利用RNAi抑制FHL2基因的表达

目的:构建FHL2基因的siRNA真核表达载体,观察其对FHL2蛋白表达的影响.方法:利用RNAi干扰技术,设计并合成了两条针对FHL2基因的siRNA,将其克隆到siRNA表达载体pSliencer 2.1-U6 neo上.将重组质粒和带FLAG标签的FHL2共转染293T人胚肾细胞,通过Western blot实验检验RNAi干扰效应.结果:经过酶切和测序证明,成功构建了FHL2 siRNA真核表达载体.通过Western blot证明,构建的siRNA能有效抑制FHL2基因的表达.结论:成功地构建了FHL2基因的siRNA真核表达载体,转染细胞后能有效地抑制FHL2基因的表达.     

RNAi双沉默Survivin和hTERT基因抑制人结肠癌SW480细胞增殖促进凋亡

目的探讨双向沉默Survivin和h TERT基因对结肠癌SW480细胞增殖和凋亡的影响,为结肠癌的基因治疗提供实验依据。方法设计并构建能够稳定转录shRNA并可分别及联合干扰Survivin和h TERT分子表达的质粒,将其转染结肠癌SW480细胞后,分阴性对照组、空白质粒对照组、Survivin RNAi组、h TERT RNAi组和Survivinh TERT RNAi组。转染48h后TRAP-PCR-ELISA法检测端粒酶活性,RT-PCR法检测Survivin和h TERT mRNA的表达,Western blot检测Survivin和h TERT蛋白的表达,流式细胞仪及cck-8法分别检测细胞凋亡和细胞增殖的变化。结果 Survivin-h TERT RNAi组SW480细胞端粒酶活性明显下降(P0.01),Survivin-h TERT RNAi组Survivin及h TERT的mRNA水平较正常对照组分别减低82.8%和73.6%(P0.01),蛋白表达抑制率分别为79.2%和66.7%(P0.01)。实验各组中Survivin-h TERT RNAi组细胞增殖抑制率和凋亡率最高,分别为43.6%±0.1%和39.2%±2.3%(P0.01)。结论 Survivin和h TERT双干扰质粒可明显下调Survivin和h TERT蛋白的表达,抑制结肠癌SW480细胞的增殖,促进其凋亡。     

RNAi技术抑制HCMV-IE1表达的在体实验研究

目的:研究RNA干扰(RNA interference,RNAi) 对体内人类巨细胞病毒-立即早期基因1(human cytomegalovirus immediate-early gene 1,HCMV-IE1)表达的沉默作用,为靶向HCMV-IE1的基因治疗提供科学的实验依据.方法:选取60只雄性昆明种小鼠,并分为3组,分别为实验对照组(注射生理盐水)、病毒感染组(注射HCMVAD169株病毒液)和RNA干扰组(染毒后第2天注射转染了表达RNAi载体的人胚肺成纤维细胞液);采用PCR法检测小鼠体内HCMV基因的表达水平;采用ELISA检测动物血清中HCMV-IgM的含量;采用免疫组织化学和Western免疫印迹技术分别测定小鼠体内HCMV-IE1的蛋白水平.结果:PCR结果表明干扰组比病毒感染组的HCMV的基因表达下调20%;ELISA结果表明RNAi能使动物血清中HCMV的含量降低为19%;免疫组织化学和Western免疫印迹结果证实,干扰组和病毒感染组的HCMV-IE1蛋白水平分别降低为17.6%和18.5%.结论:RNAi技术能有效地抑制目的基因在体内的表达,有可能用于靶向HCMV-IE的基因治疗.     

应用RNAi抑制细胞中绿色荧光蛋白的表达

目的 在293T和Mel细胞中研究RNA干扰（RNA interference，RNAi）对绿色荧光蛋白（enhanced green fluorescent protein，eGFP）表达的沉默作用。方法 以巢式PCR方法从人胚肾293T细胞中克隆出依赖于RNA聚合酶Ⅲ的H1启动子，并用于驱动RNAi片段的合成；构建能抑制eGFP特异性表达的RNAi载体（TRl）。将eGFP载体和RNAi干扰载体共转染293T和Mel两类细胞中，应用荧光显微镜观察、逆转录-PCR、荧光辅助细胞分选技术和定量逆转录-PCR方法分析上述细胞中RNAi对eGFP表达的抑制情况。结果 RNAi载体能有效地使293T和Mel细胞中红系特异的eGFP表达量均降低约50％以上。结论 本文构建的RNAi载体能有效的抑制目的基因eGFP在细胞中的表达。     

CTNNB1基因沉默抑制结肠癌SW480细胞生长的研究

目的探讨人结肠癌SW480细胞的CTNNB1基因沉默效应和对细胞生长的抑制作用。方法构建靶向CTNNB1的shRNA载体质粒,然后转染入结肠癌SW480细胞。用RT-PCR和Western Blot方法检测CTNNB1的mRNA和蛋白的表达情况。MTT实验评价转染后各组细胞的增殖情况。结果靶向CTNNB1的shRNA能够明显下调CTNNB1mRNA和蛋白质表达(P0.05),其抑制率分别是38.29%和42.86%。MTT实验提示转染了特异性CTNNB1shRNA的CTN实验组细胞在转染后呈现随着时间延长而进行性生长抑制的现象。在转染后72h,CTN组的细胞存活率为43.7%,与空白对照组相比有显著性降低。结论靶向CTNNB1的特异性shRNA对结肠癌SW480细胞具有下调CTNNB1基因表达,并显著抑制细胞增殖的效应。     

利用不同方法检测RNAi抑制人pescadillo基因的表达

目的:构建人pescadillo(PES1)基因siRNA的真核表达载体,观察其对PES1表达的影响。方法:利用RNA干扰(RNAi)技术,设计并合成了2条针对PES1基因的siRNA,将其克隆到siRNA表达载体pSliencer2.1-U6neo上。分别用以下3种方法检测RNAi的抑制效果:(1)将RNAi重组质粒和带FLAG标签的PES1共转染293T人胚肾细胞,用FLAG抗体进行Western blot;(2)将RNAi重组质粒和带GFP标签的PES1共转染293T细胞,用荧光显微镜观察GFP的亮度;(3)在293T细胞中仅转染小干扰RNA(siRNA)重组质粒,用PES1抗体进行Western blot分析。结果:测序证明,成功构建了PES1siRNA真核表达载体。通过Western blot实验证明,构建的siRNA能有效抑制外源性及内源性PES1基因表达;荧光显微镜检查发现siRNA能明显减弱细胞中荧光强度,抑制PES1的表达。结论:成功地构建了PES1siRNA的真核表达载体,利用3种不同方法均证明该siRNA能有效地抑制PES1基因的表达。     

RNAi沉默Cripto基因对结肠癌细胞血管内皮生长因子的抑制

目的：研究Cripto基因对结肠癌细胞血管内皮生长因子的影响。方法:设计合成针对Cripto基因的小干扰RNA(small interfering RNA，siRNA)，转染结肠癌LS-174T细胞。细胞分4组：空载对照组（对照组）和不同浓度（3.125、6.25和12.5 nmol/L）的siRNA组。分别于转染24、48、72 h后收集细胞，以实时定量PCR检测结肠癌细胞Cripto mRNA，分别采用Northern blotting和免疫荧光标记法检测癌细胞VEGF mRNA和蛋白表达。分别收集转染72 h的12.5 nmol/L组和对照组细胞，接种于裸鼠背部。30 d后处死裸鼠，收集裸鼠肿瘤组织，对组织VEGF进行免疫组化染色，计算染色平均强度。结果:实时定量PCR检测显示，转染组Cripto mRNA被有效地抑制，且呈浓度和时间依赖性。转染组细胞VEGF 蛋白和mRNA明显低于对照组。裸鼠肿瘤免疫组化分析显示，转染组VEGF平均染色强度明显低于对照组。结论:Cripto基因参与了结肠癌组织血管生成的调控。采用siRNA下调Cripto基因表达，可抑制结肠癌组织血管生成。     

应用RNA干扰技术抑制人胃癌细胞环氧合酶-2基因的表达研究

目的 研究应用RNA干扰技术进行抑制胃癌SGC-7901细胞COX-2的表达研究。方法 依据siRNA设计原则,针对人COX-2的mRNA序列,设计并合成3条21bp的双链RNA,瞬时转染人胃癌细胞SGC-7901,Western blot验证基因沉默效率以筛选合适的siRNA序列;根据筛选出的有效序列,合成编码短发卡RNA的双链寡核苷酸,定向克隆到含有U6 RNA聚合酶Ⅲ启动子的pSilencer? 2.1-U6 neo 真核表达载体,稳定转染胃癌细胞SGC-7901中,经G418筛选,获得克隆细胞。 结果 筛选出一条有效的干扰序列,位于291-311bp,成功构建表达载体,COX-2在蛋白水平的表达明显被抑制。结论：利用化学合成siRNA进行初筛,再构建shRNA表达载体,可快速实现目的基因的表达抑制。     

HIF-1α基因RNA干扰对肝癌HepG2细胞VEGF表达的抑制

缺氧诱导因子-1(HIF-1)是细胞缺氧反应网络的关键调节转录因子,而HIF-1α是决定HIF-1 活性的亚单位.HIF-1能在缺氧条件下促进血管内皮生长因子(VEGF) 依赖性的肿瘤血管形成.本研究构建了针对HIF-1α的pSUPER-EGFP siRNA表达载体,抑制HepG2细胞HIF-1α的表达.RT-PCR和Western blot蛋白印迹检测结果显示,RNA干扰能明显抑制HIF-1α的表达;在缺氧培养条件下,HepG2细胞中VEGF有较高的表达,当HIF-1α基因表达被有效抑制,VEGF mRNA和蛋白质的表达随之大幅下降.本研究结果表明,HIF-1α是血管生成因子VEGF表达的调节因子,通过RNA干扰导致的HIF-1α基因抑制,能下调VEGF的表达,提示HIF-1α基因可作为抗抑制VEGF依赖性的肿瘤血管生成的一个靶点.     

D-siRNAs抑制A549细胞COX-2表达

目的 长片段双链COX-2 RNA(dsRNAs)在体外经Dicer酶消化获得小RNA(D-siRNAs)抑制A549细胞COX-2的表达.方法 (1)IL-1β5 g/L干预A549细胞,Western blot法观察其COX-2蛋白表达的时间依赖性.(2)Trizol法抽提A549细胞总RNA,RT-PGR扩增COX-2基因.(3)设计两端带T7 promoter,SP6 promoter的COX-2 cDNA的PCR引物,通过PCR方法,获得两端带,T7及SP6 promoter的COX-2 DNA.(4)用RiboMAX Large Scale RNA Produc-tion Systems-SP6 and T7试剂盒体外将COX-2 DNA转录为RNA.(5)长片段COX-2 RNA经Dicer酶消化为小RNA(D-siRNAs).(6)用TransMessenger Transfection Reagent将D-siRNAs转染A549细胞.(7)COX-2 mRNA表达用RT-PCR检测,细胞培养上清液中PGE2含量用ELISA测定.结果 (1)IL-1β干预A549细胞9 haCOX-2表达到高峰.(2)在体外,长片段COX-2 dsRNAs经Dicer酶消化获得D-siRNAs.(3)D-siRNAs可有效抑制A549细胞COX-2的表达并降低PGE2的分泌.结论 长片段双链COX-2 RNA(dsRNAs)在体外经Dicer酶消化获得小RNA可有效抑制A549细胞COX-2的表达.     

RNAi knockdown of C-erbB2 expression inhibits salivary gland adenoid cystic carcinoma SACC-83 cell growth in vitro

Objective

To knockdown the C-erbB2 gene in salivary gland adenoid cystic carcinoma SACC-83 cells using RNA interference, and determine the effect of silencing C-erbB2 on cell proliferation.

Methods

C-erbB2-siRNA was transfected into SACC-83 cells. RT-PCR and immunohistochemistry were used to detect C-erbB2 expression in SACC-83 cells. Cell proliferation was measured by the MTT assay and gene knockdown was achieved by RNA interference. Apoptosis was analyzed by flow cytometry.

Results

Compared with the control, C-erbB2 mRNA expression was decreased in the C-erbB2-siRNA transfection group, and immunohistochemical analysis indicated that C-erbB2 protein expression was decreased. After C-erbB2-siRNA was transfected for 48 h, absorbance at 570 nm (MTT) was 0.185±0.021 compared with 0.354±0.034, 0.299±0.053, and 0.314±0.049 in the blank control, liposome control and negative control siRNA groups, respectively. The differences were statistically significant (P < 0.05) between the C-erbB2-siRNA group and the control groups. Following the C-erbB2 knockdown, the percentage of apoptotic cells was 5.63% compared with 2.04%, 2.85%, and 2.98% in the three control groups, respectively. Proliferation of SACC-83 cells was inhibited, and early apoptotic cells were increased.

Conclusion

RNA interference can effectively silence C-erbB2 gene expression and inhibit growth of SACC-83 cells, which indicates the potential of targeting this gene as a novel gene therapy approach for the treatment of salivary gland adenoid cystic carcinoma.     

Inhibition of HIV-1 expression by HIV-2

HIV-1 and HIV-2 are co-endemic in certain geographic areas. HIV-2 is more weakly pathogenic than HIV-1, and progression to AIDS occurs less frequently and over a longer period of time. Recent epidemiologic studies suggest that individuals infected with HIV-2 have a lower risk of HIV-1 infection. Both immune mechanisms and various modes of viral interference have been proposed to account for these results. Our findings, described in this paper, suggest that HIV-2 inhibits HIV-1 replication. To study the molecular interactions between HIV-1 and HIV-2, proviral clones were transfected alone or in combination into the human T cell line CEM. LTR-CAT indicator constructs were included for the purpose of monitoring viral promoter activity. Viral replication in transfected cells was monitored by p24 antigen capture assay of cell culture supernatants and Western blot analysis of cell extracts. HIV-2 inhibited HIV-1 replication as determined by intracellular and extracellular p24 antigen levels. Similar results were obtained with simultaneous virus infection using HIV-1 and HIV-2, rather than transfections of proviral DNA. Using cotransfection of HIV-1 and HIV-2 LTR indicator gene constructs, the mechanism of inhibition was found to be suppression of the HIV-1 LTR by HIV-2. The inhibitory effect of HIV-2 is not due to Tat-2, but appears to discriminate between the HIV-1 and HIV-2 LTRs based on differences in the Tat activation response element, TAR. These results suggest both a molecular mechanism for HIV-2 interference with HIV-1 replication and a potential molecular approach to therapy.     

联合靶向小干扰RNA对疱疹病毒2感染的体外抑制作用

目的 探讨联合靶向特异性小干扰RNA(siRNA)对疱疹病毒(HSV)2的体外特异抑制作用.方法 将体外合成的靶向HSV-2编码包膜糖蛋白gB的UL27.2基因、靶向DNA结合蛋白UL29.2基因的siRNA和该两种联合靶向特异性siRNA制剂,共转染Vero细胞并感染HSV-2,观察靶基因的表达情况、Vero细胞病变、空斑减数实验和子代病毒滴度并进行各组间比较:结果特异性UL27.2siRNA、UL29.2 siRNA和联合siRNA转染Vero细胞后,均能不同程度抑制各HSV-2临床株感染所导致的细胞病变,对病毒增殖抑制率分别为63.9%、86.7%和93.3%.实时定量PCR检测各组siRNA分别对UL27.2和UL29.2两个基因的表达,结果显示UL27.2 siRNA和UL29.2 siRNA对各自的靶向基因均有抑制,而联合靶向siRNA制剂对两个基因的抑制率最高.结论 联合靶向特异性siRNA制剂能有效抑制HSV-2的感染和复制.     

Hsp701A基因的RNA干涉对HepG2细胞化疗敏感性的影响

目的：研究Hsp701A基因靶向siRNA表达载体对肿瘤细胞化疗药物敏感性的影响。方法：构建Hsp701A靶向小干涉RNA（siRNA）的真核表达载体，并转染HepG2细胞，以证实siRNA真核表达载体RNAi的有效性。用四唑蓝（MTT）比色法检测HepG2细胞对白藜芦醇、顺铂的敏感性。结果：以构建的Hsp701A基因靶向siRNA的真核表达载体稳定转染HepG2细胞后，两种RNAi组细胞中Hsp701ARNA和蛋白的表达水平均明显下降。Hsp701A基因靶向siRNA真核表达载体转染后，HepG2细胞对不同化疗药物的敏感性有不同程度的增加（P〈0．05）。结论：Hsp701A基因的RNA干涉可增强HepG2细胞对化疗药物的敏感性。     

AAV载体质粒介导的荧光素酶shRNA抑制其在哺乳动物细胞中的表达

目的 构建荧光素酶短发夹环产生质粒在BHK—21细胞中抑制荧光素酶的表达。方法 从人基因组DNA中用PCR方法调出人U6 snRNA启动子，接以被9bp序列间隔的21bP荧光素酶靶序列的反向重复序列，置于AAV载体质粒PSNAV中，构建成荧光素酶短发夹环RNA(shRNA)产生质粒PSNAV／U6/Luc。与PMAMneoLuc质粒共转染BHK—21细胞，检测其对荧光素酶表达的影响。并且单独转染荧光素酶细胞株，检测其抑制荧光素酶表达的效果。结果 PSNAV／U6／Luc对共转染的PMAMneoLuc中荧光素酶的表达抑制50％，而对荧光素酶细胞株中荧光素酶的表达抑制70％。结论 实验表明荧光素酶shRNA产生质粒能够有效抑制荧光素酶在BHK—21细胞中的表达。     

质粒介导的RNAi技术对截短HCMV IE2基因表达的抑制作用

目的 应用质粒介导的RNA干扰技术研究siRNA抑制截短HCMV IE2基因的表达的作用。方法 以pLL3．7质粒为模板，采用半套式PCR的方法扩增出含U6启动子的siRNA表达片段，连接pMD-T simple vector构建效应质粒表达重组体pMD-T-shRNARI和pMD-T-shRNAR2。同时采用RT-PCR方法从HCMV AD169株基因组中调取目的截短基因IE2，定向克隆到带有绿色荧光蛋白（GFP）作为报告基因的真核表达载体pEGFP-C1上，构建HCMVAD169株截短IE2基因重组表达质粒pEGFP-C1-IE2；用脂质体共转染效应质粒和靶基因表达重组体至Hep-2细胞中，荧光显微镜下观察效应质粒的RNA干涉作用，并观察RNA干扰的时效和量效改变。结果 三组质粒重组体构建成功，克隆到的2个shRNA表达载体对截短IE2基因的表达都有干涉作用。在与靶基因质粒量比为1：1和1：2时，其中pMD-T-shRNAR1 48～72h间干涉效应为100％，可完全封闭IE2的表达；pMD-T-shRNAR2使IE2处于极低水平表达，48～72h间干涉效应达到98．4％～99％。结论 通过质粒介导的RNAi技术能够有效地抑制HCMVIE2基因的表达，为治疗HCMV感染的药物开发提供了思路。     

腺病毒载体介导的RNAi对SK-BR-3细胞c-Met表达的影响

目的:通过腺病毒载体介导的RNA干扰技术抑制乳腺癌细胞HGF受体c-Met的表达,抑制乳腺癌细胞增殖、诱导细胞凋亡。方法:PCR法获得人U6启动子及带有c-Met反向互补靶序列的片段HU6shmet;利用腺病毒载体将其传递至SK-BR-3细胞;RNA狭缝杂交检测SK-BR-3细胞c-Met mRNA水平,Western印迹检测c-Met蛋白水平。结果:获得了带有人U6启动子及c-Met反向互补靶序列的重组腺病毒载体rAdUshmet1和rAdUshmet2。转导了重组腺病毒的SK-BR-3细胞的c-Met mRNA和蛋白相对表达量均有所下降。结论:腺病毒载体rAdUshmet通过抑制HGF受体c-Met表达,能在一定程度上阻断HGF-c-Met信号转导通路,有可能成为对乳腺癌进行基因治疗的有效载体。