人胚胎干细胞的研究进展

人胚胎干细胞(hES细胞)是由早期人类胚胎内细胞团或原始生殖细胞(PGCs)经体外分化抑制培养而建立的克隆细胞系，具有多种增殖和分化潜能。其生物学特征包括：正常的核型、高端粒酶活性及表达阶段特异性胚胎抗原等。细胞因子及细胞培养条件对胚胎干细胞分化有着重要的影响作用。     

胚胎干细胞的研究进展

胚胎干细胞（ESC）是来源于哺乳动物早期胚胎的内细胞团中的一种二倍体细胞,具有发育的全能性。ESC的体内和体外分化在分子水平有许多相似之处。在现有培养条件下。小鼠ESC体外分化的细胞类型或结构主要有4种：内皮细胞与血管,肌细胞和心肌、造血细胞和神经细胞,最近的研究提示;造血干细胞（HSC）来源于胚胎内的特定区域,HSC的产生可能受尚未发现的胚胎生长因子调节。ESC为从胚胎着手明确早期造血过程提供了方便有效的实验途径。人ESC的研究及应用尚面临一系列伦理问题,对ESC的研究具有广阔的应用前景。     

人胚胎脊髓神经干细胞的体外培养条件及分化特征

目的：观察人胚脊髓神经干细胞的体外培养条件及分化情况。 方法：实验于2004-10／2005-04在西安交通大学医学院神经生物教研室完成。①从7～10周胚龄流产人胚胎脊髓分离脊髓神经干细胞（家属知情同意），采用无血清培养技术进行原代和传代培养。培养液组成：DMEM／F12（1：1），表皮生长因子20μg／L，碱性成纤维细胞生长因子20μg／L，重组人白血病抑制因子10μg／L，N2添加剂（终浓度为10mL/L）。②并采用免疫荧光法检测细胞的分化情况。 结果：①人胚脊髓神经干细胞形态学观察：原代细胞培养得到大量悬浮生长的神经干细胞球，形态较规则，呈圆形，细胞边界清楚，折光性强。部分细胞贴壁生长继而分化。传代培养后，细胞团生长速度明显加快；传3代以后脊髓神经干细胞易贴壁。②人胚脊髓神经干细胞的鉴定和分化结果：神经干细胞球，巢蛋白染色阳性；可诱导分化为神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞。 结论：人胚胎脊髓分离培养得到的细胞具有脊髓神经干细胞的基本特征，可进一步用于基础及临床研究。     

人胚胎脊髓神经干细胞的体外培养条件及分化特征

目的:观察人胚脊髓神经干细胞的体外培养条件及分化情况。方法:实验于2004-10/2005-04在西安交通大学医学院神经生物教研室完成。①从7～10周胚龄流产人胚胎脊髓分离脊髓神经干细胞(家属知情同意),采用无血清培养技术进行原代和传代培养。培养液组成:DMEM/F12(1∶1),表皮生长因子20μg/L,碱性成纤维细胞生长因子20μg/L,重组人白血病抑制因子10μg/L,N2添加剂(终浓度为10mL/L)。②并采用免疫荧光法检测细胞的分化情况。结果:①人胚脊髓神经干细胞形态学观察:原代细胞培养得到大量悬浮生长的神经干细胞球,形态较规则,呈圆形,细胞边界清楚,折光性强。部分细胞贴壁生长继而分化。传代培养后,细胞团生长速度明显加快;传3代以后脊髓神经干细胞易贴壁。②人胚脊髓神经干细胞的鉴定和分化结果:神经干细胞球,巢蛋白染色阳性;可诱导分化为神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞。结论:人胚胎脊髓分离培养得到的细胞具有脊髓神经干细胞的基本特征,可进一步用于基础及临床研究。     

体外培养人胚胎干细胞饲养层的研究进展

人胚胎干细胞在体外培养过程中始终保持未分化和持续增殖能力的首要条件是要有饲养层的支持。目前常用的饲养层有小鼠成纤维细胞、小鼠原代成纤维细胞、同源动物胚胎成纤维细胞、人包皮成纤维细胞等。饲养层细胞能分泌多种细胞因子、细胞问黏附分子及蛋白质,能有效抑制胚胎干细胞的分化并促进其增殖。现就胚胎干细胞培养过程中所需饲养层细胞的来源与筛选、分泌物及作用机制研究进展作一综述。     

胚胎干细胞的体外诱导分化模型

目的：胚胎干细胞是具有全能性及无限制自我更新与分化能力的一类特殊细胞群体，通过对胚胎干细胞诱导分化研究的回顾和总结，期望能给胚胎干细胞的临床应用提供理论参考。资料来源：应用计算机检索Highwire press以及Medline数据库2000／2004期间的相关章。检索词为“Embryonic stem cell，differentiation．induce”，同时计算机检索万方数据库2000／2004期间的相关章，检索词为“胚胎干细胞”，限定章类型为中。资料选择：对资料进行初审，选取与诱导分化有关的章，纳入标准为研究原。资料提炼：选取与诱导分化有关的章共369篇(其中外364篇)。通过阅读相关献的要，从中选取15篇较全面介绍胚胎干细胞的诱导分化以及应用的章。其中，全面介绍胚胎干细胞各种细胞模型，神经细胞模型，心肌细胞模型，上皮细胞模型，造血细胞模型。资料综合：7篇献较为全面的介绍胚胎干细胞可以诱导分化为神经细胞、心肌细胞、上皮细胞以及造血细胞等细胞模型，从以上献以及单独介绍各种细胞模型的章中分别对各种细胞模型的研究概况进行归纳整理。结论：胚胎干细胞经过定向诱导分化后可获得神经细胞．心肌细胞．上皮细胞以及造血细胞等细胞模型，这些模型可以用于细胞发育分化的分子机制．并对药物筛选和临床细胞治疗提供良好应用前景．     

胚胎干细胞向心肌细胞的分化

目的：了解国内外在胚胎干细胞向心肌细胞分化的机理及其应用潜能等方面的研究现状。资料来源：应用计算机检索Medline，检索时间为1997／2005，检索词限定为“embryonic stem cell，cardiomyocyte／cardiac myocyte．differentiation”，并限定语言种类为英文。资料选择：对所检索到的文献进行初审，纳入标准：符合胚胎干细胞向心肌细胞分化的文章。排除标准：重复性研究。资料提炼：共查找文献200余篇，筛选出26篇。资料综合：收集到多篇关于胚胎干细胞分化为心肌细胞的文章，从最初获得胚胎干细胞源性心肌细胞的实验方法的建立到在单细胞水平对胚胎干细胞源性心肌细胞进行电生理研究。进一步，很多研究者从转录因子的角度研究了控制心脏发育的转录因子在胚胎干细胞向心肌细胞分化过程中的表达，研究表明心脏转录因子GATA4、肌细胞增强因子2C和NKx2．5控制着心脏基因的表达，它们在心脏发生过程中发挥重要的转录调控作用。研究同时发现，钙调神经磷酸酶信号通路、MAPK信号通路以及其他信号通路参与了心肌细胞分化的调节。此外，从胚胎干细胞纯化分化的心肌细胞用于治疗心肌梗死亦是一个关键问题。结论：当胚胎干细胞以胚小体的形式在没有白血病抑制因子的条件下培养时，一些干细胞可以分化成心肌细胞。干细胞来源的心肌细胞表达一些收缩蛋白，如MHC和肌球蛋白轻链-2V。转录因子GATA4、肌细胞增强因子2C和NKx2．5在心肌细胞分化中发挥重要作用，并且可以触发特异基因如α-肌动蛋白、MHC和肌球蛋白轻链-2V的表达，然而，胚胎细胞向心肌细胞分化的分子机制还有待进一步研究，鉴别出促进心脏分化的因子是研究心脏分化的基础所在。     

胚胎干细胞的体外诱导分化模型

目的胚胎干细胞是具有全能性及无限制自我更新与分化能力的一类特殊细胞群体,通过对胚胎于细胞诱导分化研究的回顾和总结,期望能给胚胎干细胞的临床应用提供理论参考.资料来源应用计算机检索Highwire press以及Medline数据库2000/2004期间的相关文章,检索词为"Embryonic stem cell,differentiation,induce",同时计算机检索万方数据库2000/2004期间的相关文章,检索词为"胚胎干细胞",限定文章类型为中文.资料选择对资料进行初审,选取与诱导分化有关的文章,纳入标准为研究原著.资料提炼选取与诱导分化有关的文章共369篇(其中外文364篇).通过阅读相关文献的摘要,从中选取15篇较全面介绍胚胎干细胞的诱导分化以及应用的文章.其中,全面介绍胚胎干细胞各种细胞模型,神经细胞模型,心肌细胞模型,上皮细胞模型,造血细胞模型.资料综合7篇文献较为全面的介绍胚胎干细胞可以诱导分化为神经细胞、心肌细胞、上皮细胞以及造血细胞等细胞模型,从以上文献以及单独介绍各种细胞模型的文章中分别对各种细胞模型的研究概况进行归纳整理.结论胚胎干细胞经过定向诱导分化后可获得神经细胞、心肌细胞、上皮细胞以及造血细胞等细胞模型,这些模型可以用于细胞发育分化的分子机制,并对药物筛选和临床细胞治疗提供良好应用前景.     

胚胎干细胞向心肌细胞的分化

目的:了解国内外在胚胎干细胞向心肌细胞分化的机理及其应用潜能等方面的研究现状。资料来源:应用计算机检索Medline,检索时间为1997/2005,检索词限定为“embryonicstemcell,cardiomyocyte/cardiacmyocyte,differentia-tion”,并限定语言种类为英文。资料选择:对所检索到的文献进行初审,纳入标准:符合胚胎干细胞向心肌细胞分化的文章。排除标准:重复性研究。资料提炼:共查找文献200余篇,筛选出26篇。资料综合:收集到多篇关于胚胎干细胞分化为心肌细胞的文章,从最初获得胚胎干细胞源性心肌细胞的实验方法的建立到在单细胞水平对胚胎干细胞源性心肌细胞进行电生理研究。进一步,很多研究者从转录因子的角度研究了控制心脏发育的转录因子在胚胎干细胞向心肌细胞分化过程中的表达,研究表明心脏转录因子GATA4、肌细胞增强因子2C和NKx2.5控制着心脏基因的表达,它们在心脏发生过程中发挥重要的转录调控作用。研究同时发现,钙调神经磷酸酶信号通路、MAPK信号通路以及其他信号通路参与了心肌细胞分化的调节。此外,从胚胎干细胞纯化分化的心肌细胞用于治疗心肌梗死亦是一个关键问题。结论:当胚胎干细胞以胚小体的形式在没有白血病抑制因子的条件下培养时,一些干细胞可以分化成心肌细胞。干细胞来源的心肌细胞表达一些收缩蛋白,如MHC和肌球蛋白轻链-2V。转录因子GATA4、肌细胞增强因子2C和NKx2.5在心肌细胞分化中发挥重要作用,并且可以触发特异基因如α-肌动蛋白、MHC和肌球蛋白轻链-2V的表达,然而,胚胎细胞向心肌细胞分化的分子机制还有待进一步研究,鉴别出促进心脏分化的因子是研究心脏分化的基础所在。     

人胚胎神经干细胞分离、培养、纯化及增殖潜能的特点

目的：探讨获取和培养人胚胎神经干细胞的方法。方法：实验于2003-09／2004—12在重庆医科大学基础研究所完成。人胚胎来源为7-12周人工药物流产胎儿，由重庆医科大学附属第二医院及重庆市妇幼保健院提供，征得产妇本人同意。①从人胚胎大脑皮质中分离、培养、纯化原代神经干细胞，经体外反复传代培养以获得能在体外长期生存的神经干细胞。②免疫细胞化学鉴定神经干细胞特异性表达抗原。⑧观察不同种植细胞密度对神经干细胞增殖的影响，分析其生长特点并绘制生长曲线。④采用悬浮细胞培养法扩增细胞，冷冻复苏后观察细胞的生物学特性。结果：①人胚胎神经干细胞体外生长特点：从7～12周流产胎儿大脑皮质中获得了能在体外长期生存的神经干细胞。经体外传至15代，神经干细胞细胞数量扩增至200倍。②神经干细胞接种密度对增生的影响：当种植细胞的密度为1&;#215;10^5L^-1,1&;#215;10^7L^-1时，体外培养30d后仍呈单细胞贴壁状态。以1&;#215;10^9L^-1细胞密度接种时，12h后即见多个单细胞聚成的小球，悬浮生长。③神经干细胞自我更新能力的检测结果：多数单个细胞在培养后24～48h分裂为2-4个细胞的小克隆，7～10d均发展为上百个细胞的较大的克隆。④nestin抗原的表达：培养的神经干细胞神经球nestin免疫细胞染色均呈阳性。⑤神经干细胞多向分化能力检测：NSE和GFAP免疫细胞化学染色显示，被测细胞胞浆有棕黄色颗粒沉着，呈阳性表达。⑥神经干细胞复苏后的存活率：冻存1，4，8，12周的神经干细胞存活率基本相似[（80．2&;#177;1．8）％，（80．1&;#177;1．2）％，（79．9&;#177;0．8）％，（80．1&;#177;2．1）％，P〉0．05]。结论：成功地从人胚胎大脑皮质中分离得到了神经干细胞。经体外培养证明：人胚胎神经干细胞具有自我更新增殖能力和向神经元样细胞、星形胶质样细胞分化的潜能。     

小鼠囊胚在胚胎成纤维细胞饲养层上向胚胎干细胞的生长发育

背景:到目前为止已建立了数百个小鼠胚胎干细胞系,一般情况下实验室培养的胚胎干细胞有3个细胞来源,即胚泡内的内细胞群、胚胎生殖嵴的原始生殖细胞和应用克降技术制造人体胚胎并提取干细胞.目的:尝试用自制的小鼠胚胎成纤维细胞饲养层分离培养小鼠胚胎干细胞.设计、时间及地点:细胞学体外观察,于2005-12/2007-09在辽宁医学院完成.材料:妊娠14.5 d的孕鼠40只,由辽宁医学院实验动物中心提供.方法:无菌条件下剪开孕鼠子宫壁,取出胚胎,去除头、尾、内脏和四肢后采用胰蛋白酶消化法分离培养小鼠胚胎成纤维细胞,经丝裂霉素C处理3.5 h后接种于6孔板中,细胞贴壁后即为成纤维细胞饲养层.收集3.5 d的小鼠囊胚,在显微镜下将囊胚置于上述6孔板的中央,五六_人后取隆起生长的内细胞团块,分离后再培养.主要观察指标:成纤维细胞饲养层的制备情况,胚胎干细胞的生长状态、碱性磷酸酶染色结果及分化趋势.结果:光镜下小鼠胚胎成纤维细胞呈不规则形,生长较快,传代比例为1:4,经丝裂霉素C处理后细胞贴壁较慢,失去分裂增殖能力.小鼠囊胚孵出透明带的时间为24～72 h,从胞膜中孵出约为1 d,3～5 d后可形成胚胎干细胞集落,7 d后集落呈"鸟巢"状.组织化学染色后可见细胞内有大量的蓝紫色颗粒沉积,连续培养20 d,期间不换培养液,可见胚胎干细胞团分化为亮度较小、界限清楚的单核细胞.结论:小鼠囊胚在胚胎成纤维细胞饲养层上可发育成胚胎干细胞,并能进行传代.     

Inhibiting HDAC for human hematopoietic stem cell expansion

In this issue of the JCI, Chaurasia and colleagues report an impressive ex vivo expansion of HSCs from human cord blood (CB) using cytokines and altering epigenetic modifications. The application of this protocol provides information that has potential for clinical consideration. The enhanced expansion of CB HSCs is a substantial advance over recent work from the Chaurasia and Hoffman group, in which ex vivo production of human erythroid progenitor cells from CB was promoted by chromatin modification. Moreover, this study takes advantage of information from the rapidly emerging, but not yet fully elucidated, field of epigenetics.     

Guideline for the human stem cell clinical research

The regenerative researches using human stem cells will be able to solve problems such as incurable diseases and the supply of human organs for transplantation which run short. These researches are also expected to produce business. On the other hand, there are various levels of human stem cells researches from already established to primitive in both safty and ethics. In this situation, a guideline for the human stem cell clinical research will be expected to perform appropriate clinical researches. Then, the Ministry of Health, Labour and Welfare composed a special committee about clinical research using human stem cells in the health, labour and welfare science council, technology section, and will decide upon a guideline on January 29, 2002.     

Development of hematopoietic stem cell gene therapy for Wiskott-Aldrich syndrome

Wiskott-Aldrich syndrome (WAS) is a complex primary immunodeficiency disorder associated with microthrombocytopenia, autoinnmunity and susceptibility to malignant lymphoma. At the molecular level, this rare disorder is caused by mutations in the gene encoding the Wiskott-Aldrich syndrome protein (WASP). WASP is a cytosolic adaptor protein mediating the rearrangement of the actin cytoskeleton upon surface receptor signaling. Allogenic hematopoietic stem cell (HSC) transplantation represents a curative approach but remains problematic in light of severe risks and side effects. Recently, HSC gene therapy has emerged as an alternative treatment option. Cumulative preclinical data obtained from WASP-deficient murine models and human cells indicate a marked improvement of the impaired cellular and immunological phenotypes associated with WASP deficiency. The first clinical trial is currently being conducted to assess the feasibility, toxicity, and potential therapeutic benefit of transplanting autologous WASP-reconstituted hematopoietic stem cells.     

Human embryonic stem cells: possibilities for human cell transplantation

Human embryonic stem (ES) cells serve as a potentially unlimited renewable source for cell transplantation targeted to treat several diseases. One advantage of embryonic stem (ES) cells over other stem cells under research is their apparently indefinite self-renewal capacity if cultured appropriately, and their ready differentiation into various cell phenotypes of all three germ layers. To date, a number of studies have reported the derivation of specific functional derivatives from human ES cells in vitro. While there have been clinical trials of human embryonal carcinoma (EC) cell-derived neurons in humans there has been no attempt as yet using human ES cell derivatives. However, the latter have been transplanted into recipient animals. In some cases ES-derived cells were shown to undergo further maturation, displayed integration with host tissue and even ameliorated the disease condition in the animal model. Recently, it has been reported that human ES cells can be genetically manipulated. Such procedures could be used to direct differentiation to a specific cell type or to reduce graft rejections by the modification of immune responses. This review highlights some of the recent advances in the field and the challenges that lie ahead before clinical trials using ES-derived cells can be contemplated.     

Human embryonic stem cells: Possibilities for human cell transplantation

Human embryonic stem (ES) cells serve as a potentially unlimited renewable source for cell transplantation targeted to treat several diseases. One advantage of embryonic stem (ES) cells over other stem cells under research is their apparently indefinite self‐renewal capacity if cultured appropriately, and their ready differentiation into various cell phenotypes of all three germ layers. To date, a number of studies have reported the derivation of specific functional derivatives from human ES cells in vitro. While there have been clinical trials of human embryonal carcinoma (EC) cell‐derived neurons in humans there has been no attempt as yet using human ES cell derivatives. However, the latter have been transplanted into recipient animals. In some cases ES‐derived cells were shown to undergo further maturation, displayed integration with host tissue and even ameliorated the disease condition in the animal model. Recently, it has been reported that human ES cells can be genetically manipulated. Such procedures could be used to direct differentiation to a specific cell type or to reduce graft rejections by the modification of immune responses. This review highlights some of the recent advances in the field and the challenges that lie ahead before clinical trials using ES‐derived cells can be contemplated.     

人胚胎脑皮质神经干细胞的体外分离及扩增特征

目的:观察从10￣12周胎龄人流产胚胎脑皮质分离、培养的神经干细胞的生长特性。方法:实验于2005-02/12在新桥医院神经外科实验室完成。实验对象为孕10￣12周流产的人胚胎脑皮质细胞,细胞的获取严格遵守医学伦理道德并得到医院许可。取胎龄10￣12周的流产胚胎皮质,吸管反复吹打机械分离制成单细胞悬液,使用DMEM/F12(1∶1)加B27的无血清培养基培养,同时加入碱性成纤维细胞生长因子、表皮细胞生长因子(均为20μg/L)以及白血病抑制因子(10μg/L)。连续传代培养,用有限稀释法观察神经干细胞的单细胞克隆情况。将部分经单细胞克隆扩增的细胞克隆种植于预先置有多聚赖氨酸涂布盖玻片的24孔培养板内,并加入新鲜培养基(体积分数为0.05的胎牛血清 DMEM/F12),采用免疫荧光细胞化学技术检测Nestin抗原和分化后特异性成熟神经细胞抗原的表达情况。结果:①从人胚胎脑皮质分离得到的纯化的单个细胞可以增殖形成细胞克隆,即使在培养基中使用各种细胞因子而不使用胎牛血清,部分细胞团块也会贴壁。②经单细胞克隆方式扩增而来的细胞克隆在胎牛血清诱导分化及多聚赖氨酸辅助贴壁作用数小时后观察细胞已贴壁。③从皮质分离的细胞群保持着未分化状态,能够自我更新以及具有多向分化潜能,其生长需多种细胞因子的联合刺激。结论:从10￣12周胎龄人流产胚胎脑皮质分离的中枢神经系统的细胞具有自我更新能力和多向分化潜能,证实是神经干细胞。不论刺激因子及血清的有无,神经干细胞一旦贴壁就会启动其分化程序,而不再保持其干细胞特征,因此悬浮生长状态是神经干细胞体外培养生长的一种特性。