LuxS基因缺失对变形链球菌耐酸性的影响

目的:探讨变形链球菌Ingbritt C (血清C型) 国际标准株与LuxS基因缺失的变形链球菌突变株之间耐酸能力的差异.方法:配制相同浓度的变形链球菌标准株与LuxS缺陷株菌悬液,分别在不同pH值(pH3.5～7.0)的BHI液体培养基中培养相同时间后,用紫外分光光度计测定吸光度,比较2 种菌株的生长情况;先在轻度酸性环境(pH5.5)中预酸化,再将2 种菌株于致死性pH值环境(pH3.0)中培养,比较其适应性耐酸能力.结果:①pH值为6.0～7.0时,2 种菌珠在相同pH值条件下生长情况间的差异无显著性(P>0.05), 且3 组不同pH值条件下细菌生长情况间的差异亦无显著性(P>0.05);②pH值为4.5～5.5时,2 种菌株的生长情况的差异有显著性(P<0.05);③在pH值为3.0时,LuxS缺陷株的生存率(0.006 5%)要明显低于标准株的生存率(0.078%),差异有显著性(P<0.05).④在pH值5.5环境下预酸化后,LuxS缺陷株的生存率(0.747%)约为标准株生存率(8.65%)的1/10.结论:在亚致死性pH值中,变形链球菌标准株与LuxS缺陷株的耐酸能力具有差异,标准株的耐酸能力强于LuxS缺陷株,2 种菌株均表现出了适应性耐酸的能力;变形链球菌LuxS缺陷株对酸的敏感性增加,而适应性耐酸能力仍然存在.     

变异链球菌LuxS基因缺陷突变株的构建及其生物膜结构的初步观察研究

目的:通过同源重组法构建变异链球菌LuxS基因缺陷突变菌株,比较其与变异链球菌UA159标准株在生物膜形成上的差异。方法:运用基因同源重组方法将氯霉素抗性基因(Cmr)与LuxS基因上下游区域的2个基因片段按一定顺序重组到PUC载体的多克隆位点中,构建出带氯霉素抗性标志的重组质粒,将载体质粒转化到含完整LuxS基因的变异链球菌UA159中,利用氯霉素抗性筛选出LuxS基因缺陷的突变株,并利用聚合酶链式反应(PCR)和哈氏弧菌发光实验进行检测。以釉质磨片为载体,在扫描电镜下观察上述两菌株含有20 g/L葡萄糖、20 g/L蔗糖的乳酪消化胨酵母(TPY)液体培养基中形成24 h的生物膜。结果:PCR基因扩增结果显示:突变株LuxS基因已被Cmr基因完全替换,成功的构建了变异链球菌LuxS基因突变株,并且突变株不能诱导哈氏弧菌BB170的生物发光。当用葡萄糖作为补充糖源时,变异链球菌UA159标准株和LuxS基因突变株所形成的生物膜表现型未见明显差异;而用蔗糖作为补充糖源时,两菌株所形成的生物膜有明显不同,UA159生物膜相对平滑均质,而LuxS基因突变株生物膜呈松散的蜂房状,基质间有较大的间隙,形成较大的团簇状菌落。结论:成功构建出LuxS基因缺陷的变异链球菌突变株,与变异链球菌UA159标准株其生物膜结构发生改变,提示LuxS会影响变异链球菌生物膜的形成。     

变异链球菌LuxS突变株的构建及其耐酸性的测试

目的:把构建好的含有luxS基因两侧同源序列的重组质粒转入变异链球菌进行luxS的敲除以形成luxS突变株,同时测试变异链球菌失去luxS基因后在pH 3.0酸性环境中的生长情况.方法:把含有luxS基因两侧同源序列的重组质粒(pMD-19TUKD)转化入变异链球菌UA159中,利用间源重组,等位基因交换进行luxS基因敲除,再对此突变株进行PCR的检测,利用测试A值、梯度稀释和平板计数法,对变异链球菌luxS突变株和野生型的变异链球菌在pH 3.0酸性环境下生存情况进行比较.结果:成功的构建了变异链球菌luxS的突变株,并且变异链球菌失去luxS基凶后,在酸性环境下的生存能力相对于野生型的变异链球菌低.结论:LuxS基因对变异链球菌的耐酸性起着重要作用.     

变异链球菌LuxS基因表达载体的构建

目的构建可用于变异链球菌表达系统的含LuxS基因的原核表达载体。方法应用聚合酶链反应(PCR)方法分别从变异链球菌的DNA、载体pEGFP-N1中扩增出LuxS基因的启动子(pLuxS)和绿色荧光蛋白(gfp)基因片段,经回收、纯化后,利用分子克隆技术分别克隆入载体pUC19中。结果通过对重组质粒pUC19-pLuxS-gfp的酶切图谱和DNA序列测定分析证实插入片段序列正确。结论成功构建出原核表达重组质粒pUC 19-pLuxS-gfp为下一步的功能研究奠定了基础。     

变异链球菌LuxS缺陷株甲基循环通路的恢复构建

目的:以变异链球菌LuxS缺陷株为模型,构建其密度感应缺陷的甲基循环恢复株。方法:以LuxS为阳性表达对照,通过在变异链球菌LuxS缺陷株中异源表达SahH,实现其代谢通路的恢复构建。通过Western 印迹、反转录PCR和信号分子AI-2分泌检测,验证目的蛋白的表达。采用SAS8.0软件包对数据进行统计学分析。结果:Western 印迹检测2种蛋白在大肠杆菌中均得到正确表达,验证了克隆载体的正常表达能力;反转录PCR验证了变异链球菌LuxS缺陷株中luxS及sahH mRNA的存在;发光实验证实LuxS阳性表达对照株AI-2的分泌能力恢复。结论:成功构建变异链球菌LuxS缺陷的代谢恢复株,为探讨LuxS的调控机制提供了分子生物学工具及实验对照。     

htrA、clpP基因缺失对变异链球菌耐酸性的影响

目的 探讨htrA、clpP基因缺失对变异链球菌耐酸性的影响.方法 变异链球菌标准株及htrA缺陷株、clpP缺陷株培养至对数中期分成两组,一组作为实验组进行5 h预酸化处理(pH:5.5),一组作为对照组在普通乳酪消化胨酵母(TPY)培养液中处理5 h,然后将两组菌株在致死性酸环境(pH:3.0)处理3 h,每隔1 h取菌液采用平板活菌计数法测定活菌数,计算得到生存率,统计学分析.结果 3 h内.未经预酸化处理三种菌株生存率相比差异无统计学意义(P>0.05),预酸化处理后,与标准株相比htrA缺陷株和clpP缺陷株生存率都有下降(P<0.05),两种缺陷株相比生存率差异无统计学意义(P>0.05),预酸化处理的标准株和htrA缺陷株生存率均明显高于未经预酸化处理(P<0.05),预酸化处理对生存率的影响大于两种基因分别缺失(P<0.05).结论 与变异链球菌标准株相比,htrA缺陷株和clpP缺陷株耐酸能力有不同程度的下降.     

LuxS基因突变对变形链球菌产酸代谢的影响

目的：研究LuxS基因突变对变形链球菌产酸代谢的影响,以探讨变形链球菌LuxS基因缺陷菌株致龋毒力的变化。方法：采用比浊法测定不同培养条件下变形链球菌LuxS基因缺陷菌株培养液的吸光度A值;同时测定不同培养条件下培养基上清液的pH值。结果：基因缺陷株细菌A值显著低于标准株（P〈0．05）;培养基初始pH〉5．0时,其产酸量小于亲代株,差异有统计学意义（P〈0．05）。结论：变形链球菌LuxS基因缺陷菌株的产酸代谢能力下降,其致龋力小于亲代菌株。     

变异链球菌luxS基因对牙菌斑生物膜形成的影响研究

目的敲除变异链球菌中的luxS基因,构建luxS突变株,测试变异链球菌失去luxS基因后形成牙菌斑生物膜的能力。方法把luxS基因敲除重组质粒转入变异链球菌UA159中,得到转化菌,在含有卡拉霉素的培养基中进行筛选,得到变异链球菌luxS基因突变株,并利用聚合酶链式反应（PCR）和哈氏弧菌发光实验对变异链球菌luxS突变株进行检测,通过扫描电镜,对不同时间段变异链球菌luxS突变株和变异链球菌UA159在BHIS培养液（含1%蔗糖的脑心浸液）和BHIG培养液（含1%葡萄糖的脑心浸液）中形成的生物膜进行比较。结果成功的构建了变异链球菌luxS突变株,在BHIS培养液中,变异链球菌luxS突变株形成生物膜的能力比变异链球菌UA159弱,而在BHIG培养液中,二者无显著差异。结论变异链球菌luxS基因对牙菌斑生物膜的形成有重要的影响,并且luxS基因对变异链球菌生物膜的调控是蔗糖依赖型的。     

clpP基因对变异链球菌生长及氧化应激的影响

目的观察变异链球菌clpP基因缺陷株的生长特点;比较标准株与clpP基因缺陷株在氧化应激条件下的生长情况的差异。方法将两菌株分别培养在普通TPY液体培养基和含有H2O2终浓度0.0 005%的TPY培养基中,37℃微需氧条件下培养,从接种入培养基开始以2 h间隔采用酶联免疫检测仪在600 nm下测定各菌株的生长曲线并比较其生长情况的差异。结果①缺陷株在TPY液体培养基中生长时,生长周期发生改变,对数期峰值提前且此阶段生长速度较标准株快(P<0.05),而标准株的对数期峰值及稳定期A值均明显高于缺陷株(P<0.05);②标准株和缺陷株在含有H2O2的TPY液体培养基中生长时生长能力较无H2O2条件下明显降低(P<0.05)。结论 clpP基因的失活一定程度上导致变异链球菌生长能力和氧化应激能力的降低。     

利用框内缺失法构建变异链球菌srtA基因缺失株

目的 利用框内缺失法,通过IFDC2基因盒及融合聚合酶链反应（PCR）、同源重组技术构建变异链球菌UA159菌株srtA基因缺失株。方法 PCR扩增变异链球菌UA159菌株srtA基因上下游同源片段及IFDC2基因盒,将这些片段连接、转化入UA159,替换srtA基因同源片段,筛选、鉴定红霉素抗性克隆;PCR扩增、连接UA159 srtA基因上下游同源片段,将连接片段转化入前述红霉素抗性克隆中替换IFDC2同源片段,筛选、鉴定抗苯丙氨酸类似物p-chloro-phenylalanine（p-Cl-Phe）克隆。结果 PCR、琼脂糖凝胶电泳及DNA测序结果均证明srtA基因编码区被完全删除,上下游片段无缝连接,成功构建UA159 srtA基因缺失株。结论 本研究成功构建了无标记的变异链球菌UA159 srtA基因缺失株,为进一步研究该基因在生物膜中的作用及其调控机制奠定了基础。     

变形链球菌luxS基因缺失对生物膜早期形成的影响

目的 利用变形链球菌luxS基因敲除突变株,研究这一种属间密度感应系统对生物膜早期形成的影响.方法通过在生物膜培养悬液中加入与菌细胞直径相近的磁性小珠,利用这些小珠在磁场中受到生物膜的位移约束力的原理,采用生物膜定量分析仪,定量比较、分析变形链球菌luxS基因knockout突变株与野生株在生物膜形成上的差异.结果变形链球菌luxS基因突变株与野生株在生物膜形成模式上有显著差别,突变株生物膜自第6小时起开始形成,生物膜形成指数(biofilm index,BFI)差值ABFI=2.015,约第10小时突变株形成的生物膜可完全限制磁珠在磁场中的位移(ABFI=7.025);而野生株生物膜约第10小时开始形成(ABFI=1.875),明显晚于突变株.12h后两菌株生物膜形成未见明显差异(P>0.05).结论变形链球菌luxS基因的缺失可影响生物膜的早期形成.     

变形链球菌生物膜形成相关基因的研究进展

变形链球菌是公认的主要致龋菌，其重要的毒力因子之一就是在牙表面形成生物膜。生物膜的形成是变形链球菌在牙面聚集生存以及致龋所必需的结构。本文综述了变形链球菌当中与生物膜形成相关的基因，以期为防龋研究提供新的思路。     

变形链球菌luxS基因突变对口腔混合细菌生物膜的影响

目的 研究致龋菌变形链球菌luxS基因在口腔细菌混合培养形成牙菌斑生物膜中的作用。方法 将变形链球菌野生株(UA159)及其2种luxS基因突变株（luxS基因高表达株和luxS基因缺陷株）分别与口腔细菌嗜酸乳杆菌（ATCC4356）按照1∶1比例接种于牛心脑浸液培养基,体外混合培养不同时间,包括生物膜形成过程中的初期（4 h）、中期（14 h）、晚期（24 h）,通过MTT法检测混合菌在生物膜形成的量。通过激光共聚焦显微镜观察混合细菌24 h形成的生物膜结构,实时定量PCR检测变形链球菌相关基因（ftf, smu630, brpA, gbpB, gtfB, vicR, comDE和relA）的表达。采用SPSS17.0软件包对数据进行统计学分析。结果 变形链球菌野生株及其2种luxS基因突变株与嗜酸乳杆菌混合培养14 h后,生物膜的量分别为0.481±0.024、0.591±0.023和0.279±0.019;24 h后,混合细菌形成生物膜的量趋势与该时间点一致,变形链球菌高表达株高于野生株,而缺陷株明显降低;但4 h后形成的生物膜组间无显著差异。激光共聚焦显微镜结果表明,高表达株和野生株的集聚程度更高,形成生物膜的结构更加紧密;而缺陷株生物膜菌间结构比较稀疏。以变形链球菌野生株和嗜酸乳杆菌混合形成的生物膜中相关基因的表达为标准,高表达株相关基因的表达均增加,缺陷株表达均降低,且各组间存在显著差异（P<0.05）。结论 变形链球菌luxS基因影响与具核梭杆菌混合培养形成的牙菌斑生物膜,为进一步研究该基因在生物膜中的作用及其调控机制提供了依据。     

变形链球菌菌斑生物膜相关基因突变的研究进展

变形链球菌能生成菌斑生物膜,后者与龋病的发生密切相关.随着现代口腔医学和分子生物学的发展,菌斑生物膜相关基因的研究也越来越多,发现了许多与之相关的基因,主要包括与黏附力相关的基因、与群体感应信号系统相关的基因等.对变形链球菌菌斑生物膜相关基因的研究可以更深入地了解其致龋机制,并对寻找防龋新途径作出有益的探索.本文就近年来与变形链球菌菌斑生物膜相关的基因突变研究作一综述.     

变异链球菌的htrA和clpP基因对其生长和饥饿耐受的影响

目的:观察变异链球菌(下称变链菌)htrA-clpP双基因缺陷株的生长特点;比较缺陷株与标准株在饥饿条件下生长情况的差异。方法:将两菌株分别培养在含有10 g/L葡萄糖及无碳源的TPY培养基中,37℃微需氧条件下培养,从接种入培养基开始以2 h为间隔采用酶联免疫检测仪在600 nm下测定各菌株在两种生长条件下的生长曲线并比较其生长情况的差异,同时在各时间点使用葡萄糖氧化酶法试剂盒测定在含葡萄糖培养基中生长的两菌株耗糖情况并比较其差异。结果:①缺陷株在含10 g/L葡萄糖和无碳源TPY培养基中生长时,生长周期都发生了改变,对数期峰值提前且此阶段生长速度较标准株快(P<0.05),而标准株的对数期峰值及平台期A值均明显高于缺陷株(P<0.05);②标准株和缺陷株在无碳源条件下生长时细胞的生长能力较葡萄糖条件下明显降低(P<0.05);③缺陷株消耗葡萄糖的速度较标准株快(P<0.05)。结论:htrA和clpP基因缺陷可在一定程度上导致变链菌的生长及抗饥饿能力降低。