三种全血基因组DNA提取方法的比较

目的：比较三种不同的DNA提取方法提取人全血基因组DNA对DNA提取效率、纯度以及PCR扩增的效果影响。方法：分别应用中山医科大学达安公司：DNA提取液，珠海黑马医学仪器有限公司DNA提取液，胍盐酸法三种不同的方法提取人全血基因组DNA。结果：三种方法提取的DNA纯度平均分别为：1．48，1．51，1．56，各组间差异无显著性。200μL全血中所提取DNA总量平均分别为1．6μg，2．3μg，4．1μg。用0．8％琼脂糖凝胶电泳鉴定胍盐酸法制备的DNA效果较其它两种方法好，PCR扩增效果差异不明显。结论：胍盐酸法提取的DNA总量明显高于其它两种方法，提取效率高，为三种全血基因组DNA提取方法中之首诜。     

聚合酶链反应—微孔板杂交技术用于乙型肝炎病毒DNA的检测

目的：建立乙肝病毒DNA的聚合酶链反应（PCR）－微孔板杂交法,使PCR结果判定更加客观。方法：我们使用煮沸裂解法提取模板DNA,将PCR引物5′端标记生物素,用PCR产物与包被有亲和素的微孔板结合,并与含荧光素特异探针杂交,酶标记抗荧光素抗体与之结合进行显色反应,通过测定其吸光度来判断结果,结果：所建立的PCR－微孔板杂交法的阳性检出率（68／160）比PCR－电泳地（60／160）高,检测时间约是Keller法的1／10。结论：该法较敏感、特异和客观地检测临床标本中的乙型肝炎病毒DNA。     

新型MGB探针特异性检测变形链球菌

目的:设计一种新型TaqManMGB探针,利用实时荧光定量PCR检测变形链球菌,提高PCR法检测变形链球菌的特异性,减少检测的假阳性。方法:提取6种不同链球属细菌的DNA,分别进行巢式PCR和TaqManMGB实时荧光定量PCR,比较两种PCR方法检测变形链球菌的特异性。巢式PCR第1轮扩增的引物是细菌16S rRNA基因通用引物,第2轮扩增使用变形链球菌16S rRNA基因可变区序列的特异性引物。TaqManMGB实时荧光定量PCR的引物与第2轮巢式PCR特异性引物相同,设计的MGB探针序列与变形链球菌16S rRNA基因中特异性序列相匹配,不与其他细菌的基因序列匹配。将变形链球菌标准株的DNA样本从2.5 mg/L至0.16μg/L按5倍梯度稀释,制备出实时荧光定量PCR的标准曲线。结果:变形链球菌和格氏链球菌在巢式PCR中均扩增出282 bp的DNA片段,出现假阳性结果。TaqManMGB实时荧光定量PCR能定量检出变形链球菌标准株和临床株,不检出其他链球菌,比巢式PCR特异性更好。TaqManMGB实时荧光定量PCR对变形链球菌DNA的最低检出浓度为20μg/L。结论:本研究设计出一种针对变形链球菌的TaqManMGB探针,建立利用TaqManMGB实时荧光定量PCR特异性检测口腔中变形链球菌的方法。     

3’末端碱基游移混合引物提高多变区基因片段PCR检测的阳性率

目的：通过使用3′末端碱基游移混合引物，减少引物末端错配，提高多变区基因片段的PCR检阅阳性率。方法：在HBV DNA P基因区设计一对检测阳性率相对较高的引物(原型引物)，在原型引物序列基础上将两根引物的3′末端分别截去1个或2个碱基，设计出两对参数与原型引物近似的突变引物。分别单独用原型引物和原型引物与突变引物组成的混合引物，在相同条件下对27份HBV DNA阳性标本行PCR，比较二者阳性率。用混合引物扩增4例拉米呋丁治疗无效患者血清HBV DNA，将扩增产物测序并评价3′末端错配对PCR的影响。结果：原型引物和混合引物检阅阳性率分别为70．4％(19／27)和85．2％(23／27)，两者差异非常显著(P＜0．05)。引物3′末端错配能导致PCR假阴性。结论：扩增保守性相对较差的基因片段，采用3′末端单个或多个碱基截短的引物，构成3′末端碱基游移混合引物，可以避免因3′末端错配产生的PCR假阴性，提高检测阳性率。     

厚朴的任意引物PCR指纹图谱分析

目的：鉴别中药材厚朴，凹叶厚朴及其常见的伪品和混淆品，方法：采用任意引物PCR（arbitrarily primed PCR,AP-PCR)技术扩增植物基因组DNA样品。结果：AP－PCR技术获得清晰可靠的DNA指纹图谱，根据琼脂糖凝胶上显示的DNA带型差异可迅捷地区分厚朴，凹叶厚朴及其伪品，混淆品。结论：为应用AP－PCR技术在分子水平上鉴别中药材厚朴，保证引种的准确性奠定了基础。     

巢式PCR检测梅毒螺旋体DNA方法研究

目的建立一种血清梅毒螺旋体DNA提取及PCR鉴定方法。方法基于化学热裂解法和柱式核酸提取原理进行血清梅毒螺旋体DNA提取。根据文献筛选优化引物建立巢式PCR检测体系,并对实验方法的特异性、抗干扰性、检测梯度进行评价。结果建立的实验方法特异性好、抗干扰性强,对TRUST为1：8以上的标本检测全部为阳性。结论提取梅毒螺旋体DNA及PCR鉴定有助于梅毒的快速诊断,对于血液中梅毒螺旋体增殖能力判断具有重大潜在应用价值。     

去甲二氢愈创木酸对恶性胶质瘤细胞基因组甲基化水平的影响及其意义

目的：探讨去甲二氢愈创木酸（NDGA）诱导人恶性胶质瘤细胞系SHG－44细胞分化过程中基因组甲基化状态改变及其意义。方法：合成甲基化敏感性AP－PCR引物,用AP－PCR方法检测SHG－44细胞基因组甲基化状态,观察NDGA诱导该细胞分化过程中甲基化水平的变化。结果：对照组基因组DNA经MspI酶解后AP－PCR扩增片段比HpaII酶解后的扩增片段小,几乎未见存留大片段,至少有3个片段与HpaII酶解片段不同。同一时相点HpaII酶解后扩增产物相比,NDGA处理后基因组DNA Msp I酶解后的扩增产物量较少、条带较多,且随时相点延长产物量逐渐增加,条带增多。结论：NDGA诱导人恶性胶质瘤细胞SHG－44细胞分化过程中基因组甲基化状态增高,推测基因组甲基化状态可能是NDGA诱导胶质瘤细胞分化的作用靶点之一。     

基因步移在分离蚊虫细胞色素P450启动子中的应用及意义

目的：快速扩增出白纹伊蚊溴氰菊酯抗性株CYP6N3基因（CYP6N3）上游启动子区序列。方法：根据本室已获得的白纹伊蚊CYP6N亚家族新成员CYP6N3全长cDNA的5′－末端核苷酸序列,设计2个反向特异引物（GSP1和GSP2）,利用4种限制性内切酶Dra I、EcoRV、PvuⅡ和Stu I分别消化白纹伊蚊溴氰酯抗性株高分子量基因组DNA,消化产物与适配子连接产生4种消化的DNA库（DL1、DL2、DL3及DL40,并分别以此为模板,进行基因步移。用特异引物GSP1与适配子引物AP1进行第1步PCR扩增,然后再以第1步PCR产物为模板、用内部特异引物GSP2与内部适配子引物AP2进行第2次PCR扩增。结果：第1步PCR结果显示：在上述4种消化文库中分别扩增出约806、2190、2206和3076bp的特异条带;第2步PCR结果与第1次PCR相类似,但各泳道主带扩增效率明显升高。结论：本实验已成功地获得了白纹伊蚊溴氰菊酯抗性株CYP6N3上游启动子区核苷酸序列及其4种限制性内切酶图谱。此外还对基因步移法是在昆虫细胞色素P450多样性及其参与杀虫剂抗性分子机理研究中的意义进行了讨论。     

几种水稻田土壤微生物总DNA提取方法的比较

目的：使人们在提取土壤总DNA时,可以根据不同的要求选用不同的方法。方法：选用了5种现在较常用的土壤微生物总DNA提取方法从水稻田土壤中提取总DNA,并对5种方法提取的DNA的质量和数量进行比较评价。结果：5种方法都可以从土壤中提取到长度大于48kb的DNA片段,但不同方法提取的DNA的产量存在明显差异。土壤总DNA都不需要纯化就可以用于PCR扩增,使用细菌16SrDNA基因的引物可以扩增得到相应的片段。结论：Bourrain法和Martin-Laurent法可以较快地提取出DNA,Martin-Laurent法提取的DNA的量最多,Tiedje法和Janssen法提取的DNA片段最大,Janssen法提取的DNA纯度最高,Reddy法提取的DNA的完整性和PCR扩增效果最好。     

用PCR技术直接检测白色念珠菌DNA的实验研究

目的建立和评价直接用PCR从血标本中检测白色念珠菌核酸的方法。方法用红、白细胞裂解液、破壁酶和真菌DNA提取盒直接处理血标本,得到的微量靶DNA用白色念珠菌种特异性引物进行扩增。结果在白色念珠菌制备的人血标本中检测出靶DNA,其敏感性达10个孢子/ml以下,从处理标本到报告结果仅需6h。结论用PCR法可特异、敏感地从血标本中直接检测白色念珠菌核酸,有助于临床快速诊断深部白色念珠菌感染。     

日本血吸虫基因组DNA的提纯与鉴定

本研究采用酚─氯仿法提纯了日本血吸虫基因组ＤＮＡ，并对基因组ＤＮＡ进行了定量分析及微电泳鉴定。结果表明，１００ｍｇ日本血吸虫成虫（湿重）可提纯出约８０μｇ的ＤＮＡ，其基因组ＤＮＡ的大小＞３１Ｋｂ。该法提取的血吸虫基因组ＤＮＡ较纯，适合于以后进行ＤＮＡ限制性核酸内切酶谱分析和Ｓｏｕｔｈｅｒｎｂｌｏｔ分析。     

DHCCR重组DNA细菌克隆

我们分别采用Ca~(2+)和Mg~(2+)处理大肠杆菌JM109进行转化实验,使含有1.25——双羟胆钙化醇受体(1,25—Dihydroxy cholecalciferol receptor,DHCCR)基因的质粒转化到细菌中进行克隆获得成功。经氨苄青霉素(AMP)培养基上筛选及限制性酶切分析,证明转化子为阳性。     

包裹质粒DNA及线状DNA脂质体的制备

本实验制备组成分别为DOPE/Chol/OA(4:4:3)的酸敏脂质体及DOPC/Chol/OA(4:4:3)脂质体,用于包裹质粒pSV_2-neo、pUC18-ras、pSV-neo-ras及大分子线状DNA,包裹率可达50％.被脂质体包裹的DNA不被DNase降解,提示DNA分子被脂质体包裹在微球体内部.电泳检测表明,被包裹的DNA分子没有断裂.所得到的脂质体较稳定,4℃放置5～6月,脂质体内仍保留部分DNA分子.制备酸敏脂质体时,pH为8.0时脂质体较稳定,pH<6.5～7时则不稳定.     

Rett综合征患儿一例多种组织的线粒体DNA突变分析

探讨线粒体DNA在Rett综合征发病中的作用。方法：利用Southern杂交、聚合酶链式反应（PCR）-单链构象多态性（SSCP）分析及DNA直接测序等方法．对一例Rett综合征患儿的外周血白细胞、死后的脑、骨骼肌组织及其母亲外周血白细胞的线粒体DNA的部分片段进行分析。结果：患儿3种组织及其母亲外周血白细胞的线粒体DNA上编码16SrRNA的2650～3000区域的DNA存在突变，进一步测序证实患儿3种组织均存在2706位点A→G的点突变。结论：提示线粒体DNA在Rett综合征的发病中起一定作用。     

饮水中不同浓度铅对小鼠脾淋巴细胞数量及其UDS的影响

６组小鼠分别饮用铅浓度为０、２、１０、２５、１００和２００ｍｇ／Ｌ的水３个月，以脾淋巴细胞数和脾淋巴细胞３Ｈ一ＴａＲ参入量为指标，观察其免疫功能和其ＤＮＡ损伤的非程序合成（ＵｎｓｃｈｅｄｕｌｅｄＤＮＡｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，ＵＤＳ）的变化。结果表明，浓度为１０ｍｇ／Ｌ以上组的脾淋巴细胞数和脾淋巴细胞ＵＤＳ与对照组相比，差异显著（Ｐ＜０．０５）。并且，饮水铅浓度增加与脾淋巴细胞数和脾淋巴细胞ＵＤＳ的降低之间，存在负相关关系，其相关系数分别为一０．６４和一０．７４。提示，减少饮水铅污染，对提高人群免疫功能和防止细胞突变有一定意义。     

慢性乙型肝炎病情再活动时血清HBV DNA水平的变化

目的 研究慢性乙型肝炎患者HBV复制水平与病情活动关系。方法 采用荧光标记定量PCR的方法,测定一组急性发作的慢性乙型肝炎患者(其中HBeAg阳性组38例,抗HBe阳性组22例)病情活动期和恢复期的血清HBV DNA含量。结果 血清HBV DNA含量在活动期明显高于恢复期(P＜0.05)。血清HBV DNA含量与丙氨酸转氨酶(ALT)、门冬氨酸转氨酶(AST)及总胆红素(T-BLLI)之间无相关性。结论 HBV DNA复制水平与慢性乙型肝炎的活动密切相关。     

人衰老相关DNA片段的筛选及特征分析

目的:探索衰老相关新基因.方法:采用RAPD法筛选衰老相关的DNA片段,采用Southern blot 分析基因状态,Northern blot 分析mRNA水平.结果:筛选出衰老特异的DNA片段,长894 bp,命名为sad.将sad片段克隆、测序,查询GenBank,确认为一种新的衰老相关序列,基因登录号为AQ324104.Southern blot分析表明,sad基因可能是一种单拷贝基因;sad在衰老2BS细胞中的Southern blot图谱不同于年轻细胞,而与人胃癌细胞系BGC-823类似.Northern blot分析显示,sad基因具有表达活性,其RNA长约0.5 kb,相对水平在各代龄的细胞间差异无显著性.结论:sad是一种新的与衰老相关的DNA片段,sad基因可能为单拷贝基因,具有表达活性.     

镉对大鼠胚胎损害作用的实验研究

目的 :探讨镉对大鼠胚胎的毒性效应及可能机制。方法 :雌雄性 SD大鼠按 2∶ 1同笼交配获取 38只孕鼠 ,随机分为 4组 (对照组 ,低镉组 ,中镉组 ,高镉组 )。分别在妊第7、1 0、1 3天经腹腔注射生理盐水和不同剂量的氯化镉 ( Cd Cl2 ) ,妊 2 1 d,剖宫取胎鼠 ,活杀取出胎鼠的肝、脑组织称重后测定 Cd、Zn、Ach、AKP、DNA含量。结果 :1高镉组未见存活胎鼠 ;2染镉组胎鼠肝中镉增加 ( P<0 .0 5 ) ,脑中锌有下降趋势 ;3染镉组胎鼠肝组织中的AKP活性 ,脑组织中的 Ach、DNA含量较对照组减低。结论 :1高剂量的镉可使孕鼠胚胎发育异常 ;2母鼠染镉可致胎鼠肝中 AKP酶活性降低及脑组织中 Ach、DNA含量减少 ,抗脂质过氧化能力减弱。     

不同年龄金黄地鼠外周血细胞非程序DNA合成及S期DNA合成的研究

本文采用未分离淋巴细胞的全血为样本,对不同年龄的金黄地鼠外周血细胞非程序DNA合成(UDS)以及S期DNA合成进行了研究,结果表明:10月龄组金黄地鼠外周血细胞UDS水平以及S期DNA合成均低于2月龄组,差异有显著性意义(P<0.01)。     

腹水DNA含量测定对良、恶性腹水的鉴别诊断价值

目的 研究腹水DNA倍体对良、恶性腹水的鉴别诊断价值。方法 运用流式细胞术（FCM）检测腹水的DNA指数（DI）,S期细胞百分比（SPF）,细胞增殖指数（PI）;采用化学发光分析法,检测腹水的CEA、CA19－9;腹水离心沉淀作细胞学检查。结果 恶性腹水组的DI、SPF、PI均高于良性腹水组（P＜0．05）;FCM法诊断恶性腹水的敏感性和特异性分别为91．7％和92．3％。细胞学、CEA、CA19－9诊断恶性腹水的敏感性分别为41．7％、41．7％、50％,特异性为100％、76．9％、84．6％,FCM联合CEA或CA19－9检测,敏感性为95．2％及95．8％,特异性为71％及78．1％。结论 腹水DNA含量测定诊断恶性腹水是一有效而敏感的方法,但存在一定的局限性;FCM联合CEA或CA19－9检测可提高诊断恶性腹水的敏感性。