Fascinl基因表达对胃癌细胞系MKN45增殖与凋亡的影响

目的 探讨fascini基因表达对胃癌细胞系MKN45增殖与凋亡的影响及其意义.方法 利用RNA interference(RNAi)技术稳定沉默fascin1基因的表达,Western blotting及RT-PCR检测干扰效率,用MTT比色法和平板克隆形成实验检测转染前后细胞体外增殖能力,用流式细胞术(FCM)及Ho-chest33258荧光染色法检测细胞凋亡的变化.结果 在稳定转染fasein1干扰质粒后,胃癌细胞系MKN45的fascin1表达明显下降;与未转染组和空白质粒转染组相比,fagcin1干扰质粒转染组的增殖能力明显降低,但细胞凋亡变化不明显.结论 fascin1的表达与胃癌细胞系MKN45的增殖有关,而与凋亡无明显相关.     

靶向CXCR1基因的shRNA真核表达质粒的构建及鉴定

目的：构建靶向化学趋化因子受体1（CXCR1）的短发夹小干扰RNA（shRNA）质粒表达载体。方法：针对人CXCR1基因的mRNA序列,按RNA干扰靶位点的设计原则,设计并构建靶向CXCR1基因的3个shRNA质粒表达载体和1个阴性对照质粒表达载体,经酶切和测序确认构建成功后,转染胃癌细胞MKN45,RT-PCR和Western blot检测CXCR1 mRNA和蛋白的表达。结果：经酶切和测序证实,3个靶向CXCR1基因的shRNA真核表达质粒均构建成功;与未转染和转染阴性对照质粒的MKN45细胞比较,转染3种shRNA质粒的MKN45细胞,CXCR1 mRNA和蛋白水平均明显下调（均P<0.05）。结论：靶向CXCR1基因的shRNA真核表达质粒的成功构建,为进一步研究CXCR1在胃癌中的功能和实验性靶向治疗提供了初步的基础。

     

miRNA-214对胃癌细胞BGC823|MKN45的细胞周期和凋亡的影响

目的探讨miRNA-214对胃癌细胞的细胞周期和凋亡的影响,及其对靶基因PTEN蛋白表达的影响。方法荧光定量PCR法检测人低分化胃癌细胞BGC823、MKN45和人正常胃黏膜细胞GES-1中miRNA-214的表达;检测瞬时转染反义核苷酸(miRNA-214抑制剂)后的miRNA-214的表达;流式细胞术分析转染后的细胞生长周期和凋亡率的变化;免疫荧光检测miRNA-214抑制剂对靶基因PTEN表达的影响。结果 miRNA-214在人胃癌细胞BGC823及MKN45中表达上调(P0.05)。转染miRNA-214抑制剂后能使BGC823中miRNA-214的表达下调(P0.05),且BGC823和MKN45在转染组的G1期细胞较未转染组明显增高[分别为(60.20±3.38)%vs.(49.33±7.99)%(P0.05);(69.90±0.28)%vs.(54.85±0.64)%(P0.05)],S期细胞在转染组较未转染组明显降低[(21.87±3.20)%,(18.25±1.34)%,P0.05)],但对细胞凋亡率无影响(P0.1)。免疫荧光显示,转染miRNA-214抑制剂后PTEN呈强表达。结论 (1)人胃癌细胞系BGC823,MKN45中的miRNA-214呈高表达;(2)miRNA-214可使这两株细胞的G1期细胞减少,S期细胞增多,下调PTEN可能是其作用机制之一;(3)miRNA-214对上述两株细胞的凋亡无影响。     

STAT3基因短发卡RNA表达质粒的构建及其对胃癌细胞生长和侵袭的抑制作用

目的 构建信号传导及转录活化因子3(STAT 3)基因短发夹RNA(shRNA)表达质粒,探讨STAT 3抑制后对胃癌MKN-45细胞增殖、凋亡和侵袭的影响.方法 根据STAT 3 Mrna 编码序列,设计RNA干扰靶点,构建STAT 3基因的特异性小RNA干扰质粒(psiRNA-H1/STAT 3),使用脂质体转染MKN-45细胞,实验分为对照组、psiRNA-H1转染组和psiRNA-H1/STAT 3转染组.通过RT-PCR和Western blot检测STAT 3特异性小RNA干扰基因对胃癌细胞STAT 3 Mrna和蛋白表达的影响; MTT比色法检测细胞的生长抑制率; 采用流式细胞术检测转染后对MKN-45细胞凋亡的影响; 采用Boyden小室侵袭实验检测转染后MKN-45细胞侵袭力的变化.结果 成功转染重组体的MKN-45细胞中STAT 3 Mrna和蛋白表达明显下降(P＜0.05).psiRNA-H1/STAT 3转染组各时相均明显抑制MKN-45细胞生长,且MKN-45细胞凋亡率为34.26%,相比对照组(3.75%)和psiRNA-H1转染组(4.43%)明显升高(P＜0.01).另外,psiRNA-H1/STAT 3转染组MKN-45细胞侵袭力较另外2组明显减弱(P＜0.01).结论 成功构建了针对STAT 3基因的shRNA表达载体,通过转染MKN-45细胞,在体外能有效抑制人胃癌细胞STAT 3 Mrna和蛋白表达,细胞增殖、侵袭能力减弱并且促进细胞凋亡,为STAT 3基因靶向治疗提供一定的实验依据.     

siRNA干扰沉默KLK12基因抑制胃癌细胞生长的研究

目的利用RNA干扰(RNAi)技术,构建KLK12-siRNA表达载体,探讨其在体外对胃癌细胞生长的影响。方法合成KLK12-siRNA,以脂质体法转染至胃癌MKN-45细胞中建立稳定细胞系,并分成3组,即空白对照组、阴性对照组和KLK12siRNA组。采用实时定量PCR和Western blot方法观察KLK12siRNA转染后胃癌细胞KLK12基因和相应蛋白表达的变化;用MTT法,细胞迁移和侵袭试剂盒分别检测转染细胞的增殖、迁移和侵袭能力的变化。结果 KLK12siRNA组的KLK12mRNA和蛋白表达水平较两个对照组明显下调(P0.05)。KLK12基因沉默显著抑制胃癌细胞的增殖,并降低体外胃癌细胞的迁移能力。结论 KLK12-siRNA表达载体能抑制胃癌MKN-45细胞的增殖和迁移,为胃癌的基因治疗提供了有益的实验依据。     

Tiam1基因在胃癌细胞的表达及其生物学行为研究

目的构建Tiam1基因的真核表达载体,评估其转染人胃癌细胞株MKN45细胞后对胃癌细胞功能的影响。方法实时荧光定量PCR分析Tiam1基因在胃癌细胞中的表达;将外源性重组真核表达载体Tiam1基因(N1/Tiam1)转染到人胃癌细胞株MKN45内,经G418筛选并建立稳定表达Tiam1基因的胃癌MKN45细胞株,为:N1/Tiam1组,转染空质粒细胞(N1)组和未处理细胞(MKN45)组的两个对照组分别为:N1组和MKN45组;通过细胞增殖、划痕和侵袭实验分别观察上调Tiam1基因表达后的胃癌细胞功能。结果与N1组相比,N1/Tiam1组中Tiam1蛋白表达明显上调[(0.36±0.05)vs.(2.67±0.14),P<0.01];与对照组相比较,N1/Tiam1实验组较N1对照组细胞增殖数量明显增加(P=0.000);与转染N1空载体的MKN45细胞对照组相比,转染了N1/Tiam1高表达质粒的MKN45细胞促进胃癌细胞的迁移和侵袭。结论 Tiam1基因真核表达载体的筛选成功,为继续深入的研究Tiam1基因在胃癌中的功能奠定了基础。     

小片断干扰RNA抑制保罗样激酶1基因的表达诱导胃癌细胞凋亡

目的 观察抑制保罗样激酶基因（polo like kinasel，plkl）表达对胃癌细胞——MKN45凋亡的诱导，探讨plk1基因对胃癌细胞增殖及生存力的作用。方法 化学合成小片断干扰RNA（siRNA）阻断MKN45细胞plkl基因的表达；实时定量PCR及Western blot检测干扰前后plk1 mRNA及蛋白质表达的变化；免疫荧光及激光共聚焦显微镜观察MKN45细胞微管改变，流式细胞仪检测MKN45细胞周期及凋亡的变化；Western blot检测pro-caspase3水平的变化。结果 经靶向plk1的siRNA作用后，plk1 siRNA mRNA及蛋白质表达明显下降；MKN45细胞纺锤体结构变得模糊，失去完整性；较多MKN45细胞呈现G2期细胞DNA含量（P〈0．05）；MKN45细胞在48、72h凋亡率较对照组明显上升（P〈0．05）；伴随pro-caspase3水平在72h出现下降。结论 抑制plk1基因表达可导致MKN45细胞凋亡，凋亡机制可能通过caspase3途径；plk1基因对胃癌细胞增殖及存活起着至关重要的作用。     

靶向丝氨酸/苏氨酸激酶15基因小片段干扰RNA抑制胃癌细胞生长的实验研究

目的观察丝氨酸／苏氨酸激酶15基因(serine／threonine kinase15,STK15)沉默后对胃癌细胞系MKN45体内外生长的抑制作用,探讨STK15基因作为胃癌靶点治疗的可行性。方法应用RNA干扰技术(RNA interference,RNAi)抑制STK15基因的表达;Western blot检测STK15蛋白质的表达变化;体外侵袭实验检测MKN45细胞侵袭能力的变化;MTT法检测MKN45细胞增殖速度的变化。将裸鼠随机分成2组,每组10只,皮下移植经STK15siRNA处理的MKN45细胞,观察其成瘤性的改变。结果 MKN45细胞经STK15 siRNA作用后,蛋白表达水平均明显降低;STK15-组与对照组比较体外侵袭能力明显下降[平均4值为(182±27)比(308±38),P<0．05];更多的MKN45 细胞聚集于G2／M期附近[G2期DNA含量细胞为(30±5)％比(14±3)％,P<0．05];增殖速度明显减缓(P<0．05);在裸鼠体内成瘤性明显减低[平均肿瘤重量为(0．15±0．07)g比(0．29±0．16)g, P<0．05]。结论靶向STK15的siRNA可在体内外抑制胃癌MKN45细胞的增殖,STK15有可能成为胃癌治疗的靶点。     

Hedgehog信号通路在胃癌细胞中活化并通过GLI1促进MKN28细胞增殖

目的研究Hedgehog：（HH）信号通路在胃癌细胞中的活化形式及其转录因子GLI1对胃癌细胞增殖和体外成瘤能力的影响。方法通过反转录PCR分析HH通路相关组成分子在7株细胞系中的表达情况．化学合成针对HH信号通路转录因子GLI1的siRNA并转染胃癌MKN28细胞。通过CCK8法和体外克隆形成实验．观察GLII siRNA转染胃癌MKN28细胞后的细胞增殖能力和克隆形成能力的变化。结果在不同胃癌细胞株中．HH信号通路各相关基因的表达情况存在差异,SHH在6株胃癌细胞系中均表达上调．PTCH在KATOⅢ细胞系、SUFU在MKN28和KATOⅢ表达下调。转染GLI1 siRNA后,MKN28细胞中GLI1 mRNA表达受到明显抑制;经GLI1 siRNA作用的MKN28细胞生长明显缓于阴性对照和未处理组（P=0．014）,克隆形成数目及体外克隆形成能力降低（P〈0．001）。结论HH信号通路在胃癌细胞系中被普遍激活,HH信号通路活化后可通过转录因子GLI1促进MKN28细胞增殖．     

上调转录因子Sp1对胃癌细胞MKN-45增殖的影响

目的 构建pEGFP-Sp1真核表达载体,转染Sp1低表达胃癌细胞株MKN-45,观察转染后细胞内Sp1表达及其体外增殖能力.方法 PCR扩增Sp1 (2337 bp)全长序列,连接至pEGFP-N1质粒(4700 bp),测序鉴定无误后,以Lipofectamine 2000转染胃癌细胞株MKN-45.细胞免疫组织化学染色定位Sp1表达部位,PCR扩增及Western blot检测细胞Sp1表达.CCK-8法检测细胞体外增殖能力.结果构建pEGFP-Sp1表达质粒并转染胃癌细胞株,外源性Sp1定位于MKN-45细胞核中并稳定表达.体外培养3d后,MKN-45-Sp1增殖能力明显高于MKN-45-N1及MKN-45细胞(MKN-45-Sp1比MKN-45-N1及MKN-45,P＜0.05).结论 构建pEGFP-Sp1真核表达载体,稳定上调胃癌细胞株MKN-45中Sp1表达,转染后胃癌细胞株体外增殖能力明显增高.     

微小RNA-148a对胃癌细胞MKN45增殖能力的影响及机制研究

目的：探讨微小RNA（miR）-148a对人胃癌细胞增殖的影响及可能机制。方法采用实时定量PCR技术检测60例胃癌组织及癌旁组织中miR-148a的表达水平。利用慢病毒包装建立稳定表达miR-148a的MKN45细胞系为转染组,未转染的MKN45细胞系为对照组。 CCK8法检测MKN45细胞的增殖情况,通过targetscan预测miR-148a的靶基因,Western-blot检测靶基因的表达水平。结果54例（90．0％,54/60）胃癌组织中miR-148a的表达量较癌旁组织下调,其中37例（61．7％,37/60）下降2倍以上;淋巴结转移、有无癌旁血管浸润及TNM分期Ⅲ～Ⅴ期者其表达量明显降低（P＜0．05）。转染miR-148a后3 d,MKN45细胞生长明显受抑,转染组吸光度值（0．978±0．091）明显低于对照组（1．182±0．074,P＝0．000）。转染组CDC25B（通过targetscan发现的miR-148a靶基因）蛋白表达较对照组明显降低。结论 miR-148a在胃癌组织中的表达明显低于癌旁组织;其具有抑制胃癌细胞增殖的作用,CDC25B可能是miR-148a发挥抑癌作用的靶基因。     

靶向保罗样激酶的小干扰RNA体内外抑制胃癌细胞生长的研究

目的 观察敲除保罗样激酶（plk）1基因对胃癌细胞MKN45体内外生长的抑制作用,探讨plk1基因作为胃癌基因治疗靶点的可行性及有效性。方法 应用RNA干扰技术（RNAi）抑制MKN45细胞plk1基因的表达,实时定量PCR（real—timequantitative PCR）及蛋白印迹（western blotting）检测plk1 mRNA及蛋白质的表达变化,流式细胞仪检测MKN45细胞周期分布及凋亡率的变化,噻唑蓝（MTT）法检测MKN45细胞增殖速度的变化。裸鼠皮下移植plk1小干扰RNA（siRNA）处理的MKN45细胞,观察其成瘤性的改变。western blotting检测成瘤标本的plk1蛋白质的变化。结果 MKN45细胞经plk1 siRNA作用后,plk1 mRNA及蛋白质水平在一定时间内均明显降低,更多的MKN45细胞聚集于G2／M期附近（P〈0．05）;经plk1 siRNA作用的MKN45细胞在48及72h凋亡率高于对照组（P〈0．05）;生长速度亦明显缓于对照组（P〈0．05）;在裸鼠体内成瘤性明显减低（P〈0．05）;但各组体内成瘤标本的plk1蛋白表达无明显改变。结论 靶向plk1的siRNA可以抑制胃癌MKN45细胞在体内外的生长速度,plk1有可能成为新的胃癌治疗靶点。     

丝氨酸/苏氨酸激酶15基因沉默诱导胃癌细胞凋亡

目的 观察丝氨酸／苏氨酸激酶15基因（STK15）沉默后对胃癌细胞MKN45凋亡的诱导作用，阐述STK15基因对胃癌细胞生存的关键作用。方法 化学合成小片断干扰RNA（siRNA）抑制MKN45细胞STK15基因的表达；实时定量PCR及Western印迹检测STK15mRNA及蛋白质表达的变化；流式细胞仪检测MKN45周期分布及凋亡的变化；Hoechest染色观察凋亡形态变化，Western印迹检测pro-caspase3水平的变化。结果 经靶向STK15的siRNA作用48h后，STK15siRNAmRNA及蛋白质表达明显下降；较多MKN45细胞呈现岛期细胞DNA含量（P〈0．05）；细胞凋亡率较对照组明显上升（P〈0．05）；伴随pro—caspase3水平下降。结论 抑制STK15基因表达通过caspase3途径导致MKN45细胞凋亡，STK15基因对胃癌细胞增殖及存活起着关键作用。     

Apoptosis of gastric cancer cell line MKN45 by photodynamic treatment with Photofrin

The aim of this study was to investigate the mechanism of cell death by photodynamic therapy (PDT) in the gastric cancer cell line MKN45 with focus on the mechanism of apoptosis. Gastric cancer cells (MKN45) were incubated with Photofrin for up to 24 h before exposure to He-Cd laser (441 nm, 1 J/cm²). Cell viability was assessed by the methyl-tetra-zolium assay after exposure to light. A 95% cell death (LD₉₅) was measured with 10 g/ml of Photofrin. DNA ladder formation and chromatin condensation were seen within 60 min. Caspase-3–like and caspase-9–like activities increased from 15 min after exposure to light. Reduction of rhodamine 123 uptake started at 30 min. Caspase-inhibitor VAD-fmk (10 mM) inhibited apoptosis, but did not influence cell viability. In conclusion, Photofrin-mediated PDT in the gastric cancer cell line MKN45 induces apoptosis within 60 min, and mitochondrial damage is likely as the first event of apoptosis.     

反义人端粒酶RNA组分基因对胃癌细胞端粒酶活性的影响

目的 克隆人胃癌细胞端粒酶RNA组分（hTR）基因片段并构建其正义和反义真核表达载体,研究反义端粒酶RNA对人胃癌细胞株MKN-45端粒酶活性的影响。方法 采用RT-PCH方法从人胃癌细胞株MKN-45中扩增出人hTR部分cDNA序列,将该片段分别正向和反向插入PEF6/V5-His-TOPO载体后构建人端粒酶RNA组分（hTR）基因正、反义真核表达载体,随后采用脂质体转染法将该正、反义载体转染入人胃癌细胞株MKN-45,用TRAP法观察后者端粒酶活性的改变。结果 所克隆的基因片段其碱基序列与文献报导完全一致,且插入载体的方向完全正确。与正常对照、转染正义载体、空载体者比较,转染反义载体者端粒酶活性显著下降。结论 本实验已成功克隆了人端粒酶RNA组分（hTR）基因的部分序列并成功构建hTR正反义真核表达载体,而且反义端粒酶RNA能有效降低人胃癌细胞株MKN-45端粒酶活性。     

抑制polo-like kinase-1基因表达对5-氟脲嘧啶及顺铂体外诱导胃癌细胞凋亡的影响

目的观察抑制polo-like kinase-1(Plk-1)基因对5-氟脲嘧啶(5-Fu)及顺铂(CDDP)体外诱导胃癌细胞株-MKN45凋亡的影响。方法小片断干扰RNA(siRNA)阻断MKN45细胞Plk-1 基因的表达;定量PCR及Western blot检测Plk-1表达的变化;MTT法检测MKN45细胞增殖速率;流式细胞仪检测MKN45细胞凋亡率。结果经靶向Plk-1的siRNA作用24 h、48 h及72 h后,Plk-1 mRNA水平分别下降了51．91％、89．45％、91．03％,蛋白水平在48 h及72 h分别降低了38．43％和 60．66％;联合应用5-Fu、CDDP与靶向Plk-1 siRNA组的MKN45细胞增殖速率较单用5-Fu、CDDP或靶向Plk-1 siRNA组明显减慢(P<0．05);在48 h及72 h细胞凋亡率明显上升(P<0．05)。结论 Plk-1基因表达抑制在体外可增强5-Fu及CDDP对MKN45细胞的凋亡诱导作用;联合应用靶向Plk-1 的siRNA有可能提高5-Fu及CDDP对胃癌细胞杀伤作用。