cDNA文库构建方法新进展

用核酸，抗体探针筛选ｃＤＮＡ文库是早期寻找基因的主要手段，也是目前克隆功能相关基因的ｃＤＮＡ的常用方法。本文在经典ｃＤＮＡ文库基础上发展而来的减数ｃＤＮＡ文库，标准化ｃＤＮＡ文库、染色体及其区域特异性ｃＤＮＡ文库构建方法的新进展作一综述。     

胃癌下调基因组cDNA抑制消减文库的建立及鉴定

目的 建立胃癌下调基因组cDNA抑制消减文库并鉴定。方法 采用高灵敏度的抑制消减杂交技术，建立五人份正常胃粘膜mRNA(Tester)抑制消减杂交胃癌mRNA(Driver)的差异表达文库，用PCR及差异表达克隆菌转膜反向杂交判定其消减效率。结果 所构建胃癌下调基因抑制消减杂交cDNA文库，消减效率高，胃癌下调基因在正常胃粘膜及胃癌组织中的差异表达符合率达86％。结论 成功建立了用于筛选胃癌下调基因的抑制消减杂交cDNA文库。     

Gateway非放射标记法构建小鼠破骨细胞前体细胞cDNA文库

背景：作者前期研究发现一个在破骨细胞形成中起关键作用的基因,其在细胞之间相互识别及膜融合中发挥关键作用。 目的：采用Gateway的非放射标记技术构建小鼠破骨细胞早期形成细胞的cDNA基因文库,并检测文库质量。 方法：采集C57BL/6小鼠长骨骨髓,收集贴壁的骨髓单核细胞,加入巨噬细胞集落刺激因子和RANKL诱导形成破骨细胞,在巨噬细胞开始融合至形成破骨细胞的不同阶段开始收集细胞,提取总RNA,用CloneMiner TM cDNA文库构建试剂盒,采用非放射标记方法构建小鼠破骨细胞全长cDNA文库。 结果与结论：构建的小鼠骨髓巨噬细胞cDNA文库滴度为2.15×107 CFU/ mL,库容量为10.5×107 CFU,重组率为100%,重组子插入cDNA平均片段大小约为1.7 kb,范围为0.1~5.8 kb。表明非放射标记法构建同样可以构建小鼠骨髓巨噬细胞全长cDNA质粒文库,避免了放射性物质的接触,且文库质量良好。     

PCR技术在cDNA文库构建中的应用

c DNA文库在基因分离和克隆中具有重要作用。近年来 ,随着分子生物学技术的发展 ,c DNA文库的构建方法有了许多改进和提高。尤其是 PCR技术的发明和引进使从少量来源的组织和细胞中构建 c DNA文库成为可能。本文就 PCR技术在 c DNA文库构建中的应用方面的进展作一综述。     

骨质疏松症骨组织cDNA差减文库的构建

目的构建人抑制差减文库,为筛选骨质疏松骨相关基因奠定基础。方法分别从正常骨和骨质疏松症骨组织分离mRNA并反转录成cDNA,酶切后骨质疏松cDNA分成两组,分别与不同的接头连接。经过两轮差减杂交和两次抑制性PCR后得到两者之间差异表达的cDNA挑取克隆进行PCR扩增鉴定。结果成功地构建了骨质疏松相关的的差减cDNA文库,获得的正、反向差减文库分别含652、345个重组子;插入片段的平均大小为526bp。结论该差减cDNA文库的建立为进一步在分子水平上阐明骨质疏松症的分子机制奠定了基础。     

人骨肉瘤9901细胞cDNA表达文库的构建和鉴定

目的:构建骨肉瘤9901细胞cDNA表达文库,为筛选骨肉瘤特异性抗原创造条件。方法:从9901细胞中提取总RNA,分离mRNA,反转录合成双链cDNA,末端削平,和EcoR I适配子连接。磷酸化EcoR I适配子5’端,过Sephacryl一S400柱除去小于400 bp的cDNA片段,与噬菌体λgt11(载体)连接,用包装蛋白体外包装后形成初级cDNA文库。取适量包装体系倍比稀释后感染E.coli Y1090,测定文库克隆数、重组率,用PCR法测定cDNA插入片段的大小。最后扩增cDNA文库。结果:建成含1.5×106个重组子的骨肉瘤9901细胞cDNA表达文库,重组率为94.3％。重组子中插入的外源片段不小于 0.5 kb,平均长约1.4 kb。结论:达到良好文库的质量标准,适合进一步筛选目的cDNA克隆。     

cDNA文库的构建方法及实验应用

自 70年代首例ｃＤＮＡ克隆问世以来 ,已用构建和筛选ｃＤＮＡ文库的方法克隆了很多基因。最初的ｃＤＮＡ克隆技术主要适合于获得高丰度ｍＲＮＡ的拷贝 ,即通过使用相应的核酸或抗体探针来筛选富含该ｍＲＮＡ的组织ｃＤＮＡ文库来克隆目的ｃＤＮＡ ,但对于那些低丰度ｍＲＮＡ的拷贝 ,通常需要筛选文库有大量克隆 ,才能获得相应的ｃＤＮＡ ,近年来已发展了一些ｃＲＮＡ文库构建的新方法和新技术 ,主要有 :减数ｃＤＮＡ文库、标准化ｃＲＮＡ文库 ,以及染色体及其区域特异性ｃＤＮＡ文库的构建方法 ,这 3种特殊的ｃＤＮＡ文库构建方法用不同的…     

cDNA文库构建策略

随着cDNA文厍应用的日益广泛,其构建方法也有了很大改进和提高。获得完整和均一的mRNA是构建成功的基础,合成cDNA时可根据不同目的选择相应的反转录酶和方法,用于构建的载体也由质粒发展到噬菌粒并各有其利弊,双链cDNA克隆前应视连接方案进行末端修饰和分级分离,克隆时则需把握cDNA和载体的比例。近来发展起来的PCR介导的cDNA文库、消减cDNA文库、标准化cDNA文序和染色体或区域特异性cDNA文库进一步满足了不同的分子生物学需要。     

大鼠损伤性周围神经组织cDNA文库的构建

为克隆神经损伤及再生过程中出现的诱向因子和营养因子基因，以ＳＤ大鼠手术损伤的坐骨神经组织为材料，提取ｍＲＮＡ，逆转录合成ｃＤＮＡ，以λｇｔ１１为载体，构建了一个ｃＤＮＡ文库。     

人类纤维化心脏瓣膜噬菌体表达文库的构建及质量分析

目的: 各种病因引起的心脏瓣膜纤维化是导致心脏瓣膜功能丧失的主要原因,样本来源有限和不可重获性是其分子机制研究的瓶颈。本研究旨在成功获取患者纤维化瓣膜的遗传信息物质,为探明瓣膜病变的分子机制提供直接证据。方法: 心脏换瓣手术中取纤维化瓣膜组织,提取高质量RNA,用SMART技术合成cDNA第1链,再用长距离PCR合成双链cDNA,经 Sfi I酶切后过柱分级收集长片段cDNA,经T4 DNA连接酶催化连接入λTriplEx2载体,最后经λ噬菌体包装后构建成原始文库,用PCR、X-gal等方法进行文库质量鉴定。 结果: 成功构建了纤维化心脏瓣膜噬菌体表达文库,原始文库滴度为8× 10⁹ pfu/L,重组率为99%,外源基因片段大小在500到3 000 bp之间,其中81.25%片段大于1 000 bp。 结论: 成功构建了高质量的人类纤维化心脏瓣膜噬菌体表达文库,该文库的库容量足够代表人类基因的复杂性,高重组率能保障功能筛选的高效性,长片段更有助于全长基因的获得和表达。     

Construction of cDNA library from NPC tissue and screening of antigenic genes

To construct cDNA library of nasopharyngeal carcinoma (NPC) and obtain the NPC associated or specific antigens from it, we used a powerful new method to identify the antigens eliciting humoral immune response, which is SEREX (serological identification of antigen by recombinant cDNA expression library). Autologous serum of NPC patient was used to screen the reactive clones in the human NPC tissue cDNA library consisted of 3.64×106 recombinants. The 23 exact positive clones were subcloned to monoclonality and the size of cDNA inserts was identified by PCR. Then the nucleotide sequence of cDNA inserts was determined, and the sequence alignments were performed with BLAST software on GenBank database. They represented 16 different antigens. A detailed sequence analysis showed that 10 of 16 genes were high homologous to genes known in GenBank, such as RPL31, S100 A2, MT2A, etc. However, there were also 6 genes with low homology to genes in GenBank. Furthermore, 3 of 6 genes may be novel genes. The associations of these genes to NPC and the roles that they played in the occurrence and development of NPC should be further revealed.     

构建不稳定型心绞痛淋巴细胞差异表达cDNA消减文库

目的:构建不稳定型心绞痛淋巴细胞差异表达cDNA消减文库。方法:将不稳定型心绞痛病人(n=15)和稳定型心绞痛病人(n=15)的淋巴细胞的RNA进行抑制性消减杂交(SSH), 将获得的顺向和逆向消减产物分别与T/A载体连接, 采用1×TSS一步法转化大肠杆菌JM109, 获得消减cDNA文库, 采用蓝白斑筛选和菌落PCR筛选有插入片段的克隆。结果:各组cDNA文库各获得2000个阳性克隆, cDNA片段大部分分布于(200-600)bp之间。结论:本研究构建了不稳定型心绞痛淋巴细胞消减cDNA文库, 此cDNA文库有助于进一步筛选不稳定型心绞痛淋巴细胞中的差异表达基因。     

类风湿关节炎滑膜组织cDNA文库的构建及自身抗原的筛选和鉴定

目的 通过SEREX（serological analysis of recombinant cDNA expression library）技术对类风湿关节炎滑膜组织cDNA文库进行初步筛选,得到新的类风湿关节炎自身抗原.方法 利用SMART技术构建类风湿关节炎患者滑膜组织cDNA文库,并对该文库进行SEREX筛选,获得特异性结合阳性克隆,对阳性克隆同源性分析.然后进行酶联免疫吸附实验（ELISA）验证,分析该阳性克隆对于类风湿关节炎诊断临床敏感度和特异度.结果 构建cDNA文库滴度约为6.89×10^6 pfu/mL,筛选文库获得12个阳性克隆,同源性分析3个阳性克隆插入片段为已知蛋白,分别是：Filaggrin、SERPINE2和p68.进行血清学初步验证,抗-Filaggrin和抗-SERPINE2具有高敏感度和低特异度,而抗-p68具有高敏感度和高特异度.结论 抗-Filaggrin、抗-SERPINE2和抗-p68对于类风湿关节炎的诊断具有不同的敏感度和特异度.     

类风湿关节炎滑膜组织T7噬菌体展示cDNA文库的构建

目的构建类风湿关节炎(RA)滑膜组织T7噬菌体展示cDNA文库,为筛选和鉴定RA特异性基因的研究奠定基础。方法取确诊RA患者的滑膜组织,用Trizol试剂提取总RNA,Oligotex离心柱分离mRNA,电泳检测其质量,逆转录合成双链cDNA,经末端修平、接头连接、酶切后去除过多接头,收集>300bp的cDNA片段,与T7Select10-3载体连接,体外包装并扩增得到类风湿关节炎滑膜组织T7噬菌体展示cDNA文库。最后,通过铺平板滴度测定及PCR技术鉴定文库质量。结果所构建原始文库重组克隆数为2×107pfu,扩增滴度8.9×1010pfu/ml。PCR法检测片段插入率为90%,插入片段在300～2000bp之间。文库噬菌体裂解液PCR扩增得到BiP基因片段。结论成功构建了高质量的RA滑膜T7噬菌体展示cDNA文库,为下一步RA自身抗原的筛选奠定了基础。     

Construction and characterization of a vestibular-specific cDNA library using T7-based RNA amplification

 Using a very small amount of inner-ear tissue, we constructed a human vestibular cDNA library by means of T7-based amplification of RNA. This library should allow us to identify genes likely to be involved in auditory and vestibular functions. Here we first report the characterization of the human vestibular cDNA library. Among 506 cDNA clones randomly selected from the vestibular cDNA library, DNA sequences of 301 cDNA clones were identical to those of genes of known function. Twenty-two cDNA clones were considered to be novel because they did not match any cDNA sequences in the public database. The information in our study will provide a valuable resource for identifying several novel genes underlying deafness disorders and vestibular dysfunction. Received: November 25, 2002 / Accepted: December 3, 2002 Acknowledgments We thank all of the families whose participation made this project possible. We also thank Dr. Yasuhiro Inoue of Keio University School of Medicine for providing the surgical specimens. This work was supported in part by Research for the Future Program Grant #00L01402 from the Japan Society for the Promotion of Science. Correspondence to:Y. Nakamura