FGF9转基因小鼠的功能及组织表达谱的研究

目的：研究突变昭朋转基因小鼠的功能变化，分析Fgf9及其受体Fgfr3的组织表达谱。方法：采用RT-PCR法克隆彤冈，在该基因296位引入点突变为（G→A）后插入pcDNA3．1（-）B载体，通过显微注射建立转基因小鼠；利用PCR法鉴定转基因小鼠基因型，RT-PCR及免疫组化鉴定转基因小鼠内源性Fgf9和Fgfr3的组织表达谱。结果：建立了12个系的转基因小鼠模型，虽未检测到转入基因的表达，但检测到内源性Vgf9和Fgfr3在心、脑、肾、肌肉和骨关节等组织中的表达情况。结论：获得rgf9和Fgfr3组织表达谱及在不同时期小鼠骨关节中的表达情况；推测转入基因未表达与FGF9转入后被沉默或抑制有关，为此正在建立特异点突变FGF9基因敲入小鼠模型。     

NUP98-PMX1转基因小鼠发生髓系白血病样表型

目的　在整体动物水平研究NUP98 PMX1融合蛋白的致白血病作用。方法　采用分子克隆技术构建含有NUP98 PMX1的转基因质粒 ,显微注射法建立转NUP98 PMX1基因的小鼠 ,以PCR、RT PCR方法检测融合基因的表达 ;用流式细胞仪检测骨髓细胞表型。结果　转染NUP98 PMX1融合基因的NIH3T3细胞生长加快 ,软琼脂上可形成集落 ,并使裸鼠致瘤。出现病态的 8只NUP98 PMX1转基因小鼠中有 4只发生粒细胞白血病样表型 ,其中 3只表现为人类慢性髓系白血病样表型。结论　NUP98 PMX1融合基因具有致瘤性 ,其表达在髓系白血病的发生中起着极为重要的作用。     

NUP98-HOXA9融合基因转基因小鼠的建立及乙烷亚硝基脲诱变的研究

目的从整体动物水平阐明NUP98 HOXA9融合蛋白在白血病发病机制中的作用。方法采用分子克隆技术构建含有NUP98 HOXA9的转基因质粒 ,经显微注射建立含有该融合基因的转基因小鼠 ,并对其细胞表型进行分析 ;采用PCR、RT PCR等技术进行转基因整合和表达检测 ;对表型正常的转基因小鼠用乙烷亚硝基脲 (ENU)诱变 ,观察转基因小鼠的表型变化。结果 5个单系的转基因小鼠在骨髓细胞中检出NUP98 HOXA9融合基因的稳定表达 ,但血常规、骨髓象及肝、脾等未见异常改变。ENU诱变后部分转基因阳性小鼠出现类似人类慢性髓系白血病的表现。结论NUP98 HOXA9融合基因产物能在转基因小鼠中表达 ,但不足以诱发白血病 ;ENU诱变结果提示转基因小鼠对ENU造成的第二次打击可提高白血病的易感性     

AML1-ETO融合蛋白对p14~(ARF)基因转录调控的影响

目的:探讨异常转录因子AML1-ETO融合蛋白对p14~(ARF)的转录调控机制。方法:应用荧光实时定量PCR(qRT-PCR)检测转染细胞和对照组细胞以及AML-M2患者白血病细胞p14~(ARF)mRNA的表达;用甲基化特异性聚合酶链反应(MSP)对其p14~(ARF)启动子的甲基化状态进行分析;染色质免疫沉淀技术(Ch IP)研究转染细胞中AML1-ETO与p14~(ARF)启动子之间直接的相互作用情况;应用qRT-PCR检测5-氮杂胞苷(5-Aza)处理后细胞内p14~(ARF) mRNA表达水平。结果:转染了AML1-ETO的U937细胞系和具有AML1-ETO融合基因的AM L-M2患者中,p14~(ARF)的mRNA表达水平下调;p14~(ARF)启动子在对照组细胞株和无AML1-ETO融合基因的AML-M2患者中处于非甲基化状态,在转染细胞株和具有AML1-ETO融合基因的AML-M2患者中处于高甲基化状态;转染细胞沉淀富集的DNA中含有p14~(ARF)的启动子序列;5-Aza能上调p14~(ARF)mRNA的表达。结论:p14~(ARF)是AML1-ETO融合蛋白可能的靶基因,p14~(ARF)启动子高甲基化所致的基因沉默可能是M2b型白血病发生发展的一个重要因素。     

AML1-ETO融合蛋白对BCL-2基因表达的影响

本研究旨在观察AML1-ETO在白血病细胞中对于抗凋亡基因日乳-2表达的影响,探讨其在白血病发生中的作用。应用流式细胞术检测急性单核细胞白血病细胞株U937-WT、U937-Mock和经AML1-ETO基因转染的U937-A／E1-4的细胞凋亡率;使用免疫印迹法检测cleavedcaspase-3蛋白的表达;荧光实时定量PCR检测转染细胞和对照组细胞以及AMLM2患者白血病细胞BCL-2mRNA的表达;染色质免疫沉淀技术研究转染细胞中AML1-ETO与BCL-2基因启动子之间直接的相互作用情况。结果表明：AML1-ETO转染细胞的凋亡率明显增加,且检测到cleavedcaspase-3蛋白的表达;转染了AML1—ETO 的U937细胞系和具有AML1—ETO融合基因的AML-M2患者中,BCL-2的mRNA表达水平显著下调;转染细胞沉淀富集的AML1-ETO直接结合的DNA中含有BCL-2基因的启动子序列。结论：BCL-2是AML-ETO的直接靶基因,AML1-ETO能下调BCL-2的表达。     

MYCN转基因斑马鱼对造血调控因子的影响

目的:通过热激活启动子条件性过表达鼠源性MYCN基因,建立生殖系稳定转染的斑马鱼系,以研究MYCN基因对造血调控因子转录的影响。方法:构建携绿色荧光蛋白"报告基因"的MYCN质粒,显微注射到斑马鱼胚胎单细胞期,通过荧光筛选出F0代,继而建立生殖系稳定转染的转基因鱼系。通过反转录聚合酶链反应(RT-PCR)、实时荧光定量PCR(real-time fluorogentic quantitative PCR,RFQ-PCR)及血涂片论证MYCN基因的过表达及其对造血调控因子的影响。结果:在256条嵌合表达的性成熟F0代斑马鱼中,鉴定发现有18条(7.0%)显示转基因阳性,其中雄鱼8条,雌鱼10条。同时,RFQ-PCR及外周血涂片均显示,转基因斑马鱼F1和F2代均发生明显的造血分化障碍,造血关键调控因子scl、mpo、gata1基因表达量明显下降。结论:斑马鱼在基因研究中具有直观及规模化优势,特别适用于单一基因的研究,MYCN基因产物可显著抑制红系生成和造血分化。     

AML1、AML1-ETO对nucb2基因转录调控活性的影响

本研究旨在探讨造血特异转录因子AML1及M2b型急性髓系白血病（AML-M2b）累及的异常融合蛋白AML1-ETO对凋亡相关基因nucb2（nucleobindin-2）启动子转录活性的影响,探索AML1-ETO对AML—M2h型白血病的分子致病机制。利用实时RT-PCR方法在AML1-ETO诱导型白血病细胞株中研究AML1-ETO在转录水平对于nucb2的调控情况;利用ChIP—qPCR方法在AML1-ETO阳性白血病细胞株中研究AML1、AML1-ETO与nucb2基因启动子之间直接的体内相互作用情况;采用双荧光素酶报告基因检测方法,研究AML1、AML1-ETO对nucb2启动子转录活性的调节作用。结果表明：AML1-ETO的表达与nucb2的表达呈负相关;nucb2可能是AML1、AML1-ETO的靶基因;AML1、AMLI—ETO皆对nucb2启动子具有转录抑制作用,且AML1-ETO对nucb2抑制更强。结论：nucb2是AML1、AML1-ETO的直接靶基因,AML1、AML1-ETO通过抑制nucb2启动子的活性对其进行转录调控。     

细胞因子信号转导抑制因子-1在脓毒症小鼠肝脏和脾脏中表达的研究

目的 观察细胞因子信号转导抑制因子-1(SOCS1)在脓毒症小鼠肝脏和脾脏中的变化情况,探讨SOCS在体内的可能作用机制.方法 采用盲肠结扎穿孔术(CLP)制备脓毒症小鼠模型.提取肝脏和脾脏组织的总RNA及蛋白,采用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)技术测定组织中SOCS1 mRNA的相对含量;用免疫印迹法测定组织中SOCS1相对蛋白含量;用SPSS统计软件分析上述指标之间的变化关系.结果 脓毒症小鼠术后6 h肝组织SOCS1的基因和蛋白表达均迅速升高,基因表达至24 h达到高峰(P＜0.05),蛋白表达一直保持高位;在脾脏中仅检测到SOCS1基因表达,随时间延长逐渐上升,并一直保持高位;肝脏中SOCS1的基因和蛋白表达量间呈明显正相关(y=0.110±5.765×10-3x,r=0.837,F=93.309,P＜0.01).结论 CLP导致的脓毒症可诱导SOCS1在肝脏和脾脏中进一步表达,提示SOCS1在脓毒症出现后的免疫变化中有重要作用,可利用它们对脓毒症进行干预,以改善脓毒症的预后.     

RT-PCR检测白血病融合基因的临床意义

本文综述应用逆转录-多聚酶链反应检测白血病融合基因 AML_1-ETO、PML-RARa和BCR-ABL的临床意义。     

细胞形态检查在伴AML1-ETO及CBFβ-MYH11阳性急性髓系白血病中的作用

目的探讨伴AML1-ETO和伴CBFβ-MYH11阳性急性髓系白血病患者骨髓细胞形态、免疫表型、染色体核型特点及预后基因表达,以及形态对此类白血病的提示作用。方法瑞士吉姆萨染色法观察骨髓细胞形态,流式细胞术检测白血病细胞免疫表型,PCR检测白血病43种融合基因,G显带法观察染色体核型,一代测序毛细管电泳法方法检测髓系预后基因。结果伴AML1-ETO阳性的患者6例(37.5%)以原始粒细胞增多为主,8例(50%)以核浆发育不平衡的异常中幼粒细胞增多为主,2例(12.5%)以原始、幼稚单核细胞增生为主;伴CBFβ-MYH11阳性6例(85%)以原始、幼稚单核细胞、原始粒细胞及异常嗜酸性粒细胞增生为主,1例以原始、幼稚单核细胞增生,未见异常嗜酸性粒细胞增多。结论AML1-ETO和CBFβ-MYH11阳性形态发现率分别为87.5%和86%,提示分子生物学检查在急性髓系白血病诊断中具有不可替代的作用。     

AML1-ETO inhibits maturation of multiple lymphohematopoietic lineages and induces myeloblast transformation in synergy with ICSBP deficiency

The translocation (8;21), generating the AML1-ETO fusion protein, is one of the most frequent chromosomal abnormalities associated with acute myelogenous leukemia (AML). To elucidate its role in oncogenesis, bone marrow (BM) cells were infected with a retroviral vector carrying AML1-ETO and transplanted into mice. In contrast to previous transgenic mouse models, we show that AML1-ETO directly stimulates granulopoiesis, suppresses erythropoiesis, and impairs the maturation of myeloid, B, and T lymphoid cells in vivo. To determine the significance of earlier findings that expression of the tumor suppressor ICSBP is often downregulated in AML myeloblasts, AML1-ETO was introduced into BM cells derived from mice lacking the interferon regulatory factor ICSBP. Our findings demonstrate that AML1-ETO synergizes with an ICSBP deficiency to induce myeloblastic transformation in the BM, reminiscent of AML.     

RNA干扰对急性髓系白血病AML1-ETO融合基因表达的抑制作用

目的 应用RNA干扰技术抑制Kasumi-1细胞AML1-ETO融合基因的表达,研究随后出现的细胞增殖和细胞周期变化.方法 体外化学合成针对AML1-ETO融合基因的小干扰RNA(siRNA),并用电穿孔方法将AML1-ETO siRNA转染Kasumi-1细胞,以非特异性的siRNA转染细胞作阴性对照;电转带有增强型绿色荧光蛋白(EGFP)的载体,流式细胞术检测其绿色荧光以确定电转效率;荧光染料实时定量PCR及Western blot检测AML1-ETO siRNA的抑制效应;并应用CCK-8实验法检测细胞增殖率;采用碘化丙锭(PI)法测定细胞周期DNA含量.结果 电转增强EGFP的转染效率可达44.5%;电转AML1-ETO siRNA可以有效抑制AML1-ETO融合基因在mRNA和蛋白水平的表达;电转AML1-ETO siRNA 72 h后细胞增殖率[(47.90±0.02)%]低于对照组[(66.90±0.08)%](P<0.05);PI染色显示AML1-ETO siRNA转染细胞72 h后,G1期细胞比例为38.3%,对照组为31.6%,而处于G2/M期细胞分别为1.8%和2.4%.结论 化学合成的特异性siRNA能抑制AML1-ETO融合基因的表达,siRNA介导的AML1-ETo融合蛋白表达减少阻滞Kasnmi-1细胞在G1期,进而抑制细胞增殖.     

AML1-ETO 真核表达载体的构建及对 U937细胞增殖和分化的影响

目的 构建pcDNA3.1-AML1-ETO真核表达载体,并观察AML1-ETO融合蛋白在U937细胞内的表达并检测其对细胞增殖与分化的影响.方法 以原核表达载体pCMV5-AML1-ETO为模板扩增AML1-ETO目的 片段,将该基因重组于pcDNA3.1/V5-His-TOPO真核表达载体上,用脂质体转染技术将其导入 U937细胞,经G418筛选获得稳定转染的克隆,PCR检测AML1-ETO基因的整合,RT-PCR及 Western blot检测AML1-ETO mRNA和蛋白的表达,用锥虫蓝拒染人工计数法观察细胞增殖活性,流式细胞术检测髓系分化抗原表达的变化,瑞特染色法观察细胞形态改变.结果 pcDNA3.1-AML1-ETO经酶切鉴定及DNA测序证实序列完全正确,筛选出AML1-ETO基因高表达的亚克隆,证实AML1-ETO基因稳定转染到U937细胞中并得到表达;转染细胞增殖受抑(P<0.05),髓系分化抗原CD11b表达阳性率[(4.17±0.31)%]低于转染空载体和未转染对照组[(11.40±0.17)%、(11.03±0.15)%](P<0.001),形态呈低分化表现.转染细胞经TPA处理后,CD11b表达无明显变化(P>0.05).结论 成功构建pcDNA3.1-AML1-ETO表达载体,并在真核细胞中得到了正确表达,AML1-ETO 基因能抑制U937细胞的增殖与分化,为进一步研究该基因致白血病的机制奠定了基础.

Abstract：

Objective To construct a pcDNA3. 1 -AML1-ETO expression vector and investigate its effects on proliferation and differentiation of U937 leukemic cells. Methods AML1 -ETO gene was amplified by PCR from pCMV5-AML1-ETO and inserted into eukaryotic expression plasmid pcDNA3. 1/V5-His-TOPO. The recombinant plasmid was transfected into U937 cells by Lipofectamin 2000. Individual clones selected with G418 were isolated. The integration and the expression levels of AML1-ETO in transfectants were determined by PCR, RT-PCR and Western blot analysis respectively. Trypan blue refusal staining method was used to detect the proliferation of U937 cells. Light microscope was applied to observe the morphologic changes of the cell. The expression of myeloid cell differentiation antigen was detected using flow cytometry. Results The recombinant pcDNA3. 1-AML1-ETO was confirmed by enzyme digestion and sequencing. The highly expressing AML1-ETO subclone was established. AML1-ETO was expressed in U937 cells transfected with pcDNA3.1 -AML1-ETO. The growth of the monoclonal cells was inhibited evidently (P < 0. 05). The expression of CD11b in transfected group [(4. 17±0. 31)%] was lower than that in empty plasmid transfected group and non-transfected group [(11.40 ± 0. 17)% and (11.03 ± 0. 15) %] respectively (P < 0.001). Transfected cells displayed morphology of less differentiation. The expression level of CD11b was unchanged in transfected cells treated with TPA (P > 0. 05). Conclusion The eukaryotic expression vector for AML1ETO gene was successfully constructed and expressed in U937. AML1-ETO inhibits the proliferation and differentiation of transfected cells. It provides the basis for further study of mechanisms of AML1 -ETO in leukemogenesis.     

组蛋白去乙酰化酶抑制剂与AML1-ETO阳性急性髓细胞白血病的研究进展

第8号与第21号染色体发生易位,t(8;21) (q22;q22)可使位于第21号染色体的急性髓细胞白血病(AML)1基因与位于第8号染色体的ETO基因融合,形成AML1-ETO融合基因.AML1-ETO能够募集mSin3/N-CoR/ SMART/HDAC共抑制复合物至AML1靶基因的启动子区,使白细胞介素(IL)-3、粒-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)等与造血干细胞分化有关的基因及抑癌基因失活,进而导致白血病发生.组蛋白去乙酰化酶抑制剂(HDACI)通过组蛋白乙酰化、染色质重塑,可使AML1-ETO目的基因恢复表达、降解AML1-ETO融合蛋白等发挥抗白血病作用,同时选择性作用于AML1-ETO阳性细胞.目前,HDACI与DNA去甲基化药物、糖皮质激素类药物、热休克蛋白(HSP)-90抑制剂及三氧化二砷(ATO)联合应用治疗AML1-ETO阳性AML还在探索阶段.笔者拟就HDACI对AML1-ETO融合蛋白及其目的基因的作用,以及HDACI联合用药在AML1-ETO阳性AML治疗方面的作用机制进行综述.     

融合蛋白AML1-ETO对C/EBPα基因表达的影响

背景：已有研究显示AML1-ETO可以通过包括抑制C/EBPα的功能在内的机制引起分化的阻滞。目的：观察AML1-ETO对髓系分化相关基因C/EBPα表达的影响,探讨其在白血病发生中的作用。方法：应用流式细胞术检测急性单核细胞白血病细胞株U937、U937-MOCK和U937-A/E1细胞表面抗原CD11b、CD14的表达;荧光实时定量PCR检测C/EBPαmRNA的表达;免疫印迹法检测C/EBPα蛋白的表达;染色质免疫沉淀技术研究转染细胞中AML1-ETO与C/EBPα基因启动子之间直接的相互作用情况。结果与结论：AML1-ETO转染细胞的细胞表面分化抗原CD11b和CD14的表达明显下降,且转染了AML1-ETO的U937细胞系中,C/EBPα的mRNA与蛋白水平均下调,转染细胞沉淀富集的DNA中含有C/EBPα基因的启动子序列。结果提示C/EBPα是AML1-ETO的直接靶基因,AML1-ETO能下调C/EBPα的表达。     

PRAME mRNA在初诊急性髓系白血病患者中的表达及微量残留病监测中的应用

目的 了解黑色素瘤优先表达的抗原(PRAME)mRNA在初诊急性髓系白血病(AML)患者中的表达,评估其在微量残留病(MRD)监测中的作用.方法 采用基于TaqMan探针的实时定量RT-PCR技术检测142例初诊AML患者(其中72例不具有特异融合基因)骨髓单个核细胞PRAMEmRNA水平,动态观察3例持续缓解及6例血液学复发患者(2例不具有特异融合基因)治疗前后共60份骨髓标本PRAME mRNA水平,以22份异基因骨髓移植供者的骨髓标本作为健康对照.随访的7例AML1-ETO(+)M2患者同时检测AML1-ETO mRNA水平.以abl作为内参基因.结果 健康对照骨髓标本均表达PRAME mRNA,表达水平最高为0.28%.全部初诊AML患者骨髓中位PRAME mRNA水平为3.97%(0.00%～714.97%).无特异融合基因的AML患者骨髓中位PRAME mRNA水平为0.60%(0.00%～408.72%).PRAME mRNA水平在AML各亚型之间差异有统计学意义(P＜0.01),AML1-ETO(+)M2患者PRAME mRNA水平高于其他亚型(P值均＜0.01),S型PML-RARa(+)急性早幼粒细胞白血病患者次之.随访的AML1-ETO(+)M2患者PRAME mRNA与AML1-ETO mRNA呈现同样的变化趋势,二者呈明显正相关(r=0.88,P＜0.01).血液学复发患者中3例复发前PRAMEmRNA水平逐步升高,分别在复发前1～4个月超过正常上限,另3例患者在血液学缓解状态时PRAME mRNA水平始终未降至正常.结论 PRAME mRNA可以用于监测AML患者MRD,其水平持续升高或始终异常预示血液学复发.     

急性髓细胞白血病M_（2b）型AML_1－ETO融合基因转录本的检测

急性髓细胞白血病（ＡＭＬ）－Ｍ＿（２ｂ）患者约９０％有ｔ（８；２１）。已经证明它导致ＡＭＬ＿１－ＥＴＯ融合基因。我们应用逆转录酶／聚合酶链反应（ＲＴ／ＰＣＲ）检测了２２例ＡＭＬ＿１－Ｍ＿（２ｂ）其中ｔ（８；２１）阳性１６例，阴性２例，不能确定有无ｔ（８；２１）的４例，发现全部２２例患者均可检出ＡＭＬ＿１－ＥＴＯ融合基因转录本。同时在５例ｔ（８；２１）阴性的ＡＭＬ中，包括Ｍ＿（２ａ）２例，Ｍ＿４２例，Ｍ＿３１例，均未检出上述融合基因转录本。我们的初步结果提示ＡＭＬ＿１－ＥＴＯ融合基因可以作为ＡＭＬ－Ｍ＿（２ｂ）的基因标志。     

拓扑异构酶Ⅱ抑制剂足叶乙甙和阿霉素诱导AML1基因重排、融合

目的：探讨拓扑异构酶Ⅱ抑制剂与染色体t(8；21)形成之间的关系。方法：K562细胞经不同浓度足叶乙甙(Vp16)和阿霉素(DOX)作用不同时间后用Southern杂交检测AML1、ETO基因重排，用筑巢式RT-PCR联合序列分析检测AML1-ETO融合基因。结果：10，50，100μmol／L DOX作用16h AML1基因重排阳性，50μmol／L DOX作用48h AML1-ETO融合基因阳性。结论拓扑异构酶Ⅱ抑制剂诱导AML1基因重排、融合是染色体t(8；21)形成机制之一。