AML1-ETO融合蛋白致细胞转化的分子机制

急性髓系白血病(AML)-M2b通过其特征性染色体易位t(8;21)而致AML1-ETO融合蛋白,该融合蛋白主要通过抑制AML1靶基因的活化致细胞转化,它除竞争性地抑制AML1靶基因的活化外,还通过募集核共抑制复合物主动地抑制AML1靶基因的基础转录。此外,它还通过蛋白-蛋白相互作用影响非AML-1靶基因的功能,干扰细胞正常的增殖与分化而致细胞转化。AML-1-ETO融合蛋白的转化潜力是有限的,白血病的发病除了它外尚需其它基因突变事件的参与。     

AML1-ETO阳性急性髓系白血病患者c-kit突变及其临床意义

本研究探讨AML1-ETO融合基因阳性急性髓系白血病(acute myeloid leukemia,AML)患者c-kit突变的发生情况及其临床意义。采用PCR和直接测序法检测31例AML1-ETO阳性AML患者c-kit基因17外显子突变的发生情况,并分析c-kit基因突变与患者的临床、实验室特征以及疗效的关系。结果表明:31例患者中14例检测到c-kit突变,突变率为45.16%,突变组男性患者的比例为71.43%、初诊时白细胞计数>10×109/L患者的比例为78.57%和伴有髓外浸润患者的比例为21.43%,均明显高于无突变组(29.41%、41.18%、0%,P=0.020,0.036,0.045),两组患者的年龄和骨髓原始细胞比例无明显差异(P=0.437和0.510)。c-kit突变和无突变组化疗完全缓解(CR)率(64.29%∶80%)和复发率(58.33%∶21.43%)的差异无统计学意义(P=0.344和0.054),而死亡率(57.14%)在c-kit突变组明显高于无突变组(20%,P=0.039)。结论:AML1-ETO阳性AML患者c-kit突变常见,突变患者预后差,常规检测c-kit突变对患者的危险度分层、预后评估和选择有效治疗方案有重要意义。     

AML1-ETO融合蛋白的研究进展

急性髓系白血病中AML1-ETO融合蛋白被认为是一种预后良好的细胞和分子遗传学异常,但若伴有其他分子学异常,如KIT、FLT3、AML1-ETO9a剪接变体等更易致白血病生成,且影响预后.AML1-ETO能抑制GATA-1乙酰化,从而抑制红系分化、AML1-ETO对其靶基因的影响以及冬凌草、格列卫靶向治疗已成为目前研究的热点.     

AML1、AML1-ETO对nucb2基因转录调控活性的影响

本研究旨在探讨造血特异转录因子AML1及M2b型急性髓系白血病（AML-M2b）累及的异常融合蛋白AML1-ETO对凋亡相关基因nucb2（nucleobindin-2）启动子转录活性的影响,探索AML1-ETO对AML—M2h型白血病的分子致病机制。利用实时RT-PCR方法在AML1-ETO诱导型白血病细胞株中研究AML1-ETO在转录水平对于nucb2的调控情况;利用ChIP—qPCR方法在AML1-ETO阳性白血病细胞株中研究AML1、AML1-ETO与nucb2基因启动子之间直接的体内相互作用情况;采用双荧光素酶报告基因检测方法,研究AML1、AML1-ETO对nucb2启动子转录活性的调节作用。结果表明：AML1-ETO的表达与nucb2的表达呈负相关;nucb2可能是AML1、AML1-ETO的靶基因;AML1、AMLI—ETO皆对nucb2启动子具有转录抑制作用,且AML1-ETO对nucb2抑制更强。结论：nucb2是AML1、AML1-ETO的直接靶基因,AML1、AML1-ETO通过抑制nucb2启动子的活性对其进行转录调控。     

AML1-ETO融合蛋白对BCL-2基因表达的影响

本研究旨在观察AML1-ETO在白血病细胞中对于抗凋亡基因日乳-2表达的影响,探讨其在白血病发生中的作用。应用流式细胞术检测急性单核细胞白血病细胞株U937-WT、U937-Mock和经AML1-ETO基因转染的U937-A／E1-4的细胞凋亡率;使用免疫印迹法检测cleavedcaspase-3蛋白的表达;荧光实时定量PCR检测转染细胞和对照组细胞以及AMLM2患者白血病细胞BCL-2mRNA的表达;染色质免疫沉淀技术研究转染细胞中AML1-ETO与BCL-2基因启动子之间直接的相互作用情况。结果表明：AML1-ETO转染细胞的凋亡率明显增加,且检测到cleavedcaspase-3蛋白的表达;转染了AML1—ETO 的U937细胞系和具有AML1—ETO融合基因的AML-M2患者中,BCL-2的mRNA表达水平显著下调;转染细胞沉淀富集的AML1-ETO直接结合的DNA中含有BCL-2基因的启动子序列。结论：BCL-2是AML-ETO的直接靶基因,AML1-ETO能下调BCL-2的表达。     

AML1-ETO对p21 WAF1/CIP1启动子转录活性作用的研究

目的观察AML1-ETO融合基因对p21WAF1／CIP1基因启动子转录活性的影响，探讨AML1-ETO促进白血病发生的机制。方法构建p21WAF1／CIP1基因启动子的报告质粒，与AML1-ETO、AML1b和AML1a的表达质粒共转染非洲绿猴肾细胞系CV—1细胞，测定荧光素酶的活性，分析AML1-ETO、AML1b和AML1a对p21WAF1／CIP1基因启动子转录活性的影响。结果在CV—1细胞中，AML1-ETO对p21WAF1／CIP1基因启动子的转录具有明显的抑制作用，在pCMV5-AML1-ETO的剂量为1000ng时，p21WAF1／CIP1启动子的转录活性下降为对照组的（19±4）％，这种作用具有序列特异性和剂量依赖性；AML1b和AML1a对p21WAF1／CIP1基因启动子转录活性的抑制作用不明显，在剂量为1000ng时，p21WAF1／CIP1启动子的转录活性分别下降为对照组的（61±16）％和（594-16）％。结论AML1在与ETO形成融合基因后，其产物由于ETO蛋白能够更有效地募集转录共抑制复合物，其转录抑制活性要比AML1a和AML1b更强；外源的AML1-ETO对p21WAF1／CIP1的作用可能也与细胞系有关。     

AML1-ETO9a异构体及AML1-ETO融合基因在(t8;21)急性髓系白血病中的致病机制及临床意义研究进展

t(8;21)染色体易位是急性髓系白血病(AML)中常见的核型异常之一,易位形成的AML1-ETO融合基因及表达生成的蛋白在AML的发病中起着重要作用。AML1-ETO主要通过多种途径影响造血干细胞正常分化,在协同打击共同作用下导致白血病的发生。AML1-ETO9a(简称AE9a)是AML1-ETO的异构体之一,单独表达时即可导致白血病,与AML1-ETO共表达时致白血病能力更强。研究AE9a致白血病机制有助于进一步理解t(8;21)相关AML的发病机制,进而提供新的治疗思路和方法。本文就AE9a异构体与AML1-ETO基因在t(8;21)相关AML的致病机制及其临床意义作一综述。     

AML1-ETO融合基因在儿童急性髓系白血病中的预后评估价值

目的 评估AML1 ETO融合基因对儿童急性髓系白血病的预后作用.方法 对AML1 ETO阳性或阴性的103例急性粒细胞白血病（AML）患儿的临床资料进行回顾性分析,采用Kaplan-Meier曲线评估患儿无病生存（DFS）率和总生存（OS）率,COX回归模型评估儿童急性髓系白血病中的预后因素.结果 ①103例AML患儿均进行了双诱导方案化疗.53例AML1 ETO阳性患儿第1疗程和第2疗程的完全缓解率分别为70％和92％,远期复发9例（17％）,53例患儿的5年DFS率和OS率分别为（63.6±7.3）％和（74.5±8.9）％.50例AML1 ETO阴性患儿第1疗程和第2疗程的完全缓解率分别为72％和94％,远期复发17例（34％）,患儿的5年DFS率和OS率分别为（52.2±6.1）％和（60.7±7.3）％.AML1 ETO阳性患儿远期复发率显著低于AML1 ETO阴性患儿（P＜0.05）,5年DFS率和OS率均显著高于AML1ETO阴性患儿（P＜0.05）;②单因素分析显示AML1 ETO阳性患儿中,年龄是影响预后的独立危险因素,年龄越大出现事故或死亡的风险性越大（P＜0.05）.结论 相比较于AML1 ETO阴性的AML患儿,AML1 ETO阳性的AML患儿经治疗后,其疾病的远期复发率低,长期疗效好,并且年龄是影响其远期治疗效果的重要因素.     

RNA干扰对急性髓系白血病AML1-ETO融合基因表达的抑制作用

目的 应用RNA干扰技术抑制Kasumi-1细胞AML1-ETO融合基因的表达,研究随后出现的细胞增殖和细胞周期变化.方法 体外化学合成针对AML1-ETO融合基因的小干扰RNA(siRNA),并用电穿孔方法将AML1-ETO siRNA转染Kasumi-1细胞,以非特异性的siRNA转染细胞作阴性对照;电转带有增强型绿色荧光蛋白(EGFP)的载体,流式细胞术检测其绿色荧光以确定电转效率;荧光染料实时定量PCR及Western blot检测AML1-ETO siRNA的抑制效应;并应用CCK-8实验法检测细胞增殖率;采用碘化丙锭(PI)法测定细胞周期DNA含量.结果 电转增强EGFP的转染效率可达44.5%;电转AML1-ETO siRNA可以有效抑制AML1-ETO融合基因在mRNA和蛋白水平的表达;电转AML1-ETO siRNA 72 h后细胞增殖率[(47.90±0.02)%]低于对照组[(66.90±0.08)%](P<0.05);PI染色显示AML1-ETO siRNA转染细胞72 h后,G1期细胞比例为38.3%,对照组为31.6%,而处于G2/M期细胞分别为1.8%和2.4%.结论 化学合成的特异性siRNA能抑制AML1-ETO融合基因的表达,siRNA介导的AML1-ETo融合蛋白表达减少阻滞Kasnmi-1细胞在G1期,进而抑制细胞增殖.     

AML1-ETO融合基因和白血病

许多急性髓系白血病(AML)是由于造血祖细胞染色体平衡易位而形成具有增殖优势的白血病细胞克隆,AML中最常见的t(8;21)(q222;q22)易位所涉及的野生型AML1、ETO基因对维持正常造血至关重要,而易位所产生的AML1-ETO融合基因则干扰正常造血细胞增殖与分化,并诱导白血病发生,同时也为诊断及治疗含有该融合基因的白血病提供了靶点.     

白血病AML1-ETO融合蛋白转录结合位点在基因组水平的分布规律

本研究探讨白血病t(8;21)染色体易位形成的融合癌蛋白AML1-ETO在2、9、19号3条染色体上基因组水平的结合位点分布,从而探索其在白血病发生发展过程中异常的转录调控模式,为靶向治疗药物研发以及临床治疗方案优化提供理论基础。应用染色质免疫沉淀技术与高通量的基因芯片相结合的ChIP-on-chip技术,使用覆盖上述3条染色体上所有基因组信息的瓦式基因芯片,在具有t(8;21)染色体易位的Kasumi细胞株上展开研究。实验分为抗ETO特异抗体组和随机打断基因组DNA对照组。通过MAT方法分析ETO抗体组相对于对照组的富集片段;应用CEAS分析工具分析富集片段在基因组上的分布特征,并进一步通过功能富集分析方法挖掘其中潜藏的生物学意义。结果表明:ETO抗体组在2、9、19号染色体上共得到富集片段588条,这些片段在基因组的定位分布特征如下:5.96%位于基因启动子区域,5.49%位于基因外显子区域,48.86%位于增强子区域,37.35%位于基因内含子区域,1.27%位于即时下游区域,0.87%位于3'UTR,0.2%位于5'UTR。进一步功能富集分析结果显示:参与代谢调节、细胞增殖、信号传导等功能的模块在AML1-ETO的潜在靶基因中富集。结论:AML1-ETO融合蛋白在基因组上的结合位点过半分布在经典转录因子结合区域(启动子、5'UTR和增强子),其余近半分布在非经典的区域,其下游调控的分子网络广泛涉及多种重要功能通路。     

丙戊酸钠逆转Kasumi-1白血病细胞株AML1-ETO融合蛋白转录抑制的作用

本研究探讨组蛋白脱乙酰化酶抑制剂（HDAC）丙戊酸钠（VPA）逆转Kasumi-1白血病细胞株AML1-ETO融合蛋白转录抑制机制的作用。Kasumi-1细胞经不同浓度VPA处理不同时间,采用半定量RT—PCR分析AML1-ETO、AML1及cyclinD2mRNA水平的变化情况。结果表明：不同浓度VPA处理Kasumi-1不同时间,AML1-ETOmRNA水平无明显变化;1—3mmol／LVPA处理Kasumi-1细胞3天时,与对照组比较,AML1mRNA表达水平增高,呈现剂量依赖性,差别具有统计学意义。以3mmol／LVPA处理Kasumi-1细胞,与对照组比较,3mmol／LVPA组cyclinD2mRNA表达水平降低;以不同浓度VPA处理Kasumi-1细胞3天,结果发现随着VPA药物浓度加大cyclinD2mRNA表达水平降低,呈现剂量依赖性,差别具有统计学意义。结论：VPA能通过抑制HDAC的活性,消除AMLl／ETO融合蛋白的转录抑制并增加aml-1基因转录,下调aml-1靶基因cyclin D2 mRNA的表达。     

AML1-ETO 真核表达载体的构建及对 U937细胞增殖和分化的影响

目的 构建pcDNA3.1-AML1-ETO真核表达载体,并观察AML1-ETO融合蛋白在U937细胞内的表达并检测其对细胞增殖与分化的影响.方法 以原核表达载体pCMV5-AML1-ETO为模板扩增AML1-ETO目的 片段,将该基因重组于pcDNA3.1/V5-His-TOPO真核表达载体上,用脂质体转染技术将其导入 U937细胞,经G418筛选获得稳定转染的克隆,PCR检测AML1-ETO基因的整合,RT-PCR及 Western blot检测AML1-ETO mRNA和蛋白的表达,用锥虫蓝拒染人工计数法观察细胞增殖活性,流式细胞术检测髓系分化抗原表达的变化,瑞特染色法观察细胞形态改变.结果 pcDNA3.1-AML1-ETO经酶切鉴定及DNA测序证实序列完全正确,筛选出AML1-ETO基因高表达的亚克隆,证实AML1-ETO基因稳定转染到U937细胞中并得到表达;转染细胞增殖受抑(P<0.05),髓系分化抗原CD11b表达阳性率[(4.17±0.31)%]低于转染空载体和未转染对照组[(11.40±0.17)%、(11.03±0.15)%](P<0.001),形态呈低分化表现.转染细胞经TPA处理后,CD11b表达无明显变化(P>0.05).结论 成功构建pcDNA3.1-AML1-ETO表达载体,并在真核细胞中得到了正确表达,AML1-ETO 基因能抑制U937细胞的增殖与分化,为进一步研究该基因致白血病的机制奠定了基础.

Abstract：

Objective To construct a pcDNA3. 1 -AML1-ETO expression vector and investigate its effects on proliferation and differentiation of U937 leukemic cells. Methods AML1 -ETO gene was amplified by PCR from pCMV5-AML1-ETO and inserted into eukaryotic expression plasmid pcDNA3. 1/V5-His-TOPO. The recombinant plasmid was transfected into U937 cells by Lipofectamin 2000. Individual clones selected with G418 were isolated. The integration and the expression levels of AML1-ETO in transfectants were determined by PCR, RT-PCR and Western blot analysis respectively. Trypan blue refusal staining method was used to detect the proliferation of U937 cells. Light microscope was applied to observe the morphologic changes of the cell. The expression of myeloid cell differentiation antigen was detected using flow cytometry. Results The recombinant pcDNA3. 1-AML1-ETO was confirmed by enzyme digestion and sequencing. The highly expressing AML1-ETO subclone was established. AML1-ETO was expressed in U937 cells transfected with pcDNA3.1 -AML1-ETO. The growth of the monoclonal cells was inhibited evidently (P < 0. 05). The expression of CD11b in transfected group [(4. 17±0. 31)%] was lower than that in empty plasmid transfected group and non-transfected group [(11.40 ± 0. 17)% and (11.03 ± 0. 15) %] respectively (P < 0.001). Transfected cells displayed morphology of less differentiation. The expression level of CD11b was unchanged in transfected cells treated with TPA (P > 0. 05). Conclusion The eukaryotic expression vector for AML1ETO gene was successfully constructed and expressed in U937. AML1-ETO inhibits the proliferation and differentiation of transfected cells. It provides the basis for further study of mechanisms of AML1 -ETO in leukemogenesis.     

AML1-ETO9a异构体在伴t(8；21)M2型急性髓系白血病中表达比例的监测及其意义

目的 研究AML1-ETO9a (AE9a)异构体在伴有t(8;21)的M2型急性髓系白血病( AML-M2)患者中表达比例的变化及其临床意义.方法 应用RT-PCR方法筛选了44例初诊AE9a与AML1-ETO(AE)融合基因共表达的伴有t(8;21)的AML-M2患者.应用实时定量PCR技术监测这44例多次随访标本中AE9a在AE9a与AE两者总和中百分比的变化.结果 伴有t(8;21)的44例初诊AML-M2患者中AE表达量高于AE9a(中位CT值分别为20.48和21.54),两者表达量呈正相关(r =0.900);44例初诊患者经首次标准方案化疗后AE与AE9a表达量均下降,但初治后AE9a在总体中百分比较初诊时上升(P＜0.05);患者经1个疗程标准方案化疗后,未达完全缓解(CR)组的AE9a百分比明显高于CR组(中位值分别为36.81％和7.93％,P＜0.05);复发患者缓解期间AE9a百分比高于未复发患者(中位值分别为22.89％和2.43％,P＜0.05);缓解期间,17例复发患者中11例AE9a百分比在AE表达低水平时即出现升高甚至异常升高.结论 AE9a与AE共表达于伴有t(8;21)的AML-M2患者中,并且AE表达量高于AE9a,两者呈正相关.AE9a异构体对标准化疗的敏感性较AE差.在缓解期监测AE9a在AE及AE9a两者总体中百分比的变化比单独监测AE融合基因能更早地预示疾病复发趋势,从而可提前进行临床干预,降低患者的复发率,提高患者的长期生存率.     

儿童B系急性淋巴细胞白血病TEL-AML1融合基因的研究

目的了解ＴＥＬＡＭＬ１融合基因在儿童Ｂ系急性淋巴细胞白血病（急淋）中的发生率及其与临床诊断和预后的关系,并比较巢式逆转录聚合酶链反应（ＲＴＰＣＲ）和双标记荧光原位杂交（ＦＩＳＨ）两种方法。方法采用巢式ＲＴＰＣＲ和双标记ＦＩＳＨ技术检测ＴＥＬＡＭＬ１融合基因。结果和结论ＲＴＰＣＲ检测发现儿童Ｂ系急淋中２２．５％（４０例中９例）的患者有ＴＥＬＡＭＬ１融合基因转录本,这类患者预后较好,完全缓解率达１００％。ＲＴＰＣＲ和ＦＩＳＨ技术是检测ＴＥＬＡＭＬ１的有效方法,并为临床诊断和预后估计提供了有一定价值的手段。