联合分析HCV种属信息区和高度保守区序列确定广东地区HCV基因型和亚型

目的扩增HCV种属信息区NS5B和高度保守区5-UTR基因序列,用系统进化树法深入分析HCV基因型和亚型,阐明广东地区丙型肝炎患者HCV基因型和基因亚型的特点。方法采集99例慢性丙型肝炎病例血清,应用RT-PCR技术分别扩增HCVNS5B区和5-UTR特定片段,测序后进行系统进化树分析,确定HCV基因型及亚型。结果99例患者标本均准确分型,其中NS5B区段分型74例,5-UTR区段分型99例。HCV基因型和亚型的分布:1a亚型1例、1b亚型59例、1型7例、2a亚型11例、3a亚型3例、3b亚型2例、3型3例、6a亚型13例;另有2例标本在两区段分型不同,5-UTR/NS5B区段分型分别为6a/1b和3a/1b。两区段共同分型74例,72例标本在两区段基因型一致,2例标本在两区段基因型不同,为HCV重组体。结论联合分析HCV不同区段基因序列,可提高HCV基因分型的准确度及灵敏性。广东地区慢性丙型肝炎患者HCV基因亚型分布以1b为主;其次为6a和2a;3型中的a、b亚型也占有一定比例。     

对比分析5'-UTR和NS5b区序列确定广东地区HCV基因亚型

［摘要］ 目的 对比丙型肝炎病毒（HCV）不同区段系统进化分析法基因分型的差异,探讨广东地区丙型肝炎患者的HCV基因亚型分布。方法 RT-PCR分别扩增HCV5'-UTR（71nt-311nt）共241bp和NS5b区（8249nt-8650nt）共402bp的片段。序列分析后进行系统进化分析以确定病毒基因型及亚型。结果 HCV NS5b区段分型74例,其中1b亚型51例,2a亚型10例,6a亚型8例,3a亚型2例,3b亚型2例,1a亚型1例;5'UTR区分型74例,其中1型45例,2型11例,6a亚型10例,3a亚型3例,3b亚型5例;两区段共同分型49例,47例基因型一致,2例不同。结论 对比分析HCV不同区段基因序列,可深化对HCV基因型和亚型的了解。初步表明广东地区慢性丙型肝炎患者HCV基因亚型分布以1b为主;其次为2a、6a,两者比例相当;3b、3a也占有一定比例。 ［关键词］丙型肝炎病毒;基因型;5'-非编码区;NS5b区;系统进化分析     

反向点杂交法检测广东地区丙型肝炎病毒基因型和基因亚型

目的 建立并应用HCV基因分型技术PCR-反向点杂交法(PCR-RDH),调查广东地区丙型肝炎病毒(HCV)基因型和亚型的分布情况.方法 应用生物信息学软件针对HCV 5'端非编码区(5'UTR)和核心蛋白区(C区)设计特异性捕获探针及生物素标记引物,建立HCV基因分型的PCR-反向点杂交技术.应用本技术对115例慢性丙型肝炎患者血清标本进行HCV基因型和亚型检测,同时对其中38份标本中的HCV进行RT-PCR扩增、测序、系统进化树分析确定HCV基因型和亚型,以评价反向点杂交法的准确性及临床应用价值.结果 115份血清标本中,反向点杂交法HCV基因型及亚型检出率为96.5%(111/115),15份阴性对照全部为阴性.111例检出基因型的标本中1b型63例(56.8%)、2a型9例(8.1%)、3a型4例(3.6%)、3b型6例(5.4%)、6a型28例(25.2%)、1b/2a混合型1例(0.9%).经测序分型确定此法检测准确度为100%,特异度为100%.结论 HCV基因型反向点杂交法检测准确可靠、简便经济、高效,适用于临床检测.广东地区的HCV基因型分布以1b型为主,呈现出1b型比例下降,3a、6a型比例升高的趋势.     

南通地区慢性丙型肝炎患者的HCV基因分型

目的 :了解南通地区慢性丙型肝炎患者的HCV基因型分布情况。方法 :将 5 3例抗HCV阳性的血清标本用RT -PCR法检测HCV -RNA ,然后采用膜显色结果判读的基因芯片对 3 2例HCV -RNA阳性者进行基因分型研究。结果 :南通地区HCV感染检出 1b、1a、2a、1b + 1a、1b + 1a + 2a共 5种单一基因型和混合基因型 ,其中以 1b型为主 ,占 5 3 .1%。结论 :南通地区 1b型为优势株 ,2a和 1b + 1a型居次 ;1b + 1a型高于全国其他地区。     

微板核酸杂交技术对江西地区HCV基因分型的观察

目的 采用微板核酸杂交-ELISA技术对HCV RNA进行基因分型。方法 采用PCR、核酸杂交和酶联显色技术，首先将HCV RNA进行RT-PCR扩增，并将扩增产物加入预先包被对HCV通用探针的徽孔板，再加入HCV各基因型显色探针，同时进行微板核酸杂交-ELISA显色，对江西地区129例临床诊断为丙肝RNA阳性患者血清中的HCVRNA进行基因分型研究。结果 江西地区HCV基因型可分为1b、2a、2b、3a、3b、6a、la／2a、1b／2a、1b／3a、1b／6a、3a／5a、2a／3a共12种单一基因型和混合基因型，其中以1b基因型为主，占50．39％；慢性丙肝患者的基因型较为复杂，存在较高比例的混合基因型。结论 江西地区HCV感染者以1b基因型为主．PCR徽板核酸杂交-ELISA方法可以准确、快速、简便进行HCV基因分型，在探讨HCV的流行病学及观察药物对各基因型的疗效方面具有重大的意义。     

衡阳地区HCV基因型分布特征及DAA应用的疗效观察

目的了解衡阳地区丙型肝炎病毒(HCV)基因型分布特征,观察直接抗病毒药物(DAA)对不同基因型丙型肝炎的治疗效果。方法对衡阳地区1 148例HCV患者进行基因分型检测及分析,并对133例应用DAA治疗的慢性丙型肝炎患者定期进行血清病毒含量和生化指标检测,观察不同基因型患者抗病毒治疗的应答情况。结果衡阳地区检测出4种HCV基因型(1、2、3、6)和7种基因亚型(1a、1b、2a、3a、3b、6a、6n),以1b型为主。在DAA治疗的HCV患者中,1b型和非1b型获得的病毒学应答率分别为98.78%和100.00%；生化学应答率均为100.00%。结论衡阳地区HCV感染以1b型为主,且女性高于男性,年龄≥50岁患者高于年龄＜50岁患者。DAA治疗不同基因型慢性HCV均能获得高持续病毒学应答,且疗效显著。     

广州地区丙型肝炎患者HCV基因分型研究

目的研究广州地区丙型肝炎患者HCV基因型分布的变化情况。方法收集207例HCV RAN阳性丙型肝炎患者血清,对其HCV Core区(C区)和NS5B区基因序列进行RT-nPCR扩增,两区扩增成功的PCR产物进行基因测序,测序结果分别与相应的参照株序列比对,构建系统进化树,两区基因分型结果一致者确定HCV基因亚型。结果 185例HCV C区和NS5B区都扩增成功,其中179例两区基因分型结果一致。共检出1、2、3、6型4种基因型和8种基因亚型,其中1b型占40.78%(73/179),6a型占27.37%(49/179),3b型占11.73%(21/179),3a型占8.94%(16/179),2a型占6.15%(11/179),1a型占3.91%(7/179),2b型占0.56%(1/179),6n型占0.56%(1/179)。1b株可分为A、B、C三大簇,A簇与中国广泛流行1b株接近、B簇与中国中部及南部地区流行1b株接近,6a株分为Ⅰ、Ⅱ两大簇,与献血人群及静脉吸毒人群中6a型株接近。结论广州地区丙型肝炎患者HCV基因型以1b、6a、3型为主,存在多种亚型;1b型株包含中国大部分地区的1b型株,6a、3型已取代2a型分别成为第二、三主要流行基因型;未发现6型变异株。     

南京地区2007-2014年丙型肝炎病毒基因型变化分析

目的：了解南京地区2007～2014年丙型肝炎病毒（HCV）基因型分布特征以及基因型的变化,并分析其与临床诊断结果的关系。方法：采用丙型肝炎病毒基因分型试剂盒DNA测序法对丙型肝炎1262例抗-HCV阳性血清进行HCV RNA检测和HCV病毒基因分型。结果：1262份抗HCV阳性血清中HCV RNA阳性1208例（95.7%）,单一基因型占91.4%,其中1b型占70.4%,2a型占9.3%,3b型占6.3%。混合基因型占4.4%,其中1b＆2a混合型占2.5%,1b＆3b混合型占1.6%,单一基因型和混合基因型分布差异无统计学意义（P〉0.05）。结论：南京地区HCV基因型以1b型为主,同时有6b和6h新基因型出现,提示今后南京地区会出现多种基因型并存。     

乌鲁木齐地区82例丙型肝炎患者基因型分布研究

目的 观察乌鲁木齐地区丙型肝炎患者的丙型肝炎病毒(HCV)基因型分布情况,了解HCV基因型与民族、年龄的关系.方法 在82份抗HCV抗体和HCV RNA均阳性的血清标本中,分别提取HCV RNA,通过PCR-反向点杂交法进行基因分型检测.结果 82例血清标本检测示,基因分型率95.12%,其中1型占60.26%(47/78),2型占20.51%(16/78),3型占16.67%(13/78), 6型占2.56%(2/78).≤40岁和＞40岁基因型总体分布上存在差异(P＜0.05),维吾尔族、汉族间基因型分布无统计学差异.结论 乌鲁木齐地区流行的HCV基因型为1(1b)、2(2a)、3(3a、3b)、6(6a)4型,1型为流行的主要基因型, 2、3、6型均占相当比例,初步说明乌鲁木齐地区HCV流行的基因型呈现多样性.     

丙型肝炎病毒山东分离株核衣壳蛋白区cDNA的序列测定

①目的　通过核衣壳蛋白区（ Ｃ区）基因序列分析,对丙型肝炎病毒（ Ｈ Ｃ Ｖ）山东分离株进行定型。②方法　应用反转录套式聚合酶链反应（ Ｒ Ｔｎｅｓｔｅｄ Ｐ Ｃ Ｒ）方法,从山东省 Ｈ Ｃ Ｖ 抗体阳性血清中扩增出 Ｈ Ｃ Ｖ Ｃ区基因的一个片段（４３２ｂｐ）,对其进行 Ｔ Ａ 克隆及测序,并通过 Ｄ Ｎ Ａ Ｓ Ｉ Ｓ软件和 Ｇｅｎｅｂａｎｋ 进行序列分析。③结果　此分离株与基因型１ｂ 的 Ｈ Ｃ Ｖ 分离株同源性最高,与４ 个已知 １ｂ 型分离株的核苷酸相应序列同源性为 ９６．５２８％ ～９８．１４４％ ,其推导的氨基酸同源性为９４．４４４％ ～９６．０３２％ ．④结论　此分离株归为 １ｂ 型。     

肝炎基因诊断芯片对丙型肝炎病毒基因分型检测的初步研究

目的 研究丙型肝炎病毒（HCV）基因分型诊断芯片的制备和其对丙型肝炎患者血清HCVRNA基因分型诊断的准确性。方法 根据丙型肝炎病毒5′端非编码区末端（5UTR）和C区设计引物和特异性探针,将设计的20条特异性寡核苷酸探针用核苷酸合成仪合成后,配制成浓度为50μmol/ml的点样液,用点样仪点到特殊处理的玻片介质上,制成丙型肝炎病毒基因分型诊断芯片,收集HCVRNA阳性的丙型肝炎患者血清60份作为实验组,健康人血清60份作为对照组,用荧光定量PCR仪对两组血清进行HCVRNA定量检测,实验组血清HCVRNA含量均大于500拷贝/ml,对照组血清HCVRNA含量均小地500拷贝/ml,两组血清进行HCVRNA分离纯化,逆转录反应,巢式PCR扩增后,分别用基因芯片,HCVRNA核酸序列测定法（美国Li-Cor核酸序列测定仪）进行双盲丙型肝炎基因分型检测。结果 实验组血清基因诊断芯片检测均为阳性;基因分型;1b型46例,3a型3例。3b型3例,2a型2例,2b型2例,混合型1b 2a2例。1b 3b型2例;核酸序列测定分型1b型50例,3a型3例,3b型3例,2a型2例,2b型2例;基因诊断芯片检测和核酸序列测定检测的基因分型结果符合率为93.3%。对照组血清基因芯片检测匀阴性。结论 肝炎病毒基因诊断芯片可以用于检测血清HCVRNA,并进行基因诊断分型,准确率较率。     

丙型肝炎病毒NS5B区基因的扩增、克隆及序列分析

目的 对丙型肝炎病毒(HCV)NSSB区基因克隆并测序，研究其变异状况。方法 从HCV RNA阳性血清中抽提病毒RNA，利用巢式RT-PCR对NS5B区基因进行扩增，将扩增获得的靶cDNA克隆至P^KPL-3a质粒载体中，并以内引物为测序引物进行序列测定分析。结果 构建了已克隆HCVNS5B区基因的重组质粒KHC5—1；序列分析表明，与HCV-BDS株同源性最高，属于主要流行于我国的HCV 1b基因亚型。结论 证实了在NS5B区，与RNA依赖的RNA聚合酶(RDRP)活性密切相关的基元结构Gly-Asp-Asp及其相邻序列的同源性非常高。     

丙型肝炎患者血清中丙型肝炎病毒交叉中和抗体的检测

[摘要]目的分析HCV感染者血清中是否存在交叉反应性中和抗体。 方法以分泌表达HCV包膜E2蛋白真核表达质粒转染的293T 细胞培养上清液中的HCV E2蛋白作为检测抗原,建立检测HCV E2抗体的ELISA方法,检测32份HCV抗体阳性的慢性丙肝患者血清,然后用免疫荧光分析血清与HCV全长包膜蛋白表达质粒转染的293T细胞的结合反应,再用5株HCV假病毒(HCVpp)及两株细胞培养产生的HCV(HCVcc)为模型分析血清的病毒中和活性。 结果32份HCV抗体阳性血清中,26份血清可检测出E2抗体,阳性率81.3%。其中HCV RNA阳性的12份血清均为E2抗体阳性,E2抗体水平与HCV RNA水平负相关。HCV E2抗体阳性血清对5株HCVpp以及两株HCVcc的感染性均有不同程度的中和作用,中和活性与E2抗体水平相平行。结论HCV感染可诱导保护性体液免疫应答,丙肝患者血清中存在交叉中和抗体,提示开发能诱导广泛交叉中和抗体的丙肝疫苗具有可行性。     

用套式RT-PCR法检测肝细胞癌中丙型肝炎病毒基因型

目的　检测人肝细胞癌（ＨＣＣ）组织中丙型肝炎病毒（ＨＣＶ）基因型。方法　用ＲＴＰＣＲ法常规检测ＨＣＣ组织和部分患者血清ＨＣＶ,再以巢式ＲＴＰＣＲ法对ＨＣＶ阳性标本中５种ＨＣＶ基因型进行鉴别。对多数标本中ＨＢｓＡｇ和ＨＢＶＤＮＡ也进行了免疫组化和原位杂交检测。结果　ＨＣＣ组织中ＨＣＶ阳性率为５０％（３９／７８）,与ＨＢＶ者（６４．４％）差异无显著性意义（Ｐ＞０．０５）,两者重叠感染率３４％（２０／５９）。在１０例血清ＨＣＶ阴性ＨＣＣ患者中,３例ＨＣＣ冰冻组织检出ＨＣＶＲＮＡ。在ＨＣＣ组织中共检出３种ＨＣＶ基因型,其中２ａ、１ｂ、３ａ和混合型分别为１７例（４３．６％）、９例（２３．１％）、４例（１０．３％）和２例（５．１％）,各基因型间差异有极显著性意义（Ｐ＜０．０１）,但２ａ型与１ｂ型间差异无显著性（Ｐ＞０．０５）,２ａ型与ＨＢＶ的重叠感染明显较其他ＨＣＶ基因型者常见（Ｐ＜０．０５）。结论　２ａ型ＨＣＶ是ＨＣＣ组织中最常见的基因型并易与ＨＢＶ重叠感染率,ＨＣＣ患者血清ＨＣＶ检测不一定能准确反映ＨＣＣ组织中的ＨＣＶ感染率,其所示基因型也有所不同。     

河南省庚型肝炎病毒感染情况和基因变异的研究

目的：为了探讨河南省庚型肝炎病毒的感染情况和河南株庚型肝炎病毒基因的变异特征。方法：利用逆转录——巢式——聚合酶链反应检测庚型肝炎病毒ＲＮＡ。将扩增产物克隆入Ｔ载体，进行测序和分析。结果：非甲－非成型肝炎中庚型肝炎病毒ＲＮＡ阳性率为３．３３％（１／３０），在丙型肝炎患者中阳性率为６％（３／５０），献血员中阳性率为０．５％（１／２００），对河南株庚型肝炎病毒ＲＮＡ阳性扩增、克隆、测序，与ＧｅｎＢａｎｋ中ＨＧＶ对应位置序列的同源性为９０％～９８．８％。结论：河南省存在反型肝炎病毒的感染者，ＨＧＶ与ＨＣＶ有重叠感染的现象，献血员中有ＨＧＶ携带者。河南株庚型肝炎病毒部分基因序列与已报道的序列均不完全一致，与国内分离株的同源性高于国外分离株。     

脂质转染剂增强基因疫苗诱导的免疫应答效力

目的 研究脂质转染剂（ＬｉｐｏｆｅｃｔＡＭＩＮＥ）提高丙型肝炎病毒（ＨＣＶ）核心（Ｃ）基因疫苗的抗病毒免疫应答效力。方法 人工构建包含ＨＣＶ Ｃ基因片段的的真核表达载体ｐｃＤ－ＮＡＨＣＶ－Ｃ,在证实期可以在真核细胞中表达之后,将期用脂质转剂包裹,形成ＬｉｐｏｆｅｃｔＡＭＩＮＥ－ｐｃＤＮＡＨＣＶ－Ｃ脂质混合物,将该混合物或单纯ｐｃＤＮＡＨＣＶ－Ｃ直接注射ＢＡＬＢ／ｃ小鼠股四头肌,以空载体ｐｃＤＮＡ     

丙型肝炎病毒的家庭内传播研究

通过对某村感染 HCV和未感染 HCV的献血员家庭(前者为组 Ⅰ,53户,后者为组 Ⅱ,60户)及无献血史村民的家庭(组 Ⅲ,110户),共计 223户,家庭成员共 666人分三组进行研究,发现组Ⅰ的家庭成员其抗—HCV阳性率(7.36%,12/163)明显高于组Ⅱ(1.11%,2/180)和组Ⅱ(2.48,8/323)(P<0.05).在组Ⅰ中12户存在HCV感染家庭聚集现象,与献血员为配偶关系者,其抗—HCV阳性率 15.22%,显著高于其他家庭成员4.27%(P<0.025).用套式PCR与Southern分子杂交技术对该12户的HCV感染者检测血和体液(唾液、精液、阴道分泌物)中 HCV—RNA,发现唾液 HCV—RNA阳性者多同时共中检出 HCV—RNA(5/6),2例血及体液 HCV—RNA阳性者其妻均感染 HCV,1户夫妻血及体液中 HCV—RNA均阳性,但其家人 3人均抗 HCV阴性.以上结果提示 HCV存在经唾液的生活密切接触及性接触传播的可能性.本文亦提示 HCV携带者可能为危险的传染源.     

PCR检测丙型肝炎病毒感染各高危人群

用ＰＣＲ方法克隆了中国丙型肝炎病毒（ＨＣＶ）感染者的５’端非编码区（５’－ｎｏｎｃｏｄｉｎｇｒｅｇｉｏｎ，５’－ＮＣＲ）序列，并根据此序列合成引物检测我国ＨＣＶ各高危感染人群的病毒复制情况，结果显示ＨＣＶＲＮＡ在慢性丙型肝炎患者的血清标中的阳性率为８１．８％（９／１１），在ＨＣＶ抗体阳性的血液透析患者血清标本中的阳性率为６３．６％（７／１１），在ＨＣＶ抗体阳性的献血员血清标中的阳性率为２０％（４／