小细胞肺癌细胞系H446中肿瘤干细胞的分选与鉴定

 目的 明确能否以表面黏附分子CD133为干细胞标志物,使用免疫磁珠分选（magnetic cell separation,MACS）法分离小细胞肺癌细胞系H446细胞中的肿瘤干细胞。方法 以CD133为特异性分子标志物,使用MACS方法分选H446细胞,比较CD133阳性（CD133+）细胞与CD133阴性（CD133-）细胞在集落形成、自我更新、增殖分化、侵袭性、耐药性和成瘤性方面的不同。结果 CD133+细胞和CD133-细胞在集落形成能力、自我更新能力、增殖能力、分化能力、侵袭能力和耐药性方面基本相同。集落形成和成瘤性实验结果显示：CD133+或CD133-细胞中40%以上的细胞都能够形成含有100个细胞以上的大集落,增殖成为与未分选细胞相同的细胞群,并能在裸鼠身上成瘤。结论 表面黏附分子CD133不能作为分选小细胞肺癌H446细胞系中肿瘤干细胞的分子标志物,分选后的CD133+与CD133-细胞中含有相同的肿瘤干细胞。     

LY294002抑制小细胞肺癌干细胞样细胞自我更新

目的:研究Akt活性抑制剂LY294002抑制源自人小细胞肺癌NCI-H446细胞系肺癌球形成细胞即肺癌干细胞样细胞(LCSLCs)自我更新作用。方法:体外培养NCI-H446细胞系细胞。以干细胞条件培养基用超低粘附6孔细胞培养板悬浮培养富集和扩增LCSLCs。裸鼠皮下成瘤实验鉴别LCSLCs高致瘤特性。Western blot分析LCSLCs中Akt蛋白磷酸化水平。肿瘤球形成试验检测LY294002对LCSLCs自我更新的影响。结果:干细胞条件培养基悬浮培养6d,NCI-H446细胞系细胞呈三维非粘附性球体生长。LCSLCs具有高致瘤特性。与NCI-H446细胞系细胞比较,LCSLCs信号分子Akt组成性活化。LY294002有效降低LCSLCs中Akt磷酸化水平,并以剂量依赖方式抑制LCSLCs肺癌球形成(P<0.05)。结论:靶向干预小细胞肺癌LCSLCs信号分子Akt组成性活化可能成为抑制肺癌干细胞特性治疗小细胞肺癌的新策略。     

紫杉醇联合5-Aza-dC对非小细胞肺癌细胞NCI-H446生长抑制作用的研究

目的探讨紫杉醇（PAC）联合DNA甲基化酶抑制剂5-氮杂-2＇-脱氧胞苷（5-Aza-d C）对非小细胞肺癌细胞NCI-H446增殖迁徙及侵袭能力的影响。方法将人小细胞肺癌细胞NCI-H446给予紫杉醇及5-Aza-d C干预处理,根据药物干预方式的不同分为对照组、紫杉醇组及联合用药组;应用CCK-8法检测各组NCI-H446细胞增殖能力的差异;划痕实验和Transwell实验检测各组NCI-H446细胞迁移和侵袭能力的差异。结果 CCK-8结果显示PAC及5-Aza-d C均可抑制NCI-H446细胞的增殖活性,且呈时间依赖性。48 h后紫杉醇组及联合用药组NCI-H446细胞的增殖能力较对照组明显减弱（P〈0.01）;划痕实验结果显示划痕形成24 h后,对照组划痕愈合率为（69.15±0.837）%。而在紫杉醇组划痕处愈合率为（47.30±0.783）%;联合用药组划痕愈合率为（43.45±0.862）%。紫杉醇组及联合用药组NCI-H446细胞在迁移能力方面较对照组差异有统计学意义（P〈0.01）;Transwell实验结果显示对照组NCI-H446细胞转染穿过基质胶的细胞数量为（151.4±6.88）个,紫杉醇组为（66.8±5.17）个,联合用药组为（40.2±4.55）个。紫杉醇组及联合用药组NCI-H446细胞的侵袭能力较对照组差异有统计学意义（P〈0.01）。结论 5-Aza-d C作为化疗增敏剂可增加非小细胞肺癌细胞NCI-H446对紫杉醇的敏感性,从而提高紫杉醇对非小细胞肺癌的化疗效果。     

浅谈小细胞肺癌细胞系H446中肿瘤干细胞的分选与鉴定

目的:通过实验验证表面黏附分子CD133是否可以作为干细胞标志物。并通过这个试验过程浅谈小细胞肺癌细胞系H446中肿瘤干细胞的分选与鉴定。方法:在分选H446细胞(MACS方法)过程中得到CD133阳性(CD133+)细胞与CD133阴性(CD133-)细胞。对这两种细胞进行集落形成、自我更新、增殖分化、侵袭性、耐药性和成瘤性方面等项目的鉴定。结果:各种办法鉴定,发现两种细胞不存在差异。结论:分选小细胞肺癌H446细胞系中肿瘤干细胞方法中不能以表面黏附分子CD133为的标志物。     

DADS对人小细胞肺癌细胞株NCI-H446增殖的影响

目的 探讨二烯丙基二硫(diallyl disulfide, DADS)体外抑制人肺癌细胞株NCI-H446细胞增殖作用.方法 采用MTT、细胞计数、细胞活力检测DADS对体外培养的人肺癌H446细胞的抑制增殖作用;倒置显微镜观察DADS对体外培养的人肺癌H446细胞的形态学改变.结果 MTT结果显示,DADS作用H446细胞后,明显抑制细胞增殖且抑制率呈现浓度时间依赖性关系;细胞计数结果表明,DADS作用H446细胞后其细胞群体倍增时间延长;形态学变化观察,随着DADS浓度递增,细胞逐渐稀疏,数量明显减少.结论 DADS对人小细胞肺癌H446细胞株具有抗增殖作用,且与药物浓度及作用时间相关.     

人肺癌H1299肿瘤干细胞样细胞的分离培养及鉴定

目的 从人肺癌H1299细胞系中分离培养肺癌干细胞样细胞,并进一步鉴定其干细胞特性.方法 在低黏附条件下无血清诱导培养H1299细胞,富集H1299肿瘤细胞球,利用免疫荧光、流式细胞仪、PCR及Western blot检测干性标志物CD133和ABCG2的表达,并观察克隆形成和体内致瘤能力的改变.结果 肺癌H1299细胞经无血清诱导培养可形成悬浮的细胞球.与普通贴壁H1299细胞相比,细胞球具有更强的增殖能力和致瘤性,且高表达干性基因CD133和ABCG2,差异有统计学意义(P＜0.0S).结论 运用无血清悬浮细胞球培养方法富集的肺癌H1299细胞系肿瘤球高表达CD133和ABCG2,具有干细胞特性.     

MnSOD沉默对NCI-H446细胞系球细胞体外致瘤性的影响

目的：研究锰超氧化物歧化酶(manganese superoxide dismutase,MnSOD)沉默对人小细胞肺癌NCI-H446细胞 系球细胞体外致瘤性的影响及其潜在的机制。方法：采用悬浮培养法得到人小细胞肺癌NCI-H446细胞系球细胞,用 Western印迹分析MnSOD和尿激酶型纤溶原酶激活物(urokinase type plasminogen activator,uPAR)表达。利用腺病毒感染 技术沉默NCI-H446细胞MnSOD,球形成法和软琼脂集落形成法评价MnSOD沉默对NCI-H446球细胞体外致瘤性的影 响,用Western印迹检测uPAR的表达。结果：与NCI-H446细胞比较,NCI-H446细胞第2代球细胞的球形成率和集落形 成率及MnSOD和uPAR表达明显增加(P<0.05)。表达shMnSOD的腺病毒抑制NCI-H446细胞第2代球细胞球形成率、集 落形成率及uPAR的表达。结论：MnSOD可能通过调控uPAR表达维持小细胞肺癌NCI-H446细胞系球细胞的体外高致 瘤性。     

芹菜素对NCI-H446细胞系球细胞自我更新和uPAR表达的影响

目的：研究芹菜素对人小细胞肺癌NCI-H446细胞系球细胞自我更新的影响及机制。方法：采用干细胞条件培养基超低黏附板悬浮培养法从体外培养NCI-H446细胞系得到球细胞。测定球形成率用以评价0(0.1% DMSO对照组),5.0,10.0,20.0 μmol/L芹菜素对NCI-H446细胞系球细胞自我更新的抑制作用;Western印迹分析球细胞尿激酶型纤维蛋白酶原激活物受体(urokinase-type plasminogen activator receptor,uPAR)的表达。结果：0,5.0,10.0,20.0 μmol/L 芹菜素呈剂量依赖性抑制NCI-H446细胞系第2代球细胞的球形成率[球形成率分别为(18.2±1.9)%,(13.6±1.7)%,(10.6±1.6),(6.9±1.3)%],并呈浓度依赖性下调uPAR蛋白的表达(P<0.05)。结论：芹菜素抑制人小细胞肺癌NCI-H446细胞系球细胞自我更新作用,可能与下调uPAR表达相关。     

人结肠癌细胞株CW-2干细胞生物学特性研究

 目的从人结肠癌细胞株CW-2中分离癌干细胞,并观察其生物学特性。方法采用多重联合法分离人结肠癌干细胞,
应用流式细胞仪检测分离后细胞中CD44⁺EpCAM⁺癌干细胞含量;细胞周期检测、体外侵袭实验、体内成瘤实验对癌干细胞进行
生物学特性研究。结果分离后细胞中CD44⁺EpCAM⁺癌干细胞含量为89.57%;CD44⁺EpCAM⁺癌干细胞的增殖能力、侵袭能力、
致瘤能力均强于非癌干细胞,各组间差异有统计学意义（p <0.05）。结论CD44⁺EpCAM⁺癌干细胞具有低增殖性、高侵袭性、高
致瘤性,并可通过多重联合分离获得。     

CD105/CD133筛选鉴定SMMC-7721株干细胞表面标志物的实验研究

目的：观察人肝癌细胞株 SMMC-7721中膜抗原CD133、CD105的表达情况并对不同亚群的生物学性状进行体内外实验研究。方法以含10%胎牛血清的 DMEM 对SMMC-7721株细胞培养;采用流式细胞仪方法分选检测CD133、CD105在SMMC-7721中表达情况并分选出CD133+/CD105+、CD133+/CD105-、CD133-/CD105+、CD133-/CD105-4个亚群;CCK-8和 Transwell侵袭实验分别检测4个亚群和未分选细胞组的增殖及侵袭能力,软琼脂克隆实验检测5组细胞成球能力;裸鼠成瘤实验了解 CD133+/CD105+、CD133-/CD105-亚群和未分选组的成瘤能力。结果流式细胞仪分选的 CD133+/CD105+、 CD133+/CD105-、CD133-/CD105+、CD133-/CD105-4种细胞亚群的比例分别为1．61%、0．01%、97．88%和0．50%。 CD133+亚群的增殖和成球能力较 CD133-亚群及未分选细胞组强,而CD105+亚群侵袭能力较 CD105-亚群及未分选细胞组强。CD133+/CD105+组与CD133-/CD105-组及未分选细胞组相比成瘤所需的时间短、所需细胞数少、成瘤的体积大。结论 CD133在人肝癌细胞株 SMMC-7721中的表达与其增殖成球能力有关,CD105与其侵袭能力有关,CD133+/CD105+具有体内高度的成瘤能力。 CD133+/CD105+亚群在人原发性肝癌细胞株SMMC-7721中具有肿瘤干细胞特性。     

蒿甲醚联合依托泊苷对小细胞肺癌细胞株H446增殖及侵袭的抑制作用

探讨蒿甲醚与依托泊苷联用对小细胞肺癌细胞H446增殖及侵袭能力的抑制作用。采用MTT法检测蒿甲醚、依托泊苷单用及联合作用对H446细胞增殖的影响;采用Annexin V/PI荧光双染法检测蒿甲醚、依托泊苷单用及联合作用对H446细胞凋亡的影响;采用PI单染法检测蒿甲醚、依托泊苷单用及联合作用对H446细胞周期分布的影响。采用基质胶侵袭实验检测蒿甲醚、依托泊苷单用及联合作用对H446侵袭能力的影响。结果表明,蒿甲醚、依托泊苷单用以及联合使用均能有效抑制H446的增殖,且呈剂量依赖性,两药联用具有协同作用。蒿甲醚单用不能明显促进细胞凋亡,但与依托泊苷(300 nmol/L)联用72 h可以比较明显促进H446凋亡,具有统计学意义(P<0.05)。蒿甲醚单用对H446的细胞周期没有显著影响,联合作用48 h对细胞周期G₂期阻滞主要是依托泊苷的作用。单用蒿甲醚、依托泊苷以及二者联合使用都能显著抑制H446的侵袭能力。     

TBX3在非小细胞肺癌中的表达及其对肺癌细胞增殖和侵袭能力的影响

 目的 检测TBX3在非小细胞肺癌（NSCLC）组织中的表达,观察下调TBX3对肺癌细胞增殖和侵袭能力的影响。方法 采用免疫组化方法检测93例NSCLC组织中TBX3蛋白的表达情况。应用siRNA干扰肺癌细胞系A549和H157内TBX3基因的表达,观察其对细胞增殖和侵袭能力的影响。 结果 在93例NSCLC中,71例存在TBX3蛋白过表达（76.34%）,其阳性表达与肿瘤的p-TNM分期和淋巴结转移相关。转染TBX3特异性干扰RNA后,肺癌细胞的增殖与侵袭能力均受到显著抑制。 结论 TBX3在NSCLC中呈过表达,并与肺癌分期和转移显著相关,干扰TBX3表达可明显抑制肺癌细胞的增殖与侵袭能力。     

siRNA 干扰 TRIM29基因对人肺癌 NCI-H520细胞株增生及迁移能力的影响

目的：探讨 TRIM29基因沉默对肺癌细胞株 NCI-H520增生和迁移能力的影响。方法将针对 TRIM29的 siRNA 导入NCI-H520细胞,用 real time PCR 和 Western blotting 法分析 TRIM29基因及蛋白表达情况,MTT 法和 Transwell 小室法检测其增生、迁移能力。结果 NCI-H520细胞转染48 h 后,与空白组及对照组相比,TRIM29 siRNA 转染组 TRIM29 mRNA 和蛋白表达均明显下调,细胞生长明显减慢,细胞迁移能力下降。结论 siRNA 干扰下调 TRIM29基因表达能抑制肺癌细胞 NCI-H520的增生和迁移能力。     

神经生长因子在NCI-H466细胞中的表达及其生物学意义

目的： 探讨神经生长因子（nerve growth factor,NGF）在小细胞肺癌细胞株NCI-H466中的表达及肺癌脑转移的可能机制。方法： 采用免疫荧光标记技术观察人小细胞肺癌NCI-H466细胞中NGF的亚细胞定位表达,并采用MTT试验及Transwell试验观察NGF对NCI-H466细胞增殖及侵袭能力的影响。结果： NGF在NCI H466细胞中亚细胞定位表达存在细胞周期特异性,在分裂间期,NGF主要呈颗粒状分布于细胞核内;在分裂中期,NGF分布于纺锤丝上。加入外源性NGF的NCI-H466细胞增殖明显加速,侵袭能力增强。结论： NGF可以促进NCI-H466细胞增殖和迁移,中枢神经系统内高NGF水平可能是肺癌易于发生脑转移的原因之一。NGF在肺癌细胞内具有亚细胞定位表达的特点,有可能作为一种新的治疗靶点。