;凋亡和caspase-3活性明显增加（P〈0.005）。结论：RPL6基因过表达通过改变药物诱导的凋亡在K562/A02细胞耐药性的形成中起重要作用。     

MicroRNA-17-92 簇对 K562 细胞生物学特性的影响及机制初探简

本研究旨在探讨microRNA-17-92对K562细胞生物学特性的影响.以K562细胞系为模型,采用lipofectin2000转染miR-17-92 mimic,应用Q-PCR方法鉴定基因表达水平,CCK-8细胞增殖检测试剂盒检测K562细胞增殖活性,Annexin V-FITC/PI标记检测K562细胞的凋亡;细胞经过乙醇固定后利用流式细胞仪检测K562细胞周期变化,Western blotting检测相关蛋白Crk的表达.结果显示：K562细胞系转染miR-17-92 mimic后miR-17-92表达增高;miR-17-92高表达后K562细胞的增殖能力增强、在细胞周期方面由G1期向S期细胞增加;同时,miR-17-92 mimic能够抑制乏血清诱导的K562细胞凋亡;Western blot检测显示miR-17-92 mimic促进Crk蛋白的表达.结论：miR-17-92可以促进K562细胞增殖,抑制其凋亡并调控细胞周期变化.     

血管内皮生长因子对人慢性髓性白血病细胞系 K562细胞的抗凋亡作用

为了探讨血管内皮生长因子（VEGF）对人白血病细胞增殖的影响,用形态学、DNA断裂琼脂糖凝胶电泳、流式细胞仪（FCM）DNA倍体分析观察VEGF对As2O3诱导的K562细胞凋亡的影响;采用蛋白印迹法检测不同浓度的VEGF对K562细胞bcl-XL、Bax和caspase-3蛋白表达的影响;用RT-PCR方法检测上述条件下bcl-XL、Bax的mRNA变化.结果表明：VEGF能阻止K562细胞发生凋亡,与细胞周期分布改变无相关性（P＞0.05）;随着VEGF浓度的增加K562细胞bcl-XL的mRNA与蛋白表达上调,Bax的蛋白表达降低;激活pro-caspase-3→caspase-3被阻止或减少.结论：通过影响bcl-XL/Bax表达比率可能是VEGF抑制K562细胞凋亡的机制之一.     

线粒体神经酰胺酶上调K562细胞Bcl-2蛋白表达水平

最近，克隆了一种新的选择性定位于线粒体的神经酰胺酶，提示线粒体存在着神经酰胺代谢途径，可能对线粒体的功能，特别对凋亡产生影响。本研究将线粒体神经酰胺酶基因转染到K562细胞，以此了解线粒体神经酰胺酶的细胞生物学效应。以脂质体介导将含有线粒体神经酰胺酶cDNA的pcDNA3．1／His—CDase质粒转染到K562细胞，G418筛选阳性克隆，建立稳定表达线粒体神经酰胺酶的K562TC细胞株。用MTT法、annexin V／PI法、FCM及Westernblot分别检测K562与K562TC细胞在细胞毒药物抗性、血清剥夺耐受性及Bcl-2蛋白表达水平方面的差异。结果表明：虽然K562TC与K562细胞对阿霉素、足叶乙甙及亚砷酸的敏感性没有差异，但是K562TC细胞Bcl-2蛋白水平明显升高，抗血清剥夺能力明显增强。以硫代反义寡核苷酸特异性封闭K562TC细胞线粒体神经酰胺酶，下调Bcl-2蛋白表达水平；二甲基鞘氨醇(鞘氨醇激酶抑制剂，降低细胞内1-磷酸鞘氨醇水平)同样下调K562TC细胞Bcl-2蛋白表达水平，而1-磷酸鞘氨醇明显上调K562细胞Bcl-2表达水平。结论：线粒体神经酰胺酶将线粒体神经酰胺代谢为鞘氨醇，进而在鞘氨醇激酶作用下生成1-磷酸鞘氨醇，此代谢途径上调K562细胞Bcl-2蛋白表达水平。     

转染p21WAF1基因对K562白血病细胞系增殖的抑制作用

为了探讨p21WAF1基因对白血病细胞增殖的影响,构建了p21WAF1的逆转录病毒表达载体,通过FuGENETM6介导体外转染p21WAF1表达缺如的K562细胞。经筛选得到G418抗性K562细胞系,用RT-PCR和Western印迹检测到外源p21WAF1的表达,用活细胞计数观察细胞增殖情况,同时进行流式细胞术和软琼脂集落形成实验,结果表明,K562-p21WAF1的表达,用活细胞计数观察细胞增殖情况,同时进行流式细胞术和软琼脂集落形成实验,结果表明,K562-p21WAF1中可检测到P21WAF1蛋白及mRNA表达,细胞增殖明显减慢,G0G1期细胞数增多,细胞在软琼脂中的集落形成能力下降,以上结果表明,p21WAF1基因可抑制p21WAF1表达阴性的白血病细胞增殖,可能成为白血病基因治疗的靶基因。     

高三尖杉酯碱诱导K562细胞凋亡的时间节律性及其机制研究

本研究旨在观察高三尖杉酯碱（HHT）作用于K562细胞后不同时间点凋亡率的变化及其机制。HHT10ng／ml作用K562细胞后,用MTT法检测不同时间点的细胞增殖活力,Westernblot法检测caspase-3凋亡蛋白表达;流式细胞术检测BCL-2蛋白表达;应用透射电子显微镜观测细胞自噬。结果表明,HHT10ng／ml处理后的前5d,K562细胞增殖活性逐渐下降,但在第6天以后增殖活性又逐渐上升;同时激活型caspase-3蛋白从第1天至第7天逐渐增高,而在第8天明显降低（P〈0．05）;BCL-2蛋白表达水平则呈现先降低后升高（P〈0．05）的特点。细胞自噬体在HHT作用第8天明显增多。结论：HHT作用后,K562细胞凋亡水平变化呈现先升高后下降的特点,其机制与HHT作用后期K562细胞自噬水平升高有关。