人单纯疱疹病毒1型VP22介导的microdystrophin重组腺病毒的构建及其蛋白转导特性

目的构建含有人单纯疱疹病毒1型(HSV-1)VP22与人microdystrophin基因融合的重组腺病毒,体外感染成肌细胞C2C12,探讨VP22对microdystrophin基因在成肌细胞中的蛋白转导特性。方法设计引物,从质粒pSIN-rep5-VP22中扩增VP22全长基因,然后将VP22基因定向插入腺病毒穿梭质粒pShuttle-CMV,获得重组质粒pCMV-VP22;再用NotⅠ酶切含microdystrophin基因的pBSK-micro质粒,获得microdystrophin基因,片段回收后定向插入重组质粒pCMV-VP22,获得重组质粒pCMV-VP22-MICDYS。PmeI线性化重组质粒pCMV-VP22-MICDYS,去磷酸化后回收与腺病毒骨架质粒pAdeasy-1共电转化BJ5183感受态细胞。同源重组后用选择性培养基筛选阳性克隆,提取质粒,脂质体介导转染293细胞,通过观察293细胞病变及PCR扩增目的基因等方法鉴定重组腺病毒。将含VP22-microdystrophin及microdystrophin的病毒上清分别转染成肌细胞C2C12,通过RT-PCR、Western-blot和免疫组织化学方法检测microdys-trophin的mRNA及蛋白表达。结果成功构建了含有VP22-microdystrophin基因的重组腺病毒,体外感染成肌细胞C2C12,Western-blot及免疫组织化学检测显示VP22显著提高了microdystrophin蛋白在C2C12细胞中的表达。结论含有VP22-microdystrophin基因的重组腺病毒载体的构建及VP22介导microdystrophin在成肌细胞C2C12间的转导,为利用此病毒进行假肥大型肌营养不良症疾病的治疗研究奠定了基础。     

人细小病毒B19 XA株VP1蛋白原核表达及初步鉴定

目的:通过DNA 重组技术,构建B19 病毒XA株VP1全长基因表达载体, 诱导重组VP1融合蛋白表达. 方法:自B19病毒感染患者血清中提取病毒DNA为模板,用PCR法扩增编码VP1蛋白的全长基因片段,以pET28(a)为表达载体,构建重组表达质粒pET28(a)-VP1,转化E. coli. BL21(DE3),获得重组工程菌株.经IPTG诱导培养获得高效表达的VP1融合蛋白,SDS-PAGE、免疫印迹鉴定表达产物;并以该重组融合蛋白为抗原,免疫家兔,ELISA法检测所获抗体效价. 结果:①获得了含重组表达质粒pET28(a)-VP1的正相阳性工程菌株,经IPTG诱导能高效表达VP1融合蛋白.②经ELISA法检测抗VP1多克隆抗体效价为1: 12 800. 结论:重组工程菌可表达VP1融合蛋白,且该蛋白具有良好的免疫原性,对诊断试剂制备及疫苗研制具有重要意义.     

铜绿假单胞菌OprH基因在大肠埃希菌BL21(DE3)中的表达

目的构建铜绿假单胞菌重组质粒pGEX-OprH,研究其在大肠埃希菌BL21(DE3)中的表达。方法以铜绿假单胞菌PAO1标准株双链DNA为模板,通过PCR扩增OprH基因。经酶切后与载体pGEX-1λT进行连接,构建重组质粒pGEX-OprH,转化E.coli BL21(DE3)感受态细胞,异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导表达后用SDS-PAGE和Western blot对表达产物进行分析和鉴定。结果 PCR扩增出660 bp的OprH编码基因;重组质粒经双酶切和PCR证实OprH基因成功插入pGEX-1λT中;SDS-PAGE电泳发现表达产物相对分子质量约为47 000 Mr,与前期预测结果一致,大肠埃希菌BL21(DE3)表达蛋白为菌体量的22%;免疫印渍表明Pa抗原免疫的小鼠血清能特异识别47 000 Mr重组蛋白。结论铜绿假单胞菌重组质粒pGEX-OprH在E.coli BL21(DE3)中高效融合表达,表达的融合蛋白具有抗原特异性。     

铜绿假单胞菌外膜蛋白OprF和OprH基因扩增、融合、克隆及原核表达

目的 在大肠杆菌中串联表达铜绿假单胞菌外膜蛋白OprF和OprH，获得重组融合蛋白OprF／H，为抗铜绿假单胞菌的疫苗研究打下基础。方法 从铜绿假单胞菌中提取基因组DNA，设计PCR引物扩增出OprF和OprH基因，扩增片段经过酶切、连接和PCR扩增后，割胶回收PCR产物并将其克隆至克隆质粒，测序后构建表达质粒pGEX-F／H，并转化大肠杆菌BL21。结果 重组表达质粒经IPTG诱导后表达融合外膜蛋白OprF／H。结论 成功构建融合外膜蛋白OprF／H的原核表达质粒并在大肠杆菌中表达成功。     

细胞穿透肽VP22对抑癌蛋白PTEN体外抗肿瘤作用影响的研究

目的 构建表达细胞穿透肽融合蛋白第10号染色体同源缺失性磷酸酶-张力蛋白基因(PTEN)-VP22的真核表达质粒,在食管癌细胞Eca109细胞中验证细胞穿透肽VP22能否增强抑癌蛋白PTEN体外抗肿瘤作用.方法 通过本实验室前期构建成功的重组真核表达质粒pcDNA3-PTEN、pcDNA3-PTEN-VP22和pcDNA3-VP22,转染至Eca109细胞,以pcDNA3空质粒转染作为阴性对照,细胞免疫荧光法检测各组PTEN蛋白表达情况,Western blot法检测各组PTEN蛋白和免抗磷酸化-Akt(p-Akt)蛋白的表达水平,CCK-8法检测细胞增殖活性,流式细胞术测细胞凋亡率.结果 与pcDNA3相比,pcDNA3-PTEN、pcD-NA3-PTEN-VP22都能抑制Eca109细胞增殖(P＜0.05),促进Eca109细胞凋亡(P＜0.05);pcDNA3-PTEN-VP22抗肿瘤活性显著高于pcDNA3-PTEN(P＜0.05),pcDNA3-PTEN-VP22的p-Akt表达显著低于pcDNA3-PTEN(P＜0.05).结论 细胞穿透肽VP22能增强抑癌蛋白PTEN对Eca109细胞体外抗肿瘤活性,其机制可能与其下调p-Akt表达水平有关.     

重组人β防御素4的原核表达、纯化及抗铜绿假单胞菌活性初探

目的制备原核表达的重组人β防御素4(human beta defensin 4,HBD4),初步探讨其对铜绿假单胞菌的体外抗菌活性.方法将编码HBD4的DNA片段连接到大肠杆菌表达载体pET42a中,构建好的表达质粒pET42a-HBD4转化到表达菌株BL21(DE3)中,0.5 mmol/L IPTG诱导表达4 h,亲和纯化融合蛋白后经Western blot鉴定,再以肠激酶酶切融合蛋白,镍柱亲和层析分离HBD4;采用打孔法初测其抗铜绿假单胞菌活性,并用微量稀释法测定HBD4与3种抗生素的最小抑菌浓度(MIC)和最小杀菌浓度(MBC),比较其抗铜绿假单胞菌活性并异.结果 GST-HBD4在大肠杆菌中以可溶形式成功表达,纯化的重组HBD4体外对铜绿假单胞菌有抗菌活性,其效能略低于亚胺培南,而高于哌拉和环丙沙星.结论采用基因工程技术成功表达了重组HBD4,其对铜绿假单胞菌有较强的杀菌活性,具有烧伤创面感染治疗的应用前景.     

铜绿假单胞菌外膜蛋白OprF原核表达载体的构建及表达

目的 克隆铜绿假单胞菌外膜蛋白OprF基因,构建原核表达载体并鉴定表达。方法 从铜绿假单胞菌中提取基因组DNA,PCR扩增OprF羧基端,克隆至原核表达载体pET28b中,构建重组表达载体pET28b-F。重组质粒经酶切和序列测定后,转化E.coli BL21,异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）诱导表达,进行SDS-PAGE检测。经Ni-NTA亲和层析柱纯化后OprF蛋白免疫BALB/C小鼠,通过杂交瘤方法制备相应单克隆抗体并用ELISA方法进行鉴定。结果 pET28b-F原核表达载体构建成功。重组表达质粒经IPTG诱导后表达外膜蛋白OprF。获得4株高分泌型特异性单克隆细胞株,其中2株单克隆抗体可用于制备双抗体夹心法ELISA试剂盒,检测铜绿假单胞菌。结论 成功克隆铜绿假单胞菌外膜蛋白OprF羧基端基因片段并在大肠杆菌中进行表达,筛选出特异性抗OprF单克隆抗体。     

铜绿假单胞菌噬菌体PaP1内溶素基因克隆、表达及活性分析

目的 构建铜绿假单胞菌噬菌体内溶素重组原核表达载体,检测重组蛋白的酶学活性及抑菌活性.方法 利用重组技术将铜绿假单胞菌裂解性噬菌体PaP1内溶素基因构建到表达载体pQE31中,并在大肠杆菌M15(pREP4)中诱导表达,通过非变性方法纯化重组融合蛋白,利用酶潜电泳、抑菌实验等技术检测酶学活性及抑菌活性.结果 酶谱电泳方法结果显示重组融合蛋白对铜绿假单胞菌细胞壁肽聚糖有降解作用,抑菌活性检测结果显示重组融合蛋白对金黄色葡萄球菌有一定的抑菌效果.结论 该研究从实验方面证实了噬菌体PaP1内溶素基因的生物学功能.     

铜绿假单胞菌Quorum-Sensing系统中rhlR基因的克隆表达及其免疫保护性研究

目的研究铜绿假单胞菌rhlR表达产物的分子生物学特性,以及对小鼠的免疫保护作用。方法以铜绿假单胞菌标准株PAO1的基因组DNA为模板,PCR方法扩增rhlR基因。利用pGEX4T-1载体构建rhlR-pGEX4T-1重组质粒,在大肠杆菌BL21(DE3)中诱导表达,并用免疫印迹验证。同时用纯化的重组蛋白免疫小鼠,菌落计数法检测免疫组和对照组鼠肺对铜绿假单胞菌的清除率。结果rhlR的全基因序列为726bp,经序列分析和同源性比较,与GenBank中的rhlR基因(登录号:AE004768)完全一致。大肠杆菌BL21(DE3)转化重组质粒rhlR-pGEX4T-1后,经IPTG诱导和SDS-PAGE分析,表达的融合蛋白质相对分子质量为54×103,其中RhlR蛋白为27×103。体内实验中,免疫小鼠肺部对铜绿假单胞菌的清除率与未经免疫的正常组比较,差异有统计学意义(P<0.05)。结论构建的rhlR-pGEX4T-1重组质粒能够在大肠杆菌BL21(DE3)中成功地表达出具有生物学活性的RhlR蛋白。重组蛋白对小鼠表现出一定的保护作用。     

铜绿假单胞菌分泌蛋白Pec1抑制肺巨噬细胞吞噬功能的初步研究

目的：探讨铜绿假单胞菌分泌蛋白Pec1对小鼠肺泡巨噬细胞株MH?S吞噬功能的影响。方法：通过PCR扩增、质粒构建、原核表达及蛋白纯化等过程制备重组蛋白Pec1;CCK?8法检测Pec1蛋白对MH?S细胞增殖的影响;中性红染色检测MH?S细胞的吞噬功能;荧光显微镜观察MH?S细胞对铜绿假单胞菌标准菌株PAO1灭活菌的吞噬能力。结果：成功构建重组质粒pET?30a?pec1,原核表达并纯化后得到重组蛋白Pec1,其分子量为30.5 kDa。Pec1对MH?S细胞的增殖有抑制作用,Pec1浓度越高,对细胞增殖的抑制作用越明显;Pec1能减少MH?S细胞对中性红的内吞,抑制MH?S细胞对铜绿假单胞菌灭活菌的吞噬作用。结论：铜绿假单胞菌分泌蛋白Pec1对MH?S细胞的吞噬功能有抑制作用。     

SARS冠状病毒核蛋白与mGM-CSF融合质粒的构建及表达

目的构建SARS冠状病毒(SARS—COV)核蛋白(N)与mGM—CSF的融合真核表达质粒,借助mGM—CSF的免疫佐剂作用,提高SARSDNA疫苗的免疫效果。方法采用PCR方法扩增N和mGM—CSF基因片段,用分子克隆和基因融合的方法将目的片段定向插入真核表达载体中,构建融合表达质粒pVAX 1／N—mGM—CSF,并以融合质粒转染细胞,用免疫细胞化学和Western Blot的方法鉴定融合质粒在体外的表达。结果经酶切鉴定及DNA序列测定证实融合质粒构建正确,细胞转染实验表明,融合质粒能在COS-7细胞中表达。结论成功构建SARS—COV核蛋白与mGM—CSF的融合表达质粒,重组质粒能在真核细胞内表达。     

婴儿利什曼原虫磷酸烯醇丙酮酸羧基酶优势表位基因的分子克隆与表达

目的 基于前期分析并选取的婴儿利什曼原虫PEPCK的优势表位基因,构建相应重组原核表达载体以获得重组蛋白,构建相应重组真核表达载体并验证真核载体在NIH3T3细胞中的表达,为后续动物的免疫和感染实验备下基础。方法 根据PEPCK优势表位基因序列,经PCR反应及酶切连接构建重组原核与真核表达质粒pET32a-PEPCK和pVAX1-EPEPCK并分别转染至E. coli和NIH3T3细胞中进行表达。采用SDS-PAGE电泳和Western Blot鉴定原核重组质粒在大肠杆菌中的表达和原核表达蛋白被镍柱纯化后的情况,采用免疫荧光实验验证真核重组质粒在细胞中的表达。结果 重组原核与真核载体的正确测序结果表明重组载体构建成功。SDS-PAGE电泳和Western Blot的结果显示,大肠杆菌中表达的原核重组蛋白以及纯化后的蛋白在48.08 kD处存在条带,转染了真核重组载体的NIH3T3细胞的免疫荧光结果呈阳性。结论 成功构建了PEPCK优势表位基因的重组原核和真核表达载体:pET32a-PEPCK和pVAX1-EPEPCK,成功表达相应的重组蛋白并纯化并验证了pVAX1-EPEPCK在NIH3T3细胞中的表达,为后续DNA疫苗初次免疫和蛋白疫苗加强免疫的动物实验备下基础。     

人同种异体移植炎症因子-1的基因克隆及其在小鼠成纤维细胞中的表达

目的构建人同种异体移植炎症因子-1(allograft inflammatory factor-1,AIF-1)基因的真核表达载体并在小鼠成纤维细胞系(NIH3T3)中表达,为进一步研究AIF-1蛋白的功能奠定基础。方法利用基因重组技术,构建带有AIF-1基因的2种重组真核表达载体:pcDNA3.1(-)/AIF-1与pEGFP-C1/AIF-1。利用脂质体法将2种重组质粒分别转染NIH3T3细胞,用荧光倒置显微镜及Western blot方法观察及鉴定AIF-1在细胞中的稳定表达及瞬时表达。结果酶切分析及DNA序列测定证实,AIF-1基因片段被分别克隆入真核表达载体pcDNA3.1(-)与pEGFP-C1。荧光显微镜观察到NIH3T3细胞中有绿色荧光分布。Western blot结果表明,转染重组质粒的NIH3T3细胞中,AIF-1表达量明显增高。结论成功构建了2种重组真核表达载体:pcDNA3.1(-)/AIF-1与pEGFP-C1/AIF-1,经转染NIH3T3细胞株获得了AIF-1蛋白的瞬时表达及稳定表达。     

人细胞周期蛋白D1及细胞周期蛋白激酶CDK4的原核表达及鉴定

【目的】构建表达人细胞周期蛋白D1及细胞周期蛋白激酶CDK4融合蛋白的重组体。【方法】用RT-PCR从HL-60细胞中扩增细胞周期蛋白D1及CDK4基因片段,克隆到pGEM-Teasy载体上。测序鉴定后切下相应的片段,连接到表达载体pET-22b(+)上,重组质粒转化大肠杆菌BL21(DL3),使之高效表达融合蛋白细胞周期蛋白D1及CDK4。SDS-PAGE电泳及Westernblotting鉴定表达蛋白。【结果】用PCR扩增得到了正确的目的基因片段并构建成pET-cyclinD1和pET-CDK4两个原核表达载体。将其转化大肠杆菌,Westernblot检测证实了转化的大肠杆菌能表达细胞周期蛋白D1及CDK4融合蛋白。【结论】本研究成功构建了细胞周期蛋白D1及CDK4原核表达载体,后两者在细胞内能正确表达细胞周期蛋白D1及CDK4融合蛋白。     

新型基因佐剂SPreS2真核表达载体的构建及其瞬时表达

目的 构建重组真核表达载体pVAX1-SPreS2作为基因佐剂,用以增强或调节弓形虫DNA疫苗的体液及细胞免疫效果。方法 采用重叠延伸PCR技术,扩增乙肝病毒表面抗原S和PreS2基因,引入编码GSGSGS柔性多肽序列作为接头拼接S和PreS2基因,构建重组克隆载体pMD18T-SPreS2和重组真核表达载体pVAX1-SPreS2,分别进行PCR、酶切和测序鉴定;脂质体法将重组载体pVAX1 SPreS2转染人成纤维细胞,建立体外真核细胞瞬时表达系统,SDS-PAGE和Western blot检测重组载体转染HFF细胞瞬时表达状况及其表达产物的免疫活性。结果 PCR、酶切、测序结果表明,重组克隆载体pMD18T SPreS2和重组真核表达载体pVAX1 SPreS2正确构建,融合基因SPreS2在真核细胞中可以瞬时表达,其表达产物具有一定的免疫活性。结论 成功构建重组真核表达载体pVAX1-SPreS2,为增强或调节弓形虫DNA疫苗免疫效果提供一种新型基因佐剂。     

真核表达质粒pVAX1-Der p 1的构建及在真核细胞中的表达

目的:构建真核表达质粒pVAX1-Der p 1,检测质粒编码的重组蛋白在真核细胞293T中的表达,为进一步的动物实验打下基础。方法:分离屋尘螨总RNA,根据GenBank已公布的Der p 1核酸序列设计引物,PCR扩增Der p 1编码基因,以其全长为目的基因,定向克隆至真核表达载体pVAX1,将其转化大肠杆菌DH...     

婴儿利什曼原虫Pepck和Gp63优势表位的真核与原核重组载体的构建与表达

目的 选取婴儿利什曼原虫的Pepck和Gp63的优势表位基因,构建Pepck-Gp63二联优势表位的原核与真核重组表达载体并表达蛋白.方法 用计算机分析预测磷酸烯醇丙酮酸羧基酶(phosphoenolpyruvate carboxylase,PEPCK)的二级结构及HLA表位,筛选出优势表位.根据本实验室之前对表面蛋白...     

柯萨奇病毒A16型VP1~VP4基因克隆及其表达产物的抗原相关性分析

目的克隆并表达柯萨奇病毒A16型VP1~VP4蛋白基因,初步分析其抗原相关性。方法抽提病毒RNA,经RT-PCR方法
分别扩增出VP1~VP4蛋白基因片段,经克隆后,在QIA表达系统中表达,表达产物经8mol/L尿素洗涤及镍柱亲和层析纯化后,
用柯萨奇病毒A16型病毒免疫兔血清及肠道病毒71型病毒免疫兔血清对重组蛋白进行Western blotting及ELISA分析其抗原
相关性及交叉反应性。结果成功构建的重组质粒pQE30a/VP1~VP4并经IPTG诱导,重组蛋白VP1~VP4高效表达并纯化成
功,经Western blotting及ELISA证实重组蛋白VP1~VP4可以被CVA16免疫兔血清特异识别,部分与肠道病毒71型免疫血清存
在交叉反应。结论在大肠杆菌M15中高效表达出柯萨奇病毒A16型VP1~VP4蛋白,经纯化产物具有较强的抗原反应性。
     

HBsAg和B19 VP2复合抗原的基因克隆及在大肠杆菌中的表达

目的构建乙肝表面抗原(HBsAg)-人微小病毒B19VP2蛋白的原核高效表达系统.方法用PCR扩增HBsAg基因及B19病毒VP2基因,分别与pGEM-T重组,构建出pGEM-T-HBs及pGEM-T-VP2并测序分析;测序证实序列正确后,将pGEM-T-HBs中的HBs基因克隆入pGEX-5X-1表达载体中,得到pGEX-5X-1-HBs;再将pGEM-T-VP2中的VP2基因克隆入pGEX-5X-1-HBs中,得到pGEX-5X-1-HBs-VP2后转化至BL21(DE3)宿主菌中,并以IPTG诱导表达融合蛋白,以Western-blot鉴定.结果pGEX-5X-1-HBs-VP2可在大肠杆菌BL21中高效表达,表达产物经Western-blot鉴定具有HBsAg及B19 VP2的双重抗原性.结论成功构建pGEX-5X-1-HBs-VP2原核表达载体,且其表达的重组蛋白具有良好的抗原性,为HBV和B19病毒重组多价疫苗的研究奠定了基础.