骨髓间充质干细胞移植和动员对重症急性胰腺炎大鼠肝肾细胞凋亡的保护作用

目的探讨自体骨髓间充质干细胞移植和干细胞动员对重症急性胰腺炎大鼠肝肾细胞凋亡的保护作用。方法腹腔注射L-精氨酸制备大鼠SAP模型,随机分为假手术组、模型组、骨髓干细胞移植(mesenchymal stem cells,MSC)组、重组人粒细胞集落刺激因子组(G-CSF)及MSC+G-CSF组(n=48),各组再按术后不同观察时间段分为12、24、48、72h亚组(n=12)。MSC组造模后6h经股静脉注入自体骨髓间充质干细胞1.2ml,G-CSF组造模前连续3天皮下注入G-CSF 40μg/kg,MSC+G-CSF组则联合应用,假手术组仅腹腔注射等体积生理盐水。在术后相应时间点观察各组大鼠的死亡率,肝肾脏组织的病理变化,比较Bax、Bcl-2蛋白水平和细胞凋亡指数差异。结果各治疗组48h前未见死亡,72h死亡率与模型组比较无显著差异(P>0.05);肝脏、肾脏病理变化均较模型组减轻;治疗组各时间点肝肾细胞Bax表达较模型组下调,Bcl-2蛋白上调,凋亡指数较模型组有明显下降。MSC+G-CSF组24h点后Bax含量,48h、72h点Bcl-2含量,24h/48h点后细胞凋亡指数与MSC组和G-CSF组比较差异显著(P<0.05),MSC组和G-CSF组各时间比较无显著差异(P>0.05)。结论联合自体骨髓MSC移植与动员能有效抑制重症急性胰腺炎时肝脏和肾脏的细胞凋亡。     

自体骨髓间充质干细胞移植加动员在重症急性胰腺炎大鼠胰腺保护中的作用

目的探讨自体骨髓间充质干细胞移植和干细胞动员对重症急性胰腺炎大鼠胰腺的保护作用。方法腹腔注射L-精氨酸制备大鼠SAP模型,随机分为假手术组、模型组、骨髓干细胞移植组(MSC)、重组人粒细胞集落刺激因子组(G-CSF)及MSC+G-CSF组(n=48),各组再按术后不同观察时间段分为12、24、48、72h亚组(n=12)。MSC组造模后6h经股静脉注入自体骨髓间充质干细胞1.2ml,G-CSF组造模前连续3天皮下注入G-CSF 40μg/kg,MSC+G-CSF组则联合应用,假手术组仅腹腔注射等体积生理盐水。在术后相应时间点观察各组大鼠的死亡率,观察胰腺病理改变并评分,测定Bax蛋白水平和细胞凋亡指数,检测血清中TNF-α、IL-6、AMY、CRP含量,用方差分析比较各治疗组间的指标差异。结果各治疗组48h前未见死亡,72h死亡率与模型组比较无显著差异(P>0.05);胰腺病理变化较模型组减轻;治疗组各时间点Bax蛋白水平和凋亡指数均较模型组增高(P<0.05),MSC+G-CSF组48、72h凋亡指数及24、48,72h Bax蛋白含量与MSC和G-CSF组比较差异显著(P<0.05);各治疗组血清TNF-α、IL-6、AMY、CRP含量24h/48h后较模型组明显降低(P<0.05),MSC+G-CSF组48h/72h各指标与MSC组和G-CSF组比较差异显著(P<0.05);MSC组与G-CSF组各项指标比较均无显著性差异(P>0.05)。结论联合自体骨髓MSC移植与动员能有效保护重症急性胰腺炎早期大鼠胰腺的损伤,可能与MSC的抗炎症及促进胰腺腺泡细胞凋亡等机制有关。     

骨髓干细胞移植加动员在重症急性胰腺炎大鼠小肠黏膜细胞凋亡中的调节作用

目的探讨骨髓间充质干细胞对重症急性胰腺炎大鼠肠黏膜细胞凋亡的保护机制。方法 240只SAP大鼠分为对照组、SAP组、干细胞组、动员组及联合组,各组再平分为术后12、24、48、72h组。干细胞动员组用G-CSF液动员3天,干细胞组一次性静脉注射MSC液,联合组动员加注射MSC。记录大鼠的病死率,肠黏膜上皮细胞的Chiu评分,凋亡蛋白Bax、Bcl-2基因水平,细胞凋亡指数AI,比较联合治疗效果。结果各组72h病死率差异不显著(P>0.05);治疗组肠黏膜上皮损伤程度较轻,联合组48h后Chiu病理评分与单独治疗组比较差异显著(P<0.05);治疗组AI及Bax蛋白水平随时间延长较SAP组下调,Bcl-2蛋白水平上调,联合组与干细胞组、动员组比较差异显著(P<0.05),而动员组与干细胞组之间并无显著差异(P>0.05)。结论 MSC静脉移植与动员能抑制肠黏膜上皮细胞过度凋亡,维持肠黏膜屏障完整性,能有效减轻重症急性胰腺炎小肠黏膜的损伤,联合治疗效果优于单独治疗。     

小剂量氮芥对胰腺炎治疗作用及其机制的研究

目的:探讨氮芥对重症急性胰腺炎的治疗作用及其可能机制。方法:30只雄性SD大鼠随机分成3组;重症急性胰腺炎组(SAP组,n=10),用3.5%牛黄胆酸钠逆行性胆胰管注射后钳夹胆胰管末端制作重症胰腺炎模型;氮芥治疗一组(C1组,n=10),制作重症急性胰腺炎模型前8h,氮芥0.1mg/kg腹腔注射;氮芥治疗二组(C2组,n=10),制作重症急性胰腺炎模型前8h,氮芥0.15mg/kg腹腔注射。各组大鼠6h后处死,取标本并检测血清淀粉酶、血糖、血钙及全血白细胞记数。结果:与重症急性胰腺炎组相比,氮芥治疗一组和氮芥治疗二组胰腺、肝脏、肺脏组织损伤明显改善;血浆Ca2+、血清淀粉酶、血糖浓度及全血白细胞记数等生化指标与SAP组相比有统计学意义。结论:氮芥可能通过诱导胰腺细胞发生凋亡而减轻了重症急性胰腺炎SD大鼠的组织损伤。     

MSC移植治疗SAP大鼠失败的原因探讨

目的研究MSC移植治疗SAP大鼠的效果,探讨治疗失败的原因。方法将雄性SD大鼠随机分成5组：假手术组（SO组）、重症急性胰腺炎组（SAP组）、地塞米松治疗组（D组）、干细胞治疗组（M组）和干细胞＋G—CSF治疗组（MC组）。上述各组再随机分为6、24小时组,各治疗组分别给予地塞米松注射液、干细胞或干细胞＋G—CSF进行治疗,于造模或剖腹探查术后6、24小时后分别采取血清、腹腔积液和肝、肺、胰和肾脏组织标本,记录大鼠的病死率,检测血清中肝、肾功能指标和淀粉酶的含量,测定腹腔积液量／体重比值,观察大鼠多脏器病理改变,并进行病理评分。结果（1）6和24小时各组大鼠存活率的比较：SO组24小时点存活率明显大于SAP组和各个治疗组（P均〈0．05）;D组24小时点存活率明显大于SAP组（P〈0．05）,其余组无明显差异（P〉0．05）。（2）各组6小时点多项指标检测结果的比较：D组胰腺评分、腹腔积液与体重比值、肝肾功能指标、淀粉酶含量明显大于SO组（P〈0．05或P〈0．01）。（3）24小时点D组大鼠的胰腺病理评分明显大于SO组（P〈0．05）。（4）M组及MC组大鼠的胰腺组织内均可见荧光染料清晰显影。结论地塞米松能明显降低SAP大鼠病死率,疗效优于M组及MC组。M组和MC组大鼠的存活率、胰腺病理评分,腹腔积液与体重比值和肝。肾功能指标,淀粉酶含量与SAP组比较,均无明显差别。MSC收集和培养过程复杂,需要较长的时间才能产生出治疗效果,而采用MSC治疗SAP需要一定的起效时间,假如冒然用于急、重症疾病的治疗缺乏现实意义和足够的理论支持。因此,我们认为MSC难以成为治疗SAP的新手段。     

重症急性胰腺炎中HMGB1的变化及丹参干预的实验研究

目的探讨重症急性胰腺炎(severe acute pancreatitis,SAP)时血浆高迁移率组蛋白-1(high mobilitygroup box-1,HMGB1)水平的时相变化,以及中药丹参注射液的干预作用。方法 SD大鼠120只,随机均分为对照组(C)、重症急性胰腺炎组(P)、丹参治疗组(T)。用5%牛磺胆酸钠逆行胰胆管注射制备重症急性胰腺炎(SAP)模型,用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测各组动物不同时点的血浆HMGB1水平。结果与对照组相比,SAP组大鼠血浆HMGB1水平在建模后12 h开始有明显升高,24 h和48 h仍维持在较高水平(P0.05);丹参治疗组HMGB1水平明显低于SAP组(P0.05)。结论 HMGB1可能作为晚期炎症因子参与了SAP的全身炎症反应,丹参注射液可明显降低HMGB1指标,对SAP的病程发展具有一定的阻断作用。     

PDTC对实验性重症急性胰腺炎肺损伤的保护作用

目的观察二硫代氨基甲酸吡咯烷(PDTC)对重症急性胰腺炎肺损伤(PALI)的保护作用。方法 SD大鼠60只,分为对照组、重症急性胰腺炎(SAP)组、PDTC预处理组,每组再分为3h、6h、9h及12h四个时间组。采用5%牛磺胆酸钠胰胆管逆行注射诱发大鼠SAP模型。PDTC预处理组在建立SAP模型前1h腹腔内注射PDTC。检测血清淀粉酶并通过透射电镜观察肺组织超微结构改变。结果透射电镜下SAP各组可见Ⅱ型肺泡上皮细胞线粒体肿胀、核浓缩等现象。PDTC预处理组与相对应的SAP各组比较均有不同程度减轻。结论 PDTC预处理各组大鼠胰、肺组织病理学改变减轻,提示PDTC对SAP肺损伤具有保护作用。     

重症急性胰腺炎急性期细胞因子及胰腺腺泡细胞凋亡的动态变化

目的 本研究通过重症急性胰腺炎（SAP）大鼠血清淀粉酶、TNFa、IL－6、胰腺腺泡细胞凋亡指数及胰腺组织学变化程度作用的动态观察，以进一步了解治疗SAP的作用机理。方法 用chetty法制做大鼠SAP模型，动态测定术后0h、24h、30h、36h各组血清TNFa、IL－6浓度，并取得胰组织做病理学检查；同时，应用TUNEL技术分析大鼠胰腺腺泡细胞凋亡的变化。结果 研究发现SAP组30、36h时血清TNFa、IL－6水平明显升高，腹水量明显增加，胰组织病变程度明显加重；胰腺腺泡细胞凋亡指数较SAP组胰腺腺泡细胞凋亡指数明显升高。结论 重症急性胰腺炎（SAP）胰酶及炎症介质的释放及胰腺腺泡细胞凋亡在其病情发展起一定的作用。     

粒细胞集落刺激因子动员自体骨髓干细胞促进大鼠部分肝移植物的肝再生

目的探讨粒细胞集落刺激因子(G-CSF)动员自体骨髓干细胞是否会促进部分肝移植物的再生,减轻肝损伤。方法建立性别交叉的大鼠(雌性→雄性)50%部分肝移植模型(PLTx),移植前动员组:移植前受体皮下注射G-CSF5d;移植后动员组:移植后3h,注射G-CSF5d;未动员组:移植后3h,皮下注射生理盐水5d。分别与1、3、5、7和14d取肝脏。检测移植物内CD34干细胞标志,确定干细胞迁移入肝脏的情况,观察肝脏的有丝分裂相和溴脱氧核苷尿嘧啶(BrdU)掺入检测肝再生情况,并检测sry+细胞确认细胞来源。结果用G-CSF动员后发现,移植后动员组14d生存率(90%)较移植前动员组(60%)和未动员组(50%)高,差异有统计学意义。与未动员组相比,移植后第3天,肝坏死灶少,有丝分裂指数高(30%±5%vs24%±6%,P<0·05),BrdU掺入高(42%±6%vs34%±4%,P<0·05),差异有统计学意义。移植后第3至14天,移植后动员组汇管区可见较多的CD34+的成堆或散在分布的淋巴细胞样细胞;移植后第3天,移植前动员组见汇管区较多的CD34+细胞。移植后第5天各组在肝窦和汇管区偶见sry阳性细胞,第14天,G-CSF动员两组汇管区周围sry阳性细胞增多,未动员组较少。结论移植后用G-CSF动员自体骨髓干细胞,受体生存率高,移植肝再生明显,肝损伤轻。     

造血干细胞动员及采集的影响因素

目的 研究影响外周血干细胞的动员及采集因素.方法 35例血液病患者予以化疗+粒细胞集落刺激因子(G-CSF)动员,15例正常供者予以G-CSF动员.用Cobe Spectra血细胞分离机采集外周血干细胞.结果 外周血造血干细胞的有效动员与被动员者的年龄、性别、体表面积、采集的循环血量及骨髓是否曾经累及无关,而与动员所应用的化疗的种类相关;以环磷酰胺(CTX)为主的化疗+G-CSF动员优于柔红霉素+阿糖胞苷(DA)+G-CSF(P＜0.01);CTX为主的化疗+G-CSF动员产品单个核细胞与中剂量阿糖胞苷+G-CSF动员无统计学差异,CD34+含量则CTX组显著优于DA组(P＜0.05);中剂量阿糖胞苷+G-CSF动员与DA+G-CSF动员方案相比较,两组无统计学差异(P＞0.05).结论 外周血造血干细胞的有效动员与动员所应用的化疗种类相关,CTX为主的化疗+G-CSF动员效果最佳,蒽环类药物动员效果相对较差并动员前尽量减少使用.     

骨髓间充质干细胞对高氧肺损伤大鼠的治疗作用

【目的】: 观察骨髓间充质干细胞(MSC)对新生大鼠高氧肺损伤的治疗作用?【方法】 贴壁法体外培养扩增大鼠骨髓MSC,利用携带GFP基因的慢病毒液对骨髓MSC进行转染;SD新生大鼠随机分为A?B?C?D?E五组,A,B两组高氧暴露7 d后经尾静脉分别注射(1 × 105 /只和1 × 104 /只)骨髓MSC,C组注射磷酸盐缓冲液(PBS),D?E两组为空气组,分别注射骨髓MSC和PBS,观察骨髓MSC在大鼠肺组织的分布情况?大鼠的体质量增长?肺系数?放射性肺泡计数(RAC)及肺组织的病理改变?【结果】 A?B?D组肺组织中均可见GFP+ 细胞;MSCs干预3?7 d,A,B两组GFP+ 细胞占总细胞数的比例高于D组(31.3 ± 2.6% vs. 11.8 ± 1.3%,A组 vs. D组, 22.7 ± 1.3% vs 11.8 ± 1.3%, B组 vs. D组,P < 0.05);A组治疗第3?7?14天GFP+ 细胞占总细胞数的比例高于B组,P < 0.05;A?B两组治疗后体质量增长加快(66 ± 9 g vs. 48 ± 7 g,A组 vs. C组, P < 0.05),肺系数降低(2.26 ± 0.23% vs. 2.9 ± 0.4%,A组 vs. C组, P < 0.05),RAC值明显增加(9.2 ± 0.7 vs. 7.4 ± 0.4,A组 vs. C组, P < 0.05),肺部炎性反应减轻;A组对高氧肺损伤的治疗作用优于B组,P < 0.05?【结论】 两种剂量的骨髓MSC均可以减轻高氧肺损伤,高剂量组对高氧肺损伤的治疗效果更明显。     

大鼠骨髓间质干细胞培养扩增及表面标志

目的 建立体外分离培养大鼠骨髓间质干细胞(MSC)方法．探讨MSC的扩增与鼠龄的关系及其部分细胞表面标志的动态改变。方法 分别取2月龄和5月龄鼠骨髓，经密度梯度离心后取单核细胞层接种．待细胞长满后进行传代．隔日行细胞计数。对2月龄鼠的4代MSC分别进行表面标志抗原动态观察。结果2月龄鼠MSC的扩增率明显高于5月龄鼠MSC。流式细胞仪鉴定显示随着传代次数增多，CD29阳性率趋向升高；CD90阳性率趋于降低；CD34与CD45阴性率趋于升高。结论 进行大鼠MSC培养扩增时MSC的取材可能要考虑大鼠月龄。在MSC培养扩增的过程中其表面抗原标志会发生变化．这些变化可能表示了细胞纯度的变化。     

骨髓间充质干细胞治疗大鼠糖尿病肾病初探

目的 探索骨髓间充质干细胞(MSCs)经体外扩增培养后移植入糖尿病肾病大鼠体内能否改善或者治疗糖尿病肾病.方法 SD大鼠60 mg/kg STZ一次性腹腔注射,糖尿病成模后4周,成功制备糖尿病肾病大鼠被随机分为:糖尿病肾病对照组(n=12)和干细胞移植组(n=12),另选6只正常大鼠作为对照组.MSCs经体外培养、鉴定、BrdU标记后,心脏注射到干细胞移植组大鼠体内(2×106 MSCs/200 μL),一周后再次注射等量干细胞.于末次注射后1、2、8周测定大鼠血糖、体质量、24 h尿总蛋白、肌酐清除率、肾脏肥大指数,观察大鼠肾脏病理变化和标记干细胞体内作用情况.结果 MSCs体外扩增培养后表达间充质细胞的表型抗原,能多向分化为成骨、成脂细胞.在体内能趋化到受损肾脏,但在干细胞定植部位未发现增殖细胞.干细胞移植组和糖尿病肾病对照组在各观察时点血糖、尿总蛋白、肌酐清除率、肾脏肥大指数均明显高于正常对照组(P<0.05), 体质量均低于正常对照组(P<0.01).干细胞治疗后1周移植组较糖尿病肾病对照组血糖降低[(26.7±2.8) vs (29.9±1.6) mmol/L,P<0.05].在第2、8周,移植组较糖尿病肾病对照组24 h尿总蛋白降低,但差异无统计学意义.干细胞移植组肌酐清除率低于糖尿病肾病对照组,在治疗后2周两组差异有统计学意义[(8.6±1.9) vs (17.1±1.6) mL/min,P<0.05].在第2周干细胞移植组的肾脏肥大指数较糖尿病肾病对照组减少(5.5±0.1 vs 6.2±0.3, P<0.05),但高于正常对照组(3.2±0.2).结论 发现MSCs经体外培养标记后在体内能趋化到糖尿病肾病大鼠肾脏,可以暂时改善糖尿病肾病.     

骨髓基质干细胞定向分化成心肌样细胞的基础研究

目的：骨髓基质干细胞在体外能定向分化成心肌样细胞。本研究旨在将分离出来的骨髓基质干细胞标记后注射到心壁内，观察其能否分化成心肌样细胞。方法：将骨髓基质干细胞体外培养扩增后用Brd U标记，将标记后的骨髓基质干细胞注射入结扎冠状动脉左前降支远端的大鼠左心室壁内，假手术组仅注射等量的培养液(元细胞)。结果：反复传代可获得大量纤维状的骨髓基质干细胞，Brd U对骨髓基质干细胞的标记率约为41．4l％。手术组细胞注射部位心脏组织中部分细胞内可见抗心室肌肌凝蛋白重链单克隆抗体(MHC)、抗Brd U抗体及抗心房利钠肽抗体、抗Brd U抗体双染色阳性颗粒，假手术组仅为单染色阳性颗粒。结论：移植的骨髓基质干细胞能在心脏提供的特殊微环境下分化成心肌样细胞。     

不同途径移植大鼠骨髓间充质干细胞对大鼠肝硬化的作用研究

目的探索不同途径移植绿色荧光蛋白（green fluorescent protein,GFP）标记的大鼠骨髓间充质干细胞（rat bone marrow mesenchymal stem cells,rBMSCs）在慢性肝纤维化中的作用,以及移植后细胞在肝脏组织内的存活、分布情况。方法全骨髓差速贴壁法分离、培养BMSCs,利用携带GFP基因的慢病毒载体感染P3代BMSCs,建立四氯化碳慢性肝纤维化大鼠模型,通过不同途径移植GFP标记的BMSCs,移植后维持四氯化碳肝损伤,1月后处死大鼠,行肝脏功能相关指标白蛋白（albumin,ALB）、谷丙转氨酶（alaninotransferase,ALT）和谷草转氨酶（aspartate aminotrans-ferase,AST）检测,观察肝脏局部组织标本苏木精-伊红染色（hematoxylin-eosin staining,HE）、胶原纤维染色和荧光分布情况。结果不同途径BMSCs移植对大鼠四氯化碳所致慢性肝纤维化肝脏功能无明显改善,移植后GFP标记的BM-SCs均可向损伤肝脏迁移或停留,不同途径移植的BMSCs在肝脏内分布不同。结论大鼠骨髓间充质干细胞移植对大鼠慢性肝纤维化无明显治疗作用,可能参与了肝纤维化的形成。     

骨髓间充质干细胞在致敏小鼠体内示踪归巢的实验研究

 【目的】了解骨髓间充质干细胞在以异基因脾细胞输注致敏小鼠体内的归巢情况。【方法】正常同种异基因小鼠骨髓间充质干细胞的体外培养及鉴定后,体外予经羧基荧光素二醋酸盐琥珀酰亚胺酯荧光染料标志,经尾静脉注射到致敏组和非致敏组小鼠体内（每组10只）,在6h、24h和48h处死动物,分别应用冰冻切片和流式检测方法了解骨髓间充质干细胞在各个脏器的分布情况。【结果】冰冻切片和流式检测结果均表明骨髓间充质干细胞在致敏小鼠体内迅速和持久在脾,肝脏聚集,而非致敏动物却没有明显聚集到肝脾等脏器,却是最终归巢到了骨髓。其中流式定量结果表明：6h时致敏小鼠脾脏荧光阳性细胞为（3.78±0.66）％,与同期正常小鼠脾脏结果比较P ＜0.05,有统计学意义;而在48h时致敏小鼠骨髓荧光阳性细胞为（0.43±0.35）％,同期正常小鼠骨髓为（5.40±1.58）％,两者比较 P ＜0.05,有统计学意义。【结论】应用异基因脾细胞致敏的小鼠体内肝脾等免疫脏器明显受到致敏影响,其对骨髓间充质干细胞体内归巢的定位具有很高的趋化吸附作用,中止了骨髓间充质干细胞正常状态下向骨髓的归巢。     

骨髓间充质千细胞分离培养及在移植肝中定居能力的研究

目的体外分离培养并鉴定扩增大鼠骨髓间充质干细胞（MSC）,观察MSC在肝移植受体内的定居能力。方法直接贴壁法培养大鼠MSC,绘制细胞生长曲线;流式细胞仪检测细胞表面标志。定向诱导MSC向成骨和成脂肪分化,鉴定其多向分化潜能。DAPI荧光标记MSC,由门静脉注入肝移植受体,取肝组织冰冻切片,观察其在移植肝内的定居情况。结果直接贴壁法成功分离培养MSC,并在传代培养中得以纯化扩增。传代周期约5d,可在体外传代20代以上,具有强大的增殖能力。流式细胞仪检测符合MSC表型。MSC可成功分化为成骨细胞和脂肪细胞,具有多向分化的能力。DAPI标记MSC的阳性率达100％。荧光显微镜观察。可见MSC定位于移植肝内。结论直接贴壁法分离培养MSC简单易行,获得MSC纯度高,生物学特性稳定;MSC可以在移植肝内存活并定居。