去细胞人羊膜基质的制备及免疫原性

目的制备去细胞人羊膜基质(AHAM)并分析其移植至小鼠体内后的免疫反应,评价去细胞人羊膜基质作为细胞移植支架的免疫原性。方法利用胰蛋白酶-EDTA消化人羊膜(HAM),去除人羊膜上皮细胞,制备新鲜去细胞人羊膜基质;新鲜去细胞人羊膜基质置于含硫酸软骨素及甘油的冷冻保护液中,-80℃保存;使用前经PBS复水处理后即冷冻去细胞人羊膜基质;免疫细胞化学分析去细胞人羊膜基质中人类白细胞抗原的表达情况;将冷冻的去细胞人羊膜基质移植至BALB/c小鼠肝脏内4周后,分析脾脏组织中CD4~+、CD8~+T淋巴细胞比例的变化。结果新鲜及冷冻保存后的去细胞人羊膜基质均不表达人类白细胞抗原;冷冻的去细胞人羊膜基质移植至小鼠体内后,脾脏组织中CD4~+、CD8~+T淋巴细胞无明显变化。结论去细胞人羊膜基质的免疫原性较低,移植后不会引起由T细胞介导的特异性排斥反应,可以作为免疫安全性的生物支架用于疾病的细胞移植治疗。     

人源化NOD/SCID小鼠的细胞免疫重建

目的探讨人脐带血CD34+细胞移植于非肥胖性糖尿病/重症联合免疫缺陷(NOD/SCID)小鼠后的免疫重建作用。方法免疫磁珠法分选人脐血CD34+细胞,经外侧尾静脉移植于亚致死量照射的NOD/SCID小鼠。移植后4、6、8、10周流式细胞术动态监测小鼠外周血人源CD45+、CD3+、CD56+细胞的数量;10周后PCR检测小鼠骨髓人ALU基因的表达,免疫组织化学染色检测小鼠脾脏人源CD3+、CD56+细胞的表达。结果 NOD/SCID小鼠经照射后骨髓腔内有核细胞及巨细胞数量均明显减少或消失,达到理想的清髓预处理效果;移植后4、6、8、10周,移植组所有存活小鼠外周血均可检测到人源性CD45+、CD3+、CD56+细胞的表达,人源淋巴细胞的数量随时间的延长而变化,8周时达到高峰,10周仍有较高的比例。10周时移植组所有存活小鼠骨髓细胞均检测到人ALU基因的表达,脾脏均检测到人CD3+、CD56+细胞;未移植组小鼠照射后2周内全部死亡。结论经照射后的NOD/SCID小鼠通过移植人脐血CD34+细胞成功地建立了hu-SRC-NOD/SCID模型,并有效地重建了小鼠细胞免疫系统。     

喘可治延长小鼠异基因移植皮片存活时间与CD4+CD25+调节性T细胞相关性研究

目的：研究喘可治抑制小鼠异基因皮片移植排斥作用与小鼠体内CD4+CD25+ 调节性T细胞（CD4+CD25+Tr）变化的相关性。 方法： 建立小鼠同种异基因与同基因皮片移植模型，通过腹腔注射给药喘可治(CKZ)观察其对皮片移植存活时间的影响，并利用3色免疫荧光标记和流式细胞术分析受鼠外周血CD4+CD25+ Tr变化规律。 结果： 同种异基因移植CKZ组的移植皮片存活时间显著长于同种异基因移植对照组，分别为（195±23）d和（102±22）d，P＜001；在同种异基因皮片移植后，受体外周血CD4+CD25+ Tr占CD4+T细胞百分率明显升高，术后8 d达到高峰（P＜001），然后出现下降趋势，其中同种异基因移植对照组在术后13 d时已回落至正常水平，而同种异基因移植CKZ组在术后23 d时仍维持在高于移植前水平；在同基因皮片移植后，CKZ组与对照组外周血CD4+CD25+ Tr水平均无明显升高（P＞005）。 结论： 喘可治可延长小鼠同种异基因移植皮片存活时间，通过升高CD4+CD25+ Tr水平而发挥免疫抑制效应可能是其机制之一。     

深低温处理对异种骨-髌腱-骨移植排斥反应的影响

目的： 观察深低温处理对异种骨-髌腱-骨（BPB）移植排斥反应的影响。方法：采用大鼠股部肌袋模型法探讨深低温处理对异种BPB移植免疫反应的影响,通过观察外周血T细胞活化和植入物组织形态学变化情况来判定免疫反应程度。结果：新鲜未处理异种BPB移植后3 d CD4+/CD8+细胞CD25+表达率即显著升高,与自体移植组比较有显著差异（P<0.05）,术后14 d达高峰,且维持该峰值至术后35 d仍无下降;深低温处理的异种BPB移植后CD4+/CD8+细胞CD25+的表达明显受到抑制,表达时间推迟,至术后14 d才有轻度升高,术后3 d起各时点与未处理组比较,均P<0.05。组织学检查发现,深低温处理组骨、腱组织周围见少量淋巴细胞浸润,但未侵入组织内,无组织坏死,腱束结构清楚,胶原排列规则;新鲜异种移植组可见大量斑片状淋巴细胞弥漫性浸润骨及胶原组织周围及其中,可见骨碎片,腱结构不清,胶原排列紊乱,部分切片可见较多的嗜酸性粒细胞和多核巨细胞等炎症细胞。结论：深低温处理能显著降低异种BPB免疫原性,抑制排斥反应发生。     

新鲜与保存羊膜移植与小梁切除后的瘢痕组织增生

背景:目前新鲜羊膜在眼表疾病方面得到了广泛应用,并且取得了抗纤维组织增生、抑制新生血管形成及减轻炎症反映等方面的满意疗效,但在青光眼方面的应用还未见报道。目的:观察新鲜羊膜移植对小梁切除术后瘢痕组织的抑制作用,并与保存羊膜对比。方法:将36只新西兰大白兔按随机数字表法分为3组,新鲜羊膜组和保存羊膜组分别进行新鲜羊膜移植、保存羊膜移植联合小梁切除术,空白组行单纯小梁切除术。分别于移植后1,2,3,4周检查滤过泡的形态和功能,用链酶亲和素免疫组织化学法检测滤过泡周围组织中血小板衍生生长因子的含量。结果与结论:新鲜羊膜组和保存羊膜组移植后滤过泡轻微隆起,有较好的滤过功能;观察病理组织切片表明滤过道内成纤维细胞增生较少,瘢痕组织也比较疏松。空白组滤过道被增生的纤维组织代替,成纤维细胞比较多。免疫组化结果显示,新鲜羊膜组和保存羊膜组的血小板衍生生长因子的表达少于空白组,新鲜羊膜组的表达少于保存羊膜组。提示新鲜羊膜和保存羊膜能改善滤过泡功能,减少瘢痕形成,维持滤过道的通畅,并且新鲜羊膜的作用效果优于保存羊膜。     

人源化SCID小鼠模型的建立及其鉴定

目的：探讨在SCID小鼠体内移植人免疫细胞，建立人源化SCID小鼠模型及其特性鉴定。方法：SCID小鼠腹腔注射环磷酰胺（CTX）抑制骨髓造血，连续4天后，通过腹腔注射移植人外周血单个核细胞（PBMC）。4、8和12周后分别取小鼠外周血、脾脏、肝脏。荧光显微镜下观察SCID小鼠外周血中人CD3^＋、CD19^＋细胞；流式细胞仪测定全血中人CD3^＋、CD19^＋细胞百分率；免疫组织化学分析SCID小鼠肝脏和脾脏中人CD3^＋、CD19^＋细胞；ELISA检测SCID小鼠血清中人免疫球蛋白含量。结果：（I）SCID小鼠移植人外周血单个核细胞4、8和12周后在小鼠外周血中通过荧光显微镜下可观察到人CD3^＋、CD19^＋细胞，4周后流式细胞仪测得小鼠外周血单个核细胞中人CD19^＋、CD3^＋细胞百分率分别为10．6％、31．7％；（2）免疫组织化学结果显示在小鼠脾脏中存在人CD3^＋、CD19^＋细胞；（3）移植人外周血单个核细胞4、8和12周后ELISA测得小鼠血清中人免疫球蛋白的含量分别为390、1100和1040μg／ml。结论：成功地在SCID小鼠体内建立了人免疫系统。     

T细胞、sIL-2R和TNF检测对评价自体脾移植功能的临床意义

为探讨自体脾移植术对免疫学指标的影响, 作者对脾切除组与脾移植组的外周血T细胞亚群(CD3+、CD4+、CD8+)百分率、sIL-2R和TNF进行检测, 并进行对比分析. 结果显示,术后一周, 脾移植组外周血CD3+、CD4+、CD8+百分率和CD4+/CD8+比值降低, 而sIL-2R和TNF升高(P＜0.05), 至术后三个月逐渐接近正常; 而脾切除组, 术后外周血CD3+、CD4+、CD8+百分率和CD4+/CD8+比值持续下降, sIL-2R和TNF持续升高. 自体脾移植对维持机体的T细胞水平和增强机体的抗感染能力具有重要的临床意义.     

新鲜羊膜与生物羊膜移植治疗翼状胬肉的疗效对比

目的探讨新鲜羊膜和成品生物羊膜移植治疗翼状胬肉的治疗效果。方法收集初发的翼状胬肉患者60例（78眼），随机分成新鲜羊膜组和生物羊膜组2组，术后观察角膜上皮愈合情况，羊膜移植片成活和动态变化，翼状胬肉的复发率等指标，随访6～12个月。结果手术均一次成功，无免疫排斥反应。3～4d角膜上皮修复，2周左右可见羊膜开始融解、吸收。随访期内新鲜羊膜组有3眼胬肉复发，复发率为7．89％，生物羊膜组4眼发病，复发率为10％，两组间的复发率比较没有统计学差别（P〉0．05）。结论新鲜羊膜和成品生物羊膜移植均可降低翼状胬肉术后的复发率，而成品羊膜因取用方便，安全性高而值得推广使用。     

诱导骨髓间质干细胞分化为角膜上皮样细胞的初步研究

目的: 观察人骨髓间质干细胞（MSCs）移植到兔角膜基质后的分化发育情况，探讨MSCs分化为角膜上皮细胞的可行性。方法: 24只新西兰兔随机分为2组。实验组：将人MSCs接种在保存人羊膜上培养4 d，用5-溴脱氧尿嘧啶（BrdU）标记后移植到兔角膜基质；对照组：采用保存羊膜移植到兔角膜基质。分别于移植后1、2、3、4、6和8周，摘取各组实验眼行组织学和免疫组织化学检查，检查移植到兔角膜基质的MSCs的存活、形态变化以及移植局部的反应等情况；免疫组织化学检测移植到角膜基质的带有BrdU标记的细胞角蛋白K3/12（CK3/CK12）和角蛋白K13（CK13）的表达。结果: MSCs接种到羊膜后能在羊膜上生长，与羊膜共培养4 d后，MSCs贴附羊膜生长迅速，组织学特征无明显改变。羊膜负载MSCs移植到兔角膜基质表面, 术后免疫组织化学检测角膜上皮层CK3/CK12表达阳性， CK13表达阴性，在重建的角膜上皮层可检测到BrdU核阳性细胞并同时表达角膜上皮细胞特异性表面标志蛋白K3/K12，未发生免疫排斥反应，未见异常增殖细胞。结论: 羊膜负载MSCs移植到兔眼表角膜基质后，MSCs能存活、增殖并向角膜上皮样细胞分化。     

雌激素处理DCs在诱导小鼠同种皮肤移植免疫耐受中的作用

目的：研究雌二醇（17β-estradiol, E₂）处理的供体骨髓来源树突细胞（dendritic cells, DCs）在诱导小鼠同种异基因皮肤移植免疫耐受中的作用。方法：体外培养小鼠骨髓来源DCs，然后用E₂处理。受体小鼠在皮肤移植前经尾静脉分别输注经E₂处理的供体小鼠DCs、供体小鼠成熟DCs以及不成熟DCs，输注PBS为对照组。1周后对受体小鼠进行同种异基因皮肤移植，手术后观察皮肤存活情况，应用流式细胞术检测手术前后受体小鼠外周血中CD4+CD25+调节性T细胞百分率的变化。结果：在同种异基因皮肤移植中，受体小鼠尾静脉输注经E2处理的DCs组与对照组和不成熟DCs组比较，移植皮肤存活时间显著延长，较不成熟DCs组存活时间平均延长10.6 d（P<0.01）；与对照组和不成熟DCs组比较，E₂处理组外周血中CD4+CD25+ 调节性T细胞百分率明显升高（P<0.01）。结论：在同种异基因小鼠皮肤移植模型中，E₂处理的供体小鼠DCs可以延长移植皮肤存活时间。     

Chronic smoke exposure alters the phenotype pattern and the metabolic response in human alveolar macrophages

Smoking induces a chronic inflammatory process in the lower respiratory tract, where the alveolar macrophages (AM) are the main phagocytes. In the present study, the expressions of different membrane glycoproteins (CD11abc, CD71, CD54, CD14 and CD16) were determined by flow cytometry in AM from smokers and non-smokers after quenching of the intracellular autofluorescence. The metabolic activity of the AM was quantified as a functional test. The expressions of CD11a, CD54 and CD71 were higher in non-smokers' AM than in smokers'. The expressions of CD11b and CD16 were similar between the groups, while the CD11c was higher in smokers' AM compared with non-smokers’. The expression of CD14 was weak in both groups, therefore there was no clear-cut difference between the background and positively labelled cell populations. The metabolic response after in vitro stimulation with the phorbol ester phorbol myristate acetate (PMA) was higher in non-smokers' than in smokers' AM. Our results indicate that chronic exposure to tobacco smoke influences both the expression of AM membrane antigens and the metabolic activity. AM from non-smokers express a phenotype more related to cell proliferation and an accessory function. In contrast, receptors reflecting adhesion and phagocytosis were unaltered or even increased in smokers' AM. The findings suggest a functional change in the AM population after chronic smoke exposure.     

培养前后脐血CD34~＋细胞在NOD/SCID鼠体内造血重建功能的比较

目的:以NOD/SCID小鼠为模型, 经半致死剂量照射后输注新鲜或培养后的造血细胞, 以比较培养前后脐血CD34 细胞的造血重建功能.方法:从新鲜脐血中分离单个核细胞(MNC), 采用干细胞因子(SCF)、血小板生成素(TPO)、Flt3配体(FL)、白细胞介素3(IL-3)和白细胞介素6(IL-6)细胞因子组合体外培养14 d.通过MiniMACS免疫磁性吸附柱从新鲜或培养后的MNC中分离CD34 细胞, 4×105个CD34 细胞和5×106CD34-细胞混合后通过尾静脉输注入NOD/SCID小鼠中.饲养过程中动态观察外周血象恢复情况, 6周后检测小鼠骨髓和脾脏细胞中人源细胞及各系造血细胞的含量.结果:体外培养MNC 14 d后, 总细胞扩增了1.78倍;细胞移植6周后, 输注新鲜和培养后造血细胞的小鼠均存活, 在小鼠骨髓和脾脏中均可检测到人源细胞及各系人源血细胞和人特异ALU基因序列, 小鼠外周血象恢复到辐照前水平.培养后CD34 细胞在小鼠体内的植入水平与新鲜CD34 细胞的相近, 而其各系人源血细胞的含量高于新鲜CD34 细胞. 结论:体外培养14 d后的CD34 细胞仍保持了体内植入和重建造血的能力, 且其多系造血重建能力优于新鲜CD34 细胞.     

Immunolocalization of the Inducible Nitric Oxide Synthase Isoform in Human Fetal Membranes

PROBLEM: Nitric oxide (NO) synthesized by fetal membranes may protect the fetus from maternal infection or immune challenge or have a tocolytic effect on myometrium. The sites of synthesis and enzymes responsible for NO production in human fetal membranes remain unidentified. METHOD OF STUDY: Fetal membranes were obtained from four groups of patients: term (>37 weeks gestation) or preterm (<37 weeks gestation), both either in labor or not in labor. Frozen sections of membrane rolls were immunostained for inducible (iNOS) and endothelial (eNOS) nitric oxide synthase isoforms and the monocyte/macrophage marker CD14. RESULTS: Positive iNOS immunostaining was found in fibroblasts of amnionic and chorionic mesenchyme and in decidual macrophages identified by CD14 from all four groups of tissues. No iNOS immunostaining was seen in amnion epithelium or chorion trophoblast. Very intense iNOS staining was seen with evidence of monocyte/macrophage invasion of membranes. eNOS immunostaining was only found in decidual vascular endothelium. CONCLUSIONS: Constitutive expression of iNOS in decidual macrophages and fetal membrane fibroblasts may form an immune barrier against maternal insult. In chorioamnionitis, macrophage recruitment and NO expression may be part of the maternal immune response.     

新鲜羊膜致I型超敏反应的变应原性研究

研究新鲜人羊膜的变应原性及其致敏后发生I型超敏反应的可能性。建立豚鼠全身主动过敏实验模型。分新鲜羊膜组、新鲜蛋清组(阳性对照)和PBS液组(阴性对照),每组10只豚鼠。观察豚鼠在致敏期和激发后的反应,采用化学荧光法检测外周血组胺含量,血液流变分析系统检测4项血液流变学指标(全血高切变率黏度、全血低切变率黏度、血浆黏度、红细胞聚集指数)。致敏期间各组豚鼠的体重变化无明显差别(P>0.05);激发后羊膜组豚鼠与阴性组表现一致,无异常反应;羊膜组外周血组胺含量及4项血液流变学指标均与阴性对照无明显差别(P>0.05),与阳性对照有显著性差异(P<0.01)。经规范化无菌处理后的新鲜羊膜,一般不具有变应原性,不会引起I型超敏反应。     

Phenotypic study of peripheral blood leucocytes in HTLV-I-infected individuals from Minas Gerais,Brazil

The human T-cell lymphotropic virus type I (HTLV-I)-associated myelopathy/tropical spastic paraparesis (HAM/TSP) associated with the HTLV-I is a well-defined clinical-pathological entity in which the virus and host immune responses contribute to the pathological mechanism. In this study, flow cytometric analysis of whole peripheral blood leucocytes (PBL) was performed to evaluate the immunological status of HTLV-I-infected individuals in an effort to better understand the role of the immune system in the development of HAM/TSP. We have evaluated three groups of infected patients including asymptomatic (AS = 18), ambulatory/oligosymptomatic (AM = 14) and hospitalized HAM/TSP individuals (HO = 42). Noninfected healthy blood donors were used for the control group (NI = 32). Our results demonstrated that the HO group presents an increased percentage of circulating T cells and a decreased percentage of B and natural killer (NK) cells, leading to the highest T/B-cell ratio in comparison with the other groups. Interestingly, while an increased percentage of activated CD4+HLA-DR+ T lymphocytes was observed in both AM and HO, only HO presented higher percentage of activated CD8+HLA-DR+ in combination with the highest CD18 surface expression. This was true for all cell populations analysed, including T lymphocytes, monocytes and neutrophils. Moreover, the HO group was distinguished by a dramatic decrease in the percentage of CD8+CD28+ lymphocytes. Taken together, these findings demonstrate a potent cellular immune activation response involving primarily CD8+ T cells that is concomitant with disease progression in HAM/TSP. We also show that an upregulation of CD18 expression, a hallmark for increased cell migratory potential, might play a critical role in the development/maintenance of HAM/TSP.     

异种角膜基质异位移植对大鼠外周血T细胞亚群的影响

目的: 比较3种异种角膜基质的免疫原性。方法: 将SD大鼠36只随机分为4组,每组9只。1组为对照组,2-4组为实验组。分别获取新鲜猪、兔、鸡角膜基质,等量湿重25 mg异位植入大鼠背部皮下,术后观察伤口愈合情况,并于术后7 d、14 d、28 d获取大鼠外周血,免疫荧光标记及流式细胞仪分析比较3种异种角膜基质对大鼠CD4⁺、CD8⁺、CD25⁺、CD71⁺表型的动态影响。结果: 各组植入处皮肤无红肿、无渗出及其它改变,伤口愈合良好;各组与对照组比较:猪角膜基质组各时相表达的CD4⁺、CD8⁺、CD25⁺、CD71⁺T细胞比例无显著差异(P＞0.05);兔角膜基质组术后7 d,CD4⁺T细胞升高(P＜0.05),鸡角膜基质组术后7 d,CD4⁺、CD4⁺CD71⁺升高(P＜0.01)。结论: 3种异种角膜基质对大鼠细胞免疫原性比较:鸡>兔>猪,猪角膜基质的免疫原性最低。     

游离血红蛋白及其受体CD163在大鼠动脉粥样硬化过程中的作用

目的： 研究游离血红蛋白对大鼠动脉粥样硬化发生发展的影响及机制，并探讨血红蛋白清道夫受体CD163在此过程中的作用。方法: 30只雄性SD大鼠随机分为对照组（C组）、动脉粥样硬化组（模型组，A组）和血管内溶血动脉粥样硬化组（溶血组，P组）。建立血管内溶血动脉粥样硬化模型。14周后检测血清游离血红蛋白（FHb）、丙二醛（MDA）水平；观察主动脉病理学变化；免疫组化及免疫印迹法观察并分析斑块内CD163和血红素氧合酶-1(HO-1)表达。结果: P组及A组FHb、MDA、CD163和HO-1水平明显高于C组。P组主动脉斑块占内膜总面积比(RAAPIs)、FHb、MDA、CD163和HO-1水平明显高于A组，内膜/中膜面积比（I/M）无明显差异（P>0.05）。斑块内CD163和HO-1表达部位及细胞形态一致。血浆FHb水平与斑块内CD163和HO-1表达彼此间呈正相关（r=0.526，r=0.498，r=0.653；P<0.01）。结论: 游离血红蛋白可通过参与脂质过氧化促进动脉粥样硬化的发生发展，并诱导斑块内CD163和HO-1表达上调。     

Prostaglandin endoperoxide H synthase mRNA expression in the human amnion and decidua during pregnancy and in the amnion at preterm labour

We have examined the expression of prostaglandin endoperoxide H synthase (PGHS) isoenzymes in the amnion and the decidua during gestation, and the abundance of PGHS mRNA in the amnion at idiopathic preterm labour. PGHS-1 and -2 mRNA abundance in the amnion, determined with ribonuclease protection assays, was significantly (P< 0.05) higher at term than earlier during pregnancy. In contrast, neither PGHS-1 and -2 mRNA values, nor PGHS-specific activity, measured with a cell-free assay, was different in the decidua at term as compared to earlier gestational ages. In individual term patients, PGHS-2 mRNA values in the amnion were positively correlated with PGHS-2 mRNA values in the chorion laeve. PGHS-1 and -2 mRNA abundance was higher (P < 0.05) in the amnion after idiopathic preterm labour than in the absence of labour at the same gestational age (28-35 weeks). Thus, PGHS-1 and -2 are induced in the amnion at term. Furthermore, amniotic PGHS-2 changes in co-ordination with PGHS-2 concentrations in the chorion laeve. PGHS is not induced in the decidua at term. Increased amniotic PGHS expression may contribute to the enhanced intrauterine prostaglandin synthesis before term labour. Both PGHS isoenzymes may participate in the increase of PGHS activity in the amnion at preterm birth.     

同种异体大鼠的主动脉移植后影响移植物钙化的因素分析

目的：探讨同种异体大鼠的主动脉移植后影响移植物钙化的因素。方法：研究分为2组，即异基因组和同基因组。异基因组中SD大鼠为供体，Wistar大鼠为受体；同基因组中受体和供体均为Wistar大鼠。两组再随机分为5个小组，每组8只，进行大鼠同种异体带瓣主动脉腹主动脉的异位移植。分别于术后2、4、8、12、16wk，以流式细胞术测定大鼠血液中CD25、CD71的表达。取出移植物，用原子火焰吸收法测定钙的含量，用光镜和电镜观察移植物的形态学变化，用免疫组化染色法测动脉壁CD40的表达：结果：（1）异基因组移植后各个时间点，CD40、CD25和CD71的表达均较同基因组高（P〈0．01）。异基因组CD25、CD71和CD40表达的高峰主要在移植后的早期（2～4wk），此后表达的水平逐渐下降，12nk后维持在低水平。（2）异基因组移植物的钙含量从移植后第4周开始升高，随着时间的推移逐渐升高，在12wk达到高峰，此后进入平台期。同基因组各个时间点的钙含量无差别（P〉0．05）。（3）移植后异基因组的移植物出现内皮细胞脱落和平滑肌细胞坏死。结论：同种瓣移植后移植物中的钙含量与免疫排斥反应关系密切；钙含量并不与时间完全呈正相关，在移植后4wk才开始钙化：随着时间的推移，钙含量逐渐升高，在12wk达到高峰，此后进入平台期。移植后不同时间点移植物中的钙含量并不与当时的免疫排斥反应的程度成正相关，二者互相影响。