地塞米松诱导人脐静脉内皮细胞凋亡

目的：观察地塞米松对人脐带静脉血管内皮细胞( ECV304)增殖的影响。方法：采用细胞凋亡的荧光检测法（Heochst 33342）检测地塞米松对脐静脉血管内皮细胞（ECV304）的形态学改变, MTT 法观察地塞米松对ECV304增殖的抑制作用,流式细胞仪术检测地塞米松引起的ECV304凋亡率改变。结果：较高剂量（100umol/L）地塞米松对脐静脉血管内皮细胞增殖起抑制作用,并诱导其凋亡。结论：地塞米松具有比较明显的抑制血管内皮细胞增殖的作用。地塞米松抗血管生成的机制可能与其抑制血管内皮细胞增殖、诱导内皮细胞凋亡有关。     

重组人内皮抑素诱导人脐带静脉血管内皮细胞凋亡

目的观察人内皮抑素重组蛋白对人脐带静脉血管内皮细胞增殖的影响。方法采用细胞凋亡的荧光检测法检测对内皮细胞凋亡的影响。MTT法观察不同浓度的重组人内皮抑素对人脐带静脉血管内皮细胞（ECV304）增殖的抑制作用。结果重组人内皮抑素具有明显的抑制内皮细胞增殖的作用，ED50=550ng／ml，随重组蛋白浓度的增加抑制作用更为明显。结论重组人内皮抑素对细胞增殖的抑制与其浓度呈正相关，存在剂量效应关系；内皮抑素抗血管生成的机制与其抑制内皮细胞增殖、诱导内皮细胞凋亡有关。     

人肿瘤抑素慢病毒表达载体在肝癌细胞中的表达

目的:观察人肿瘤抑素(tumstatin)对血管生成的抑制作用,探讨肿瘤抑素在肝癌基因治疗中的应用前景.方法:构建人肿瘤抑素慢病毒表达载体pLenti-Tum,经293T细胞包装,收集病毒上清液,感染肝癌细胞株SMCC-7721,收集各组细胞的条件培养基,通过蛋白质印迹分析各组细胞肿瘤抑素的表达情况,并通过人脐静脉血管...     

重组腺病毒Ad-ES对人脐静脉内皮细胞的体外抑制作用

目的 构建携带人内皮抑素(ES)的重组腺病毒Ad-ES,体外感染人脐静脉内皮细胞ECV-304,观察抑制作用.方法 以Pshuttle-ES质粒为模板PCR扩增ES基因片断,利用AdEasy-1系统及AAV293细胞构建并包装出Ad-ES,感染ECV-304细胞,病毒感染48 h后,Western blot检测ES蛋白表达,流式细胞术及DNA ladder检测ECV-304细胞凋亡情况,绘制细胞生长曲线.结果 ECV-304细胞在感染Ad-ES后生长受到抑制,感染3 d后出现细胞凋亡.结论 重组腺病毒Ad-ES在体外可抑制ECV-304细胞的生长并诱导其凋亡.     

羟基红花黄色素A抑制异常增殖血管内皮细胞的机制研究

目的研究羟基红花黄色素A(HSYA)抑制异常增殖血管内皮细胞的作用机理。方法建立人结肠腺癌细胞LS180上清液和人脐静脉内皮细胞ECV304体外共培养模型,通过实时荧光定量PCR检测ECV304细胞中血管内皮生长因子(VEGF)及其受体(KDR)、碱性成纤维细胞生长因子(b FGF)及其受体(b FGFR)、HSPG2、p53、c-myc mRNA水平的表达;ELISA法检测细胞培养上清VEGF、VEGFR(KDR)、b FGF、b FGFR蛋白的表达。结果在共培养细胞模型中,0.66、0.33 mg/L浓度的HSYA对血管生成促进因子VEGF及其受体KDR、b FGF及其受体b FGFR和癌基因c-myc及与细胞增殖相关蛋白多糖HSPG2的mRNA表达具有抑制作用;对抑癌基因p53 mRNA的表达具有促进作用。0.66、0.33 mg/L浓度的HSYA对血管生成促进因子VEGF及其受体KDR、b FGF及其受体b FGFR的蛋白表达具有抑制作用。结论 HSYA抑制新生血管的生成、抑制共培养模型中血管内皮细胞的异常增殖,其可能的作用机理是通过调控VEGF及其受体、b FGF及其受体、HSPG2、c-myc和野生型p53的表达发挥抗肿瘤作用,揭示HSYA可能是潜在的肿瘤血管生成抑制剂。     

内皮抑素基因腺病毒载体的构建及表达

目的：构建人内皮抑素（Human Endostatin，hE）基因的腺病毒载体，并研究其对胃癌细胞株SGC-7901、MKN-45及人脐静脉内皮细胞系ECV304生物学特性的影响。方法：采用Lipofectamine2000法将含有人内皮抑素基因的质粒pCA13-hE与pBGHE3共同转染293细胞；免疫荧光法及Western Blot检测hE的表达；用不同感染复数（Muhiplicity of infection，MOI）的重组人内皮抑素基因的腺病毒感染ECV304细胞，观察细胞生长。结果：成功构建了含hE基因的腺病毒载体；经含hE基因腺病毒载体感染的人SGC-7901胃癌细胞株、MKN-45胃癌细胞株均表达hE蛋白；表达的hE蛋白具有一定的生物学活性，可以抑制人静脉内皮细胞系ECV304的生长。结论：获得了有表达功能活性的Endostatin腺病毒载体，表达产物可抑制ECV304细胞的增殖，为肿瘤的抗血管基因治疗提供了必要条件。     

Transwell小室共培养条件下缺氧时视网膜色素上皮细胞对内皮细胞增殖的影响

目的 研究在Transwell小室共培养系统中,缺氧时视网膜色素上皮细胞(retinal pigment epithelium,RPE)对血管内皮细胞增殖的影响.方法 培养并鉴定RPE细胞和人脐静脉血管内皮细胞,利用200 μmol/LCoC12造成细胞缺氧、Transwell小室建立细胞共培养模型.实验分为4组:对照...     

昆明山海棠提取物对人脐静脉血管内皮细胞增殖的抑制作用

目的 探讨昆明山海棠提取物(THW-4)对人脐静脉血管内皮细胞增殖的抑制作用.方法 培养人脐静脉血管内皮细胞,加入不同计量的THW-4进行处理,细胞计数、MTT、细胞周期测定观察THW-4对HUVEC增殖的影响.结果 THW-4可以明显抑制HUVEC增殖,呈剂量依赖性,作用24 h的半有效抑制浓度(IC50)为1.09 ng/mL;THW-4(0.5～10 ng/mL)作用HUVEC 24 h后,THW-4主要阻滞HUVEC于G0/G1期.结论 THW-4能有效抑制体外培养的HUVEC增殖,进一步证明THW-4对球囊损伤血管内皮再生及修复无保护作用     

Tie2在人脐静脉内皮细胞中的表达及意义﹡

[摘要] 目的 探讨酪氨酸激酶受体-2(tyrosine kinase with immunoglobulin-like and epidermal growth factor homology domains,Tie-2)基因在人脐静脉内皮细胞株ECV304中的表达,为进一步研究Tie-2在肿瘤血管生成中的作用提供实验基础。方法 传代人脐静脉内皮细胞进行培养和形态学观察,采用免疫组化(SABC法、DAB显色)对人脐静脉内皮细胞株ECV304中的Tie-2基因的蛋白表达情况进行检测。 结果 相差显微镜下,培养的活细胞具有单层"卵石样"排列的典型特征,SABC法检测到Tie-2蛋白在人脐静脉内皮细胞株ECV304细胞膜、细胞浆和核膜中均呈深棕色颗粒。 结论 Tie-2在ECV304细胞株中呈强阳性表达.     

重组人血管内皮抑素对多发性骨髓瘤血管新生的影响

目的观察重组人血管内皮抑素注射液对人脐静脉内皮细胞株（HUVEC）和多发性骨髓瘤细胞株KM3增殖、凋亡及共培养体系中血管生成的影响。方法观察不同浓度的内皮抑素对HUVEC和KM3细胞株的增殖抑制作用;检测有效浓度的内皮抑素对HUVEC和KM3细胞株的凋亡作用;建立HUVEC和KM3的隔离共培养和混合共培养体系,检测共培养体系中不同浓度的内皮抑素作用后对于HUVEC血管生成的影响;检测经内皮抑素作用后对混合共培养、隔离共培养上清中VEGF浓度的影响。结果不同浓度的内皮抑素持续作用72 h,对HUVEC具有抑制增殖作用,且在50-200 ng/ml的剂量范围内呈现浓度依赖关系,而对KM3细胞未见明显作用;有效浓度的内皮抑素（100、200 ng/ml）可诱导HUVEC凋亡,而对KM3未见明显作用;共培养体系中,内皮抑素可抑制HUVEC的管状结构形成;经不同浓度内皮抑素作用后,细胞培养上清中VEGF的分泌量减少。结论内皮抑素能抑制HU-VEC的增殖;诱导HUVEC的凋亡;通过血管内皮抑制骨髓瘤细胞的促血管新生作用;抑制VEGF的分泌可能是其作用机制之一。     

人脐静脉内皮细胞分离及冷冻保存的技术

目的 研究分离、培养、扩增人脐静脉内皮细胞及进行冷冻保存技术，探讨建立脐带血管内皮细胞库的可能性。方法 新鲜脐带42条，脐静脉内灌注消化酶消化，获得内皮细胞：以含20％的胎牛血清M199液进行培养。采用Ⅷ因子免疫荧光染色及扫描电镜检查，鉴定所获内皮细胞及其纯度：内皮细胞加入含10％DMSO冷冻保存液，置于液氮进行保存，复苏后进行锥虫蓝试验，四氮唑盐(MTT)试验以及细胞凋亡的流式细胞仪检测。结果 血管内灌注消化液法可获取高纯度的内皮细胞，与未冻存细胞相比，复苏的细胞活力保持在95％以上。复苏后的内皮细胞的生长曲线与未冻存细胞的生长曲线无差异。冻存内皮细胞的凋亡率较未冻存细胞高，但无统计学意义。结论 脐静脉灌注酶消化法可获取足够数量及纯度的内皮细胞。冻存的内皮细胞复苏后仍保持较高的活力及体外增殖能力，可作为制备组织工程学血管的种子细胞来源。     

体外胰岛素样生长因子结合蛋白-1对人血管内皮细胞生长的抑制作用

目的 观察胰岛素样生长因子结合蛋白-1对人血管内皮细胞的影响及其对胰岛素样生长因子的调节作用。方法 MTT比色法观察IGFBP-1及与IGF-1预混后对脐静脉内皮细胞(ECV304细胞株)生长影响。结果 IGFBP-1对内皮细胞ECV304的生长具有抑制作用且与剂量成正比；预混后各组IGF-1促细胞生长作用明显被抑制。结论 IGFBP-1既可以直接也可以通过调节IGF-1抑制血管内皮细胞生长。     

去甲二氢愈创木酸对内皮细胞影响的形态学观察

目的：探讨去甲二氢愈创木酸（NDGA）对内皮细胞形态的影响及特点。方法：采用倒置显微镜、光镜、电镜和流式细胞仪观察分析不同浓度NDGA作用下人脐静脉内皮细胞系ECV－304细胞形态和细胞调亡峰的变化。结果：①不同浓度（50－200μmol/L）的NDGA处理ECV－304细胞24－72h后或一定浓度（100μmol/L）的NDGA处理ECV－304细胞不同时间（1－7d）后,内皮细胞由多角形变长,呈梭形,细胞稀疏,核分裂明显减少,显示细胞增殖的抑制,上述变化与NDGA的浓度和作用时间有关;②NDGA处理后,部分细胞呈现出调亡样形态学改变,以48h为明显。流式细胞仪检测也出现明显高于对照的调亡峰即亚G0峰,12h时相点最高（20.42％）。此外,处理后的细胞也有变性、坏死等病理变化,与NDGA的浓度呈正比。结论：NDGA对内皮细胞的生长和增殖有抑制,形态学初步证明也有诱导调亡等作用,这在影响血管生成中可能具有一定意义。     

血管内皮生长因子对血管内皮细胞增殖及DNA合成的影响

目的　探讨血管内皮生长因子 (VEGF)诱导血管增生性疾病中血管生成的作用机制。方法　取体外培养的人脐静脉内皮细胞系ECV 30 4细胞 ,用MTT法和3H -TdR掺入法观察VEGF对ECV 30 4细胞增殖及DNA合成的影响。结果　VEGF对ECV 30 4细胞增殖及DNA合成均有明显刺激作用 ,且均呈剂量依赖性关系。结论　VEGF可能通过刺激血管内皮细胞增殖及DNA合成 ,促进血管生成。在血管增生性疾病中可能起重要促进作用。     

重组人可溶性血管内皮细胞生长抑制因子体外抗血管内皮细胞增殖的活性

目的：研究重组人可溶性血管内皮细胞生长抑制因子（VEGI）体外抗血管内皮细胞增殖的活性。方法：MTT法检测重组人可溶性VEGI对血管内皮细胞及肿瘤细胞增殖的抑制活性。结果：在体外,重组人可溶性BEGI可强烈抑制人脐静脉内皮细胞ECV304、大鼠肺源毛细血管内皮细胞（MPCEC）及新生牛主动脉内皮细胞（BAEC）的增殖,不能报制黑色素瘤细胞B－16和小鼠成纤维细胞L－929的增殖。结论：重组人可溶性VEGI能作用于不同来源的血管内皮细胞,而对肿瘤细胞增殖无抑制作用,提示其可能通过抗肿瘤新生血管生成而发挥抗肿瘤作用。     

The Active Metabolite of Leflunomide A771726 Inhibits Corneal Neovascularization

The effects of A771726, the active metabolite of leflunomide, on experimental rat corneal neovascularization （NV） in vivo and on cultured human umbilical vein endothelial cells in vitro were studied. The corneal NV was induced by alkali burn in 40 SD rats. The rats were randomly divided into 4 groups with 10 rats in each group. Group A was treated with 0.9% sodium chloride （control group）, and group B, group C and group D were given different concentrations of A771726 eye drops （0.5%, 1.0%, 2.0% respectively） 4 times daily during days 0--28. The occurrence and development of corneal NV were observed at 4, 7, 14, 21 and 28 day after alkali burn by a slit lamp microscope. The cultured human umbilical vein endothelial cells （ECV-304） were incubated with A771726 solution at different concentrations （20, 40, 80, 160, 320 μmol/L） for 36 h. The proliferation of cells was assessed by methyl thiazolyl tetrazolium （MTT）, and the expression of proliferating cell nuclear antigen （PCNA） in cells was detected by using immunofluorescence under the laser confocal microscope. The rat model showed that the onset of corneal NV was delayed and progression of corneal NV was inhibited in the groups C and D. The corneal NV areas in groups C and D were significantly smaller than in groups A and B （P〈0.01）. No significant difference was found in corneal NV areas between groups C and group D （P〉0.05）. A771726 solution （940 μmol/L） could inhibit proliferation of human umbilical vein endothelial cells and decrease the expression of PCNA in cells significantly, A771726, as the active metabolite of leflunomide, strongly prevented corneal NV induced by alkali burn in the in vivo model, and inhibited proliferation of human umbilical vein endothelial cells in the in vitro model. Therefore, A771726 may serve as an angiogenic inhibitor in the treatment of corneal NV.     

hSulf-1基因腺病毒表达载体的构建及其对血管内皮细胞增殖、迁移能力的影响

目的 构建携带人硫酸酯酶1基因(hSulf-1)的腺病毒载体,研究其对于人脐静脉内皮细胞ECV-304增殖、迁移能力的影响。方法 通过基因操作技术将hSulf-1基因插入到腺病毒基因组中,构建重组腺病毒Ad5-hSulf1;应用蛋白质免疫印迹法检测hSulf-1蛋白在ECV-304细胞中的表达及细胞内磷酸化Akt、ERK的表达变化;MTT实验检测hSulf-1过表达对于ECV-304细胞增殖的影响;采用划痕实验研究hSulf-1过表达对于ECV-304细胞迁移的影响。结果 成功构建携带目的基因hSulf-1的腺病毒载体;免疫印迹结果表明hSulf1基因过表达会下调ECV-304细胞Akt和ERK信号分子的磷酸化水平;细胞增殖实验结果表明hSulf1基因过表达抑制了ECV-304细胞增殖,感染复数为50、100时细胞存活率下降至(68.49±0.05)%以及(67.78±0.06)%(P<0.05);划痕实验结果表明hSulf1基因过表达能够抑制细胞的迁移,相比于对照组细胞迁移能力减弱(P<0.01)。结论 重组腺病毒Ad5-hSulf1介导的hSulf-1基因在ECV-304细胞中的过表达明显抑制细胞增殖及迁移,为hSulf-1用于肿瘤及血管生长相关疾病的基因治疗奠定了基础。     

KDR介导的双自杀基因重组腺病毒对ECV304细胞增殖活性、细胞周期及凋亡的影响

目的 探讨腺病毒介导KDR启动子驱动的融合基因体系对人脐血管内皮细胞株ECV30的增殖活性、细胞周期及凋亡的影响.方法 以重组腺病毒AdEasy-KDR-CDglyTK体外感染表达KDR的ECV30细胞株和对照组不表达KDR的LS17T细胞株,并给予不同浓度的前药GCV(ganciclovir)和/或5-FC(5-fluorocytosine),观察该体系对ECV30细胞的杀伤效应及其旁观者效应;并以流式细胞仪检测细胞周期的变化,电镜观察细胞的病变.结果 重组腺病毒对ECV30细胞及对照组LS17T细胞的感染率相似,其感染率随腺病毒滴度的递增而增加,当MOI为200时,所有细胞株均达约100%感染.以MOI为100的重组体分别感染各细胞株表现出对前药的不同敏感性:表达KDR的ECV30细胞对前药的具有较高的敏感性,与前者相比,不表达KDR的LS17T细胞对前药不敏感(P均<0.001).融合基因的疗效优于任一单自杀基因(P均<0.001).将感染腺病毒的细胞与未感染细胞以不同混合培养,观察到该体系明显的旁观者效应.流式细胞术检测表明该体系抑制ECV30细胞DNA的合成,表现为S期细胞比率增多及G1期细胞减少(P均<0.001).同时,电镜下可见ECV30有凋亡和坏死改变.结论 KDR基因启动子可调控融合基因体系选择性杀伤人血管内皮细胞,其机制与细胞周期阻滞、凋亡及坏死有关.     

簇分化抗原74基因转染对人脐静脉内皮细胞ECV304特性的影响

目的 探讨簇分化抗原74(cluster of differentiation 74,CD74)基因在人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cell,HUVEC)的转染条件和CD74基因转染对细胞特性及功能的影响,为深入研究基于调节CD74表达的生物治疗打下基础.方法 ①将...     

牙龈卟啉单胞菌对脐静脉血管内皮细胞增殖的影响

目的：观察牙龈卟啉单胞菌（Pg)对人脐静脉血管内皮细胞（HUVEC）增殖的影响，探讨Pg对牙龈血管内皮细胞的毒性作用。方法：以厌氧袋法培养Pg，原代培养HUVEC，四甲基偶氮唑盐微量酶反应比色法（MTT）观察HUVEC的增殖状态。结果：活的和灭活的Pg都剂量依赖性地抑制HUVEC的增殖，活的Pg作用比灭活的Pg更为强烈，而Pg毒力株W83和非毒力株ATCC33277对HUVEC增殖的影响无显著差异。结论：Pg可能通过损伤牙龈组织的血管内皮细胞加重局部的炎性反应，可能是Pg诱导牙周组织破坏的病理机制之一。