α-突触核蛋白N 端结构域和电压依赖阴离子通道1 相互作用的分子机制

【立论依据】 帕金森病是主要发生在中老年人群的神经系统退行性变。目前认为与基因、环境和老化相关,三者主要作用于神经细胞线粒体导致其功能障碍。α-突触核蛋白(α-synuclein,α-Syn)是第一个发现的帕金森病致病基因编码的蛋白,是帕金森病病理标志路易体的主要成分。但到目前为止,α-Syn对细胞线粒体的致病机制尚不十分清楚。我们课题组前期工作首次发现,α-Syn可定位于线粒体内外膜,过表α-Syn可以引起线粒体膜电势下降及细胞色素C 释放到胞浆诱导凋亡;进一步发现线粒体膜渗透性转换孔(mPTP)开放,而α-Syn N端结构域(α-Syn/N)在这个过程中起重要作用。文献报道,α-Syn N端的62、63、65 位氨基酸可能是其定位于膜的关键位点。线粒体mPTP的外膜孔主要由电压依赖阴离子通道1(VDAC1)构成,我们预实验发现VDAC1和α-Syn存在相互作用。那么,α-Syn/N是否和VDAC1发生相互作用,导致mPTP开放而引起线粒体介导的凋亡呢?α-Syn/N的62、63、65 位氨基酸在这个过程中是否起重要作用呢? 【设计思路】 首先证明α-Syn/N和VDAC1之间存在相互作用,并过表达α-Syn/N,剪除α-Syn/N(α-Syn/delN),检测mPTP是否开放以及是否发生线粒体介导的凋亡。而后,构建α-Syn的62、63、65 位氨基酸突变体,检测过表达这些突变体对mPTP和线粒体介导的凋亡的影响,以及检测它们是否和VDAC1发生相互作用。 【实验内容】 (1)在HEK293T细胞中,过表达α-Syn、α-Syn/N、α-Syn/delN,用免疫共沉淀和免疫细胞化学的方法检测相互作用。(2)构建带VDAC1 基因的质粒,在HEK293T细胞中分别共表达α-Syn、α-Syn/N、α-Syn/delN 和VDAC1,用荧光共振能量转移(FRET)的方法检测是否存在直接相互作用,并再通过GST-pulldown方法验证。(3)在HEK293T细胞中,检测过表达α-Syn、α-Syn/N、α-Syn/delN对mPTP开放和线粒体介导的凋亡的影响。(4)构建α-Syn突变体(Q62A、V63A、N65A),检测过表达这些突变体对mPTP开放和线粒体介导的凋亡的影响。(5)检测这些突变体和VDAC1之间是否存在相互作用,方法同前。 【材料】 HEK293T 细胞,表达α-Syn,α-Syn/N,α-Syn/delN,Q62A,V63A,N65A 的质粒,线粒体提取试剂盒,JC-1 荧光探针(检测线粒体膜电势),mPTP 检测试剂盒。 【可行性】 我们的前期工作提示:α-Syn/N导致mPTP开放;α-Syn和mPTP外膜的孔的组成蛋白VDAC1之间存在相互作用;并且我们已经成功构建了过表达α-Syn、α-Syn/N、α-Syn/delN的细胞模型;以及α-Syn突变体(Q62A、V63A、N65A);并掌握了后续实验的全部方法。 【创新性】 目前关于α-Syn/N与mPTP 相关蛋白VDAC1的研究未见报道,本研究尝试揭示α-Syn与线粒体膜孔蛋白之间的确切关系,对进一步明确α-Syn引起线粒体介导凋亡的分子机制、明确帕金森病的致病机制具有重要意义,进而为帕金森病治疗的新靶点探讨提供线索。     

缺氧后线粒体Drp1通过LRRK2-HK2诱导mPTP过度开放的机制研究

目的：探究缺氧后线粒体动力相关蛋白1(dynamin-related protein 1,Drp1)对线粒体膜通透性转换通道（mitochondrial permeability transition pore,mPTP）开放的调控机制。方法：在血管平滑肌细胞中通过免疫荧光方法观察缺氧后mPTP开放情况;通过超速离心法分离线粒体和细胞质成分蛋白;使用Co-IP和Westernblot检测缺氧或者干预Drp1、干预己糖激酶-2(hexokinase-2,HK2)后Drp1的表达分布情况、HK2与电压依赖性阴离子通道蛋白（voltage dependent anion channel,VDAC）结合情况、Drp1与富含亮氨酸重复激酶2(leucine-rich repeat kinase 2,LRRK2)结合情况;使用蛋白分子对接和蛋白芯片方法筛选Drp1的潜在结合蛋白及结合位点;使用Drp1抑制剂和点突变法用于相应机制探究。结果：缺氧后Drp1发生线粒体转位促使mPTP过度开放（P<0.05）。使用Mdivi-1减少线粒体Drp1表达后可抑制mPTP开放,减少细胞色素C(cytoc...     

蛋白亲环素D基因功能研究进展

蛋白亲环素D(CypD)是细胞器内线粒体的一个重要组成原件,定位于线粒体通透性转换孔。线粒体是细胞的发动机,在能量产生、钙离子(Ca~(2+))内稳态平衡以及细胞死亡、增殖等方面发挥重要作用。CypD是目前线粒体功能研究领域最重要的基因,一直是研究的热点。CypD基因与器官缺血再灌注损伤、氧化应激及肿瘤等病理生理过程密切相关,并干预细胞凋亡及坏死等细胞死亡过程。目前关于CypD在上述过程中的具体机制及潜在的临床治疗作用尚不完全明确,需进一步探明。     

线粒体自噬在脑缺血再灌注损伤中的研究进展

线粒体自噬是一种控制线粒体数量的选择性自噬过程,其对维持细胞正常表型和功能至关重要,且与心脑血管疾病(神经退行性疾病、缺血性脑卒中、心力衰竭等)密切相关。脑缺血再灌注损伤是指缺血脑组织在梗死相关血管开通后,可能导致比血管闭塞时更严重的急性损伤。而线粒体自噬与脑缺血再灌注损伤密切相关,其与氧化应激、线粒体动力学等有关。而这些过程受线粒体自噬相关蛋白(第10号染色体缺失的磷酸酶和张力蛋白同源物诱导的假定激酶1、Parkin、Bcl-2/腺病毒E1B 19 k Da相互作用蛋白3等)的调控。适度的线粒体自噬对细胞具有保护作用,从而减轻脑缺血再灌注损伤;但线粒体自噬功能受损清除不足或过度激活的线粒体自噬,可以加重脑缺血再灌注损伤。未来,脑缺血再灌注中的线粒体自噬将成为缺血性脑卒中的新研究方向。     

线粒体通透性转换孔对细胞程序性死亡的调控机制及其靶向药物研究进展

线粒体通透转换特性自20世纪70年代被发现以来,在调控细胞凋亡作用方面已获得广泛认可.该特性由线粒体通透性转换孔(mPTP)介导,以线粒体内膜通透性升高,相对分子质量<1.5×103的小分子物质自由通过线粒体膜为特征,但该通道的分子结构仍不十分清楚.探究mPTP的具体组成与调节机制,有助于提高对神经退行性疾病、心血管疾病及癌症发病机制与治疗手段的认识.本文通过对mPTP结构模型及其调控细胞程序性死亡(PCD)具体分子机制新进展的简要综述,论证了将mPTP靶向化合物作为PCD调控药物的可行性.     

缺血性脑卒中与神经元凋亡

缺血性脑卒中导致的脑神经元死亡可以分为坏死和凋亡两种.神经元坏死是不可逆的,而凋亡过程由于存在着大量正性和负性的可调控信号,因而可以作为脑缺血治疗的潜在靶点.大量研究证实,缺血性脑损伤中神经细胞凋亡是主要由Caspase参与的级联反应,包括死亡受体通路和线粒体通路两类.Caspase介导的细胞凋亡一般发生在缺血核心周边的阴影区域.Caspase的激活主要受Bcl-2家族蛋白以及由Bcl-2蛋白调控的线粒体释放的蛋白内容物所调节.由线粒体释放的与凋亡相关的蛋白包括细胞色素C、procaspase-9和凋亡蛋白酶活化因子(Apaf-1);虽然凋亡诱导因子(AIF)也是由线粒体释放,但其参与非Caspase介导的神经元凋亡.非Caspase介导的凋亡也发生在脑缺血的病理过程中,但不发挥主要作用.在从脑缺血发生到脑细胞凋亡过程中,能量代谢障碍是最先发生的机能改变,胞内钙稳态失调被认为是最为关键的一环,其它改变还包括自由基和兴奋性氨基酸的增加等.对神经元凋亡的深入理解是治疗缺血性脑卒中和寻找抗脑缺血药物的重要理论基础.     

微RNA与缺血性脑卒中的研究进展

微RNA(miRNA)是一类小型非编码RNA,与靶信使RNA的3'端非翻译区结合后,介导转录后基因调控,几乎参与所有生命活动和多种疾病的发生发展过程。缺血性脑卒中的发生通常伴随miRNAs表达谱异常,miRNA参与缺血性脑卒中的一系列病理生理过程,miRNA不仅在缺血性脑卒中急性期发挥重要作用,而且能调控卒中后神经和血管新生,深入研究miRNA在缺血性脑卒中作用机制的靶点可为缺血性脑卒中的诊断、治疗及预后提供新的策略。     

GSK-3β参与心肌缺血中细胞程序性死亡的研究进展

细胞程序性死亡分为3种类型:1型为凋亡,2型为自噬,3型为坏死.线粒体在细胞程序性死亡中具有重要作用,它不仅是细胞的能量中心,而且是细胞存活和死亡的决定性因素.内源性和外源性的因素(如缺血再灌注、细胞毒细胞因子类和癌症化疗)可以损伤线粒体功能和以线粒体为平台的信号通路.缺血导致线粒体生产ATP的能力下降,进而导致细胞活力下降、细胞毒性代谢产物聚集.经过缺血期的处理,线粒体通透性转变孔(mPTP)在再灌注期间开放,导致心肌细胞再灌注损伤.mPTP是触发细胞坏死和细胞凋亡线粒体通路的关键,磷酸化GSK-3β可以抑制mPTP开放,从而发挥其心肌保护作用.现对磷酸化的GSK-3β在心肌缺血细胞程序性死亡中的作用作一综述.     

ceRNA在缺血性脑卒中中的研究进展

脑卒中是全球范围内致残和致死的主要原因,但因其治疗时间窗较短,患者常错过最佳治疗时间导致病情加重及严重的后遗症。竞争性内源RNA (ceRNA)异常表达在缺血性脑卒中的病理过程中发挥着重要作用,其介导细胞凋亡、炎症反应、血管生成、细胞自噬等病理过程。本综述通过总结相关研究来探讨ceRNA在缺血性脑卒中中的作用及分子机制。     

环状RNA在缺血性脑卒中领域的研究进展

环状RNA(circRNA)是一种非编码RNA,其3’和5’端连接在一起,构成了一种共价闭合的环状结构。缺血性脑卒中后,机体发生了包括氧化应激、线粒体功能障碍、炎症、内质网应激、细胞凋亡和自噬在内的多种病理生理机制。circRNA主要通过海绵吸附微小RNA(microRNA),调节缺血性脑卒中相关基因表达水平,参与脑卒中的调控。在缺血性脑卒中发生后,部分circRNA对大脑发挥保护作用,而另一些circRNA则对大脑有损害作用。研究表明circRNA很有潜力在未来为缺血性脑卒中提供新的诊疗方法。本文就circRNA在缺血性脑卒中领域的研究进展进行综述,并对circRNA的未来应用进行展望。     

Effects of cyclosporine A on protecting lung with ischemia/reperfusion in rabbits

目的 探讨线粒体通透性转变孔(mPTP)抑制剂环孢素A(CsA)在肺缺血/再灌注损伤(I/R)中的作用以及mPTP作为靶目标肺保护策略的可行性.方法 健康家兔40只,随机均分为4组:假手术组、CsA组、低分子右旋糖酐(LMD)组和I/R组.采用原位缺口末端标记(TUNEL)法检测肺组织细胞凋亡情况,免疫组化法检测肺组织细胞色素C(CytC)的含量,电镜下观察肺组织线粒体的破坏情况.结果 CsA组肺组织CytC含量和细胞凋亡指数均高于假手术组(P<0.01),但明显低于LMD组和I/R组,且LMD组的细胞凋亡指数和CytC含量均低于I/R组.结论 CsA能够在再灌注早期抑制mPTP的开放,减少I/R损伤肺组织的细胞凋亡,起到肺保护作用.     

亲环蛋白D在甲基乙二醛诱导成骨细胞凋亡中的研究

目的 探讨亲环蛋白D(cyclophilin D, CypD)在甲基乙二醛(methylglyoxal,MG)诱导成骨细胞凋亡中的作用及机制。方法 本研究将细胞随机分为对照组、MG组、环孢菌素A (CsA)组和CsA+MG组。采用MTT法检测细胞增殖活性,TUNEL染色法检测细胞凋亡,Western blot法检测CypD蛋白表达水平,TMRM染色法检测线粒体膜电位。结果 MTT结果表明,MG抑制了成骨细胞增殖活性,并与浓度呈正相关。TUNEL染色结果显示,MG组较对照组显著增加了成骨细胞凋亡,而Western blot法检测结果表明,MG处理后CypD蛋白表达增加。在加入CypD抑制剂CsA干预后,其显著恢复了MG抑制的细胞增殖活性,细胞凋亡减少,CypD蛋白表达水平降低。同时,与MG组比较,TMRM结果表明,CsA部分恢复线粒体膜电位强度。结论MG可能通过调控CypD蛋白来诱导成骨细胞凋亡。     

MiRNA155-DNA甲基化介导mitoKATP调节线粒体自噬在芪参益气滴丸改善心肌缺血再灌注损伤中的分子机制理论探讨

在急性心肌缺血状态下,miRNA表达可以调控相关基因及蛋白,减少心肌细胞损伤,进而发挥保护心肌的作用,然而具体机制仍需进一步探究。近期研究发现,mitoKATP通道的开放可以调节线粒体自噬,且miRNA-DNA甲基化的启动在诱导细胞自噬发生方面发挥了调控作用。笔者团队前期研究发现,中药复方芪参益气滴丸通过介导mitoKATP通道调节线粒体自噬,进而明显改善心肌缺血;且动物实验证实,miR-155在细胞自噬调节、炎症反应、血管平滑肌细胞迁移方面有显著作用。故笔者提出假设：芪参益气滴丸可以激活miRNA155-DNA甲基化介导的mitoKATP开放,进而调节线粒体自噬,改善心肌缺血。本文通过阐述线粒体自噬与心肌缺血后的氧化应激损伤的关联性,探讨芪参益气滴丸通过调控MiRNA155-DNA甲基化介导mitoKATP调节线粒体自噬,进而改善心肌缺血再灌注损伤的可能机制,为相关研究提供理论思路。     

CD_(44)与肿瘤关系的研究进展

<正> 恶性肿瘤具有在多种因素介导下侵袭血管和转移的特性。瘤细胞在侵袭和转移过程中,从原发瘤体分离,穿越细胞与细胞之间的基质、血管内皮及皮下基底膜,最后进入转移灶。因此调节细胞和细胞、细胞和基质之间相互作用的因素起关键作用。粘附分子正是这样一类介导细胞与细胞、细胞与细胞外基质间粘附作用的膜表面糖蛋白,它们在肿瘤的发生和     

线粒体通透性转换孔在脑缺血再灌注损伤中的研究进展

缺血性脑血管疾病是威胁人类健康的主要疾病之一,尽早恢复脑组织的供血供氧是挽救患者生命、降低致残率的有效手段,但脑组织恢复血氧供应后,却有可能发生更严重的损伤,即脑缺血再灌注损伤（ischemiareperfusioninjury,I/R）。线粒体作为能量产生的重要细胞器,对神经元的存活极为重要。在线粒体功能障碍的众多潜在机制中,线粒体通透性转换孔（mitochondrial permeability transition pore,mPTP）的开放是近年来越来越受关注的机制之一,mPTP是介导脑功能障碍和细胞死亡的关键节点,该文系统地综述mPTP和I/R的研究现状,以期为临床治疗脑缺血/再灌注损伤提供一个新的治疗思路。     

环孢素A对兔肺缺血/再灌注损伤的保护作用

目的探讨线粒体通透性转变孔(mPTP)抑制剂环孢素A(CsA)在肺缺血/再灌注损伤(I/R)中的作用以及mPTP作为靶目标肺保护策略的可行性。方法健康家兔40只,随机均分为4组:假手术组、CsA组、低分子右旋糖酐(LMD)组和I/R组。采用原位缺口末端标记(TUNEL)法检测肺组织细胞凋亡情况,免疫组化法检测肺组织细胞色素C(CytC)的含量,电镜下观察肺组织线粒体的破坏情况。结果 CsA组肺组织CytC含量和细胞凋亡指数均高于假手术组(P<0.01),但明显低于LMD组和I/R组,且LMD组的细胞凋亡指数和CytC含量均低于I/R组。结论 CsA能够在再灌注早期抑制mPTP的开放,减少I/R损伤肺组织的细胞凋亡,起到肺保护作用。     

调节性T细胞与缺血性脑损伤的研究进展

调节性T细胞(Treg细胞)不仅可以维持自身免疫系统稳态,还在调控免疫应答方面发挥重要作用,这些细胞不但能够抑制自身抗原、共生的微生物、过敏原、病菌所发生的炎症反应,而且在多种自身免疫疾病发生、发展中起重要作用。缺血性脑损伤是临床上常见的脑卒中类型之一,Treg与缺血性脑血管病关联甚密,机体在缺血性脑损伤发生后会激活体内的炎症反应,引发全身及局灶性的炎症级联反应,而Treg通过调节机体免疫过程发挥脑保护作用。     

整合素与肿瘤的靶向治疗

整合素是细胞表面重要的黏附分子,介导细胞与细胞外基质相互作用,在肿瘤的发生发展过程中起着重要的作用,近年来将整合素作为肿瘤治疗靶点取得了显著的进展。目前采用针对整合素不同亚基的克隆抗体,整合素抑制剂,靶向节调整合素基因表达,整合素介导的溶细胞作用以及肿瘤细胞的整合素疫苗等方法通过调节整合素的生物学作用,促进肿瘤细胞凋亡,阻断肿瘤细胞侵袭迁移,抑制肿瘤血管的生成,从而达到治疗肿瘤的目的。这些研究发现对开拓肿瘤治疗新方案有着重要的意义。     

PINK1/Parkin介导线粒体自噬对缺血性脑卒中作用机制的研究进展

近些年来,我国脑卒中总体发病率呈上升趋势,已经成为患者死亡和残疾的主要原因[1],其以发病突然、起病急骤的神经功能缺损为主要特征。脑卒中主要包扩缺血性脑卒中（ischemic stroke,IS）和出血性脑卒中两大类,而最常见的类型是IS。IS导致神经细胞血液供应不足,所需的葡萄糖和氧气减少,神经细胞稳态被扰乱,从而引发包括兴奋性毒性、氧化应激、炎症、细胞凋亡在内的病理生理过程[2]。研究表明,线粒体自噬可以及时清除受损的线粒体,有效控制线粒体质量和功能,维持神经细胞稳态和防止神经细胞凋亡,在IS病理生理过程中起着不可忽视的作用[3]。现就PTEN诱导推定激酶1(PTEN-induced putative kinase protein 1,PINK1) /人帕金森蛋白2( human Parkinson disease protein 2,Parkin)介导线粒体自噬对缺血性脑卒中作用机制的研究进展予以综述     

脑卒中诱导VEGF-A保护神经血管单元作用的研究进展

神经血管单元概念的提出强调了神经细胞、内皮细胞、星形胶质细胞、小胶质细胞和相关组织基质蛋白之间的相互作用对研究脑卒中病理生理过程的重要性.血管内皮生长因子(VEGF)家族是一类血管调节因子,在维护神经血管单元稳态中发挥着关键作用,其中以VEGF-A的作用最为突出.本文阐述脑卒中诱导VEGF-A发挥促血管生成、血管舒张、...