慢性缺氧致大鼠右心室心肌细胞凋亡及其机制研究

目的：通过建立大鼠慢性缺氧心肌肥大模型,探讨慢性缺氧致大鼠心肌细胞凋亡的发生规律及其机制。方法: 将大鼠随机分为慢性缺氧组和正常对照组,每组30只,慢性缺氧组置于氧浓度为(10.0±0.5)％的大型玻璃舱中,分别持续缺氧14、21、28 d,分别于第14、21、28 d处死大鼠,取心脏称重,留右心室,进行形态学观察,分析心肌细胞凋亡形态及计量,检测肌球蛋白β重链(β-MHC)、原癌基因B淋巴细胞瘤-2（bcl-2）、Bad 等mRNA及Bcl-2、Bad蛋白的表达水平。结果: (1)慢性缺氧14、21、28 d组大鼠右心室/（左心室+室间隔）［RV/(LV+S)］、右心室/体重（RV/BW）比值及右心室β-MHC mRNA和蛋白表达均明显高于正常对照组(均Ｐ<0.01),并且随时间延长而增高(均Ｐ<0.01)。(2) 慢性缺氧心肌细胞凋亡指数14、21、28 d组大鼠均明显高于正常对照组(均Ｐ<0.01),且随着时间的延长而增加(均Ｐ<0.01)。（3）慢性缺氧14、21、28 d组大鼠右心室bcl-2 mRNA表达和Bcl-2蛋白表达均明显低于正常对照组(均Ｐ<0.05),缺氧28 d组bcl-2 mRNA表达和Bcl-2蛋白表达较缺氧14 d组显著降低 (均Ｐ<0.05)。慢性缺氧14、21、28 d组大鼠右心室bad mRNA表达和Bad蛋白表达与正常对照组比较无明显改变 (均Ｐ>0.05)。（4）慢性缺氧14、21、28 d组大鼠右心室bcl-2/bad比值均明显低于正常对照组(均Ｐ<0.05),缺氧28 d组bcl-2/bad比值较缺氧14 d组显著降低 (Ｐ<0.05)。结论: 慢性缺氧可以诱导大鼠右心室心肌细胞凋亡和心肌肥大,且大鼠右心室心肌细胞凋亡和心肌肥大程度随着缺氧时间的延长而增加。慢性缺氧通过抑制大鼠右心室心肌细胞抗凋亡基因bcl-2表达,使bcl-2/bad比值下调,打破原有的平衡,导致心肌细胞凋亡。     

肥大心肌细胞缺氧复氧损伤特点及干预能量代谢的作用

目的：探讨肥大心肌细胞缺氧复氧损伤与能量代谢途径转换的关系。 方法: 应用血管紧张素Ⅱ (AngⅡ, 0.1 μmol/L)+去甲肾上腺素（NE 1 μmol/L）诱导培养大鼠心肌细胞肥大，以同位素液闪计数法测定葡萄糖有氧氧化率（GOR）、葡萄糖酵解率（GLR）和脂肪酸有氧氧化率（FOR），TUNEL法测定细胞凋亡。 结果: (1)常氧培养时，肥大心肌细胞的葡萄糖氧化率（GOR）、糖酵解率（GLR）均高于正常心肌细胞，而脂肪酸氧化率（FOR）低于正常心肌细胞，但与细胞凋亡率一样，与正常心肌细胞比较无显著差异。(2)肥大心肌细胞缺氧6 h后细胞凋亡率显著高于缺氧前，复氧后不仅细胞凋亡更显著高于缺氧前，还出现了细胞坏死。(3)正常心肌细胞和肥大心肌细胞缺氧后GLR无明显变化，GOR、FOR均低于缺氧前，缺氧6 h时出现显著差异，但肥大心肌细胞GOR在缺氧2 h时即显著低于缺氧前。缺氧复氧后，正常心肌细胞和肥大心肌细胞GOR均低于对应单纯缺氧时间组，而GLR和FOR轻度高于对应单纯缺氧2 h组，在肥大心肌细胞均显著高于对应单纯缺氧时间组，并随缺氧时间延长更明显。(4)二氯乙酸（DCA）和曲美他嗪（TMZ）预处理后的肥大心肌细胞缺氧复氧后的GOR显著高于对应的无干预肥大心肌细胞组，GLR、FOR和细胞凋亡率均显著低于无干预肥大心肌细胞组。 结论: 肥大心肌细胞更易于受到缺氧复氧刺激的损伤，活化糖代谢可部分抑制这种损伤。     

Fas在缺氧心肌细胞中的表达及其意义

目的:利用体外培养心肌细胞缺氧模型,观察不同缺氧时间心肌细胞凋亡的发生及与Fas表达的关系.方法:原代培养乳鼠心肌细胞,随机分为对照组、缺氧1 h、2 h、3 h、4 h组,构建心肌细胞缺氧模型,应用膜联蛋白-Ⅴ与溴化丙啶双染法与Hoechst 33258染色法检测缺氧心肌细胞凋亡,应用免疫组化法检测Fas在心肌细胞上表达.应用West-ern blot检测Fas在心肌细胞表达.结果:膜联蛋白-Ⅴ与溴化丙啶双染法检测发现对照组、缺氧1 h、2 h、3 h和4 h组细胞凋亡率分别为(0.20±0.15)%,(4.32±0.56)%,(6.32±1.22)%,(8.32±1.19)%,(5.01±1.56)%(P<0.05);Hoechst 33258染色显示,与对照组比较,缺氧1 h、2 h、3 h和4 h组细胞的凋亡率明显升高;免疫组化与对照组比较,缺氧1 h、2 h、3 h、4 h组阳性细胞数明显升高(P<0.05),缺氧3 h组最高,缺氧4 h组略下降;Western blot检测结果提示对照组与4 h组Fas表达减弱,缺氧1 h、2 h和3 h组Fas表达上调.结论:缺氧可诱导心肌细胞的凋亡,缺氧时间延长引起凋亡率逐渐上升,至4 h时凋亡率开始下降,Fas表达量的变化趋势与凋亡率的变化趋势一致,Fas可能介导了缺氧诱导的心肌细胞凋亡.     

内质网应激在Bim介导缺氧致心肌细胞凋亡中的作用

 目的：探讨内质网应激在Bim介导缺氧致心肌细胞凋亡中的作用。方法：在体外原代培养出生1~3 d大鼠心肌细胞,并用抗α-横纹肌肌动蛋白免疫组化法进行鉴定。设计并化学合成3对靶向bim的siRNA,用脂质体法将siRNA转染心肌细胞,筛选沉默效率最高的siRNA。实验分组：（1）空白对照组;（2）缺氧组;（3）缺氧+脂质体组;(4)缺氧+阴性对照siRNA组;(5)缺氧+Bim-siRNA组。MTT法观察细胞活性;流式细胞术检测细胞凋亡率及细胞内钙离子浓度变化情况;Western blotting检测内质网应激标志分子caspase-12和三磷酸肌醇（IP3）的表达情况。结果：免疫组化鉴定证实大鼠心肌细胞原代培养成功。在荧光显微镜下,转染了阴性对照siRNA组的细胞中观察到绿色荧光,即转染成功;Western blotting 结果显示,Bim-siRNA转染均能有效降低Bim蛋白的表达,其中第2对沉默效率最高,达到86.73%。缺氧损伤导致心肌细胞活性明显下降（P<005）,转染Bim-siRNA后细胞活性较阴性对照组升高。缺氧细胞凋亡率较对照组明显增加（P<0.01）,细胞内钙离子浓度明显增高,而沉默bim的表达能降低细胞凋亡率和细胞内钙离子浓度。缺氧导致内质网应激标志分子caspase-12和IP3表达较空白对照组明显上调（均P<005）,而抑制Bim表达后caspase-12和IP3表达明显降低。结论：沉默bim的表达能有效抑制缺氧导致心肌细胞凋亡的作用,内质网应激标志分子caspase-12和IP3可能参与了Bim介导缺氧致心肌细胞凋亡的过程。这有望为临床心肌缺血缺氧损伤的治疗提供新思路。     

人白细胞介素2基因修饰诱导的肥大细胞瘤细胞广泛调亡

为研究基因修饰的Ｐ８１５小鼠肥大细胞瘤细胞在肿瘤排斥中的作用，我们将人白细胞介－２基因修饰的Ｐ８１５小鼠肥大细胞瘤细胞接种ＤＢＡ／２小鼠，观察到动物成瘤的伏期延长，肿瘤的生长速度延缓，已形成的肿瘤可逐渐缩小并全部消退。     

胰岛素对新生大鼠缺氧/复氧心肌细胞凋亡的影响

目的:探讨胰岛素在新生大鼠缺氧/复氧心肌细胞损伤中对细胞凋亡的影响。方法:通过给原代培养乳鼠心室肌细胞行缺氧2 h/复氧4 h,建立缺氧/复氧(Anoxia/Reoxygenation)心肌细胞损伤模型。将培养心肌细胞随机分为:正常对照组(CON)、缺氧/复氧组(A/R)、缺氧/复氧+胰岛素组(I/R+INS)。于复氧4 h后,利用2,4二硝基苯肼显色法检测乳酸脱氢酶(LDH)活性,硫代巴比妥酸显色法检测丙二醛(MDA)含量,原位末端标记法(TINEL)和DNA梯带法(DNA Ladder)检测细胞凋亡,并比较各组间差异。结果:与A/R组相比,A/R+INS可明显降低MDA、LDH值(P<0.01),抑制心肌细胞凋亡(P<0.01)。结论:胰岛素具有减少新生大鼠缺氧/复氧心肌细胞损伤作用,其作用机制与抑制细胞凋亡作用有关。     

缺氧导致体外培养乳鼠心肌细胞凋亡的研究

目的:通过体外培养乳鼠心肌细胞模拟缺氧模型,探讨心肌细胞缺氧损伤时是否发生心肌细胞凋亡。方法:取(1~3)d新生SD乳鼠心肌进行心肌细胞培养,采用模拟缺氧模型,通过HE染色、流式细胞仪等手段观察检测细胞凋亡的改变。结果:在本实验心肌细胞缺氧模型中,HE染色可见凋亡细胞体积变小,胞核浓缩,胞质嗜酸性增强。流式细胞仪检测出明显的凋亡峰。结论:本实验培养乳鼠心肌细胞缺氧模型可导致心肌细胞凋亡,可通过HE染色观察凋亡细胞形态学的变化,流式细胞术检测细胞DNA含量而对凋亡细胞进行定量分析。     

参麦注射液对缺氧心肌细胞凋亡的影响

目的： 观察参麦注射液对体外培养的心肌细胞缺氧后细胞凋亡的影响，并探讨其可能机制。方法： 分离乳鼠心肌细胞，进行离体培养。用95%N2与5%CO2混合气体造成缺氧环境，建立体外细胞缺氧模型，使细胞分别缺氧6 h和12 h。参麦注射液治疗组于缺氧处理前24 h至缺氧结束加入5 mL/L参麦注射液进行干预。首先通过Annexin V-FITC/PI双染法，流式细胞仪检测细胞凋亡情况。继而使用MTT法观察心肌细胞线粒体活性的改变，并应用激光共聚焦显微镜观察线粒体膜电位，荧光酶标仪检测胞浆内caspase3、7的活性。结果： 随着缺氧时间的延长凋亡细胞增多，参麦注射液能增强缺氧细胞的线粒体活性，维持线粒体膜电位，抑制caspase3、7的激活，从而减少凋亡细胞（P<0.01）。结论： 缺氧可以通过线粒体途径诱发心肌细胞的凋亡，参麦注射液能减少缺氧后细胞凋亡的发生，其机制与维持线粒体膜电位稳定，抑制caspase酶激活，即抑制凋亡的线粒体途径有关。     

缺氧预适应抑制缺氧/复氧诱导心肌细胞凋亡的作用及机制

目的：研究缺氧预适应（HP）对缺氧复氧（H/R）诱导新生大鼠心肌细胞凋亡的影响及其作用机制。方法： 体外培养新生大鼠心肌细胞，分3组：正常对照组、HP+ H/R组和H/R组，吖啶橙（AO）染色法观察心肌细胞凋亡形态学特征，流式细胞术检测心肌细胞凋亡率，比色法检测心肌细胞caspase-3的活性，免疫组织化学法结合计算机图像分析检测心肌细胞Bcl-2蛋白的表达。结果： 心肌细胞H/R损伤后，AO染色可见典型凋亡细胞，流式细胞仪检测其凋亡率为(29.7±5.4)%，HP可显著降低心肌细胞凋亡率至(7.8±1.3)%（P＜0.01）。H/R组心肌细胞caspase-3的相对活性为5.9±0.8，HP+H/R组心肌细胞caspase-3的相对活性为2.6±0.5，显著低于H/R组（P＜0.01）。Bcl-2在正常心肌细胞即有表达，其阳性染色吸光度值为119.4±7.1，H/R组为99.6±5.0，显著低于正常组（P＜0.01），HP+H/R组为126.5±6.2，显著高于H/R组（P＜0.01）。结论： HP可通过增加心肌细胞Bcl-2的表达、降低caspase-3活性而抑制H/R诱导的心肌细胞凋亡，发挥心肌细胞保护作用。     

地塞米松诱导NK-92MI细胞株凋亡机制的研究

目的:探讨地塞米松(DEX)对NK-92MI细胞株杀伤活性及凋亡的影响及机制.方法:用不同浓度的DEX处理NK-92MI细胞:采用MTT比色法测定NK-92MI细胞的增殖率和对靶细胞的杀伤作用;流式细胞术检测NK-92MI细胞凋亡率;RT-PCR 检测凋亡相关基因Bcl-2、Bax的表达.结果:浓度为1×10-8mol/L至1×10-3mol/L的DEX作用NK-92MI细胞24、48、72小时后,对其增殖均有明显抑制作用(P<0.05);效靶比为5∶1时,1×10-8mol/L至1×10-3mol/L的DEX对NK-92MI细胞杀伤活性均有抑制作用,与对照组相比有显著性差异(P＜0.05);DEX可诱导NK-92MI细胞发生凋亡且凋亡诱导作用呈浓度时间依赖性;与对照组相比,DEX组Bcl-2基因表达降低(P＜0.05),Bax基因表达增高(P＜0.01).结论:DEX可以抑制NK-92MI细胞增殖并且降低其杀伤活性,机制可能是通过诱导NK-92MI细胞凋亡,而后者与Bax/Bcl-2基因表达增高有关.     

小柴胡汤对免疫抑制小鼠脾细胞凋亡的影响及其机制

目的探讨小柴胡汤对免疫抑制小鼠脾细胞凋亡的影响及其机制。方法每日给予正常小鼠及肌肉注射环磷酰胺诱导的免疫抑制小鼠小柴胡汤25g/kg,连续10日,并设免疫抑制模型组及正常对照组。于实验第11日采用末端脱氧核苷酸转移酶介导的缺口末端标记法检测脾脏细胞凋亡;免疫细胞化学法检测脾脏细胞Bcl-2和NF—KB的表达。结果与正常对照小鼠比较,免疫抑制小鼠脾细胞凋亡百分率明显升高（F=40．65,P〈0．01）,Bcl-2和NF—KB的表达均降低（F值分别为37．25、52．16,P〈0．01）;与正常对照组比较,给予小柴胡汤的正常小鼠的脾细胞凋亡率及Bcl-2和NF—KB的表达均没有统计学意义（F值分别为3．76、1．69、5．48,P〉0．05）。与免疫抑制小鼠比较,给予小柴胡汤的免疫抑制小鼠脾细胞凋亡率明显降低（F=36．84,P〈0．01）,Bcl-2和NF—KB的表达升高（F值分别为29．56、37．58,P〈0．01）。结论小柴胡汤可能通过影响免疫抑制小鼠脾细胞的凋亡进而调节机体免疫功能。     

小柴胡汤对免疫抑制小鼠脾细胞凋亡的影响及其机制

Objective To explore the influence of Bupleuri Decoction on the apoptosis of splenic cells of immunosuppressed mice and its mechanism. Methods Normal mice and the immunosuppressed mice treated with cyclophosphamide were administrated Bupleuri Decoction for 10 days per day. Mean while normal mice and immunosuppressed mice were used as controls. At the 11th day, apoptosis of splenic-cells were detected with terminal deoxynucleotidyl transferase mediated nick end labeling (TUNEL) assay. Expression of Bcl-2 and NF-κB of splenic cells were detected with immunocytochemistry. Results Compared with normal control, the splenic cell apoptosis increased (F =40. 65, P < 0. 01) and Bcl-2 as well as NF-κB expression decreased in the immunosuppressed mice (F = 37. 25, 52. 16, P < 0. 01). There was no obvious difference in the splenic cell apoptosis and expression of Bcl-2 and NF-kB between the normal control mice and the normal mice administered Bupleuri Decoction (F = 3. 76, 1. 69, 5. 48, P > 0. 05). Compared with immunosuppressed mice, the immunosuppressed mice administrated Bupleuri Decoction had lower splenic cell apoptosis and their expression of Bcl-2 as well as NF-κB increased obviously (F =36. 84, 29. 56, 37. 58, P <0. 01). Conclusion Bupleuri Decoction can modulating the immunological function of the immunosuppressed mice through modulating their splenic cell apoptosis.     

小柴胡汤对免疫抑制小鼠脾细胞凋亡的影响及其机制

Objective To explore the influence of Bupleuri Decoction on the apoptosis of splenic cells of immunosuppressed mice and its mechanism. Methods Normal mice and the immunosuppressed mice treated with cyclophosphamide were administrated Bupleuri Decoction for 10 days per day. Mean while normal mice and immunosuppressed mice were used as controls. At the 11th day, apoptosis of splenic-cells were detected with terminal deoxynucleotidyl transferase mediated nick end labeling (TUNEL) assay. Expression of Bcl-2 and NF-κB of splenic cells were detected with immunocytochemistry. Results Compared with normal control, the splenic cell apoptosis increased (F =40. 65, P < 0. 01) and Bcl-2 as well as NF-κB expression decreased in the immunosuppressed mice (F = 37. 25, 52. 16, P < 0. 01). There was no obvious difference in the splenic cell apoptosis and expression of Bcl-2 and NF-kB between the normal control mice and the normal mice administered Bupleuri Decoction (F = 3. 76, 1. 69, 5. 48, P > 0. 05). Compared with immunosuppressed mice, the immunosuppressed mice administrated Bupleuri Decoction had lower splenic cell apoptosis and their expression of Bcl-2 as well as NF-κB increased obviously (F =36. 84, 29. 56, 37. 58, P <0. 01). Conclusion Bupleuri Decoction can modulating the immunological function of the immunosuppressed mice through modulating their splenic cell apoptosis.     

甲状腺激素缺乏对大鼠胸腺细胞凋亡的影响

目的:探讨甲状腺激素缺乏对大鼠胸腺细胞凋亡及其相关蛋白Bcl-2和Bax表达的影响.方法:采用放射免疫技术测定甲巯咪唑组仔鼠血清中三碘甲状腺原氨酸(T3)、四碘甲状腺原氨酸(T4)、促甲状腺激素(TSH)水平;应用光镜、透射电镜技术和共聚焦激光扫描显微镜观察胸腺组织细胞形态学改变;免疫组织化学法检测胸腺组织中Bcl-2和Bax蛋白的表达.结果:甲巯咪唑组仔鼠体小,行动迟缓,胸腺绝对质量明显低于对照组,差异有统计学意义.对照组大鼠血清中T3、 T4值均高于甲巯咪唑组,TSH值低于甲巯咪唑组.甲巯咪唑组胸腺组织中出现大量的凋亡细胞和凋亡小体.Bcl-2蛋白表达的平均光密度值低于对照组;胸腺组织中Bax蛋白表达的平均光密度值高于对照组.结论:甲状腺激素缺乏可抑制胸腺组织中Bcl-2蛋白的表达和促进Bax蛋白的表达,诱导大鼠胸腺细胞凋亡,促进胸腺退化.     

高糖对培养大鼠施万细胞生长、凋亡的影响及其机制探讨

目的 研究高糖对大鼠施万细胞(SCs)生长及凋亡的影响,并探讨其可能机制. 方法将培养的SCs分别用含不同浓度葡萄糖的培养液孵育72h,四甲基偶氮唑盐(MTT)检测细胞活力,原位缺口末端标记法(TUNEL)检测细胞凋亡,Western blotting检测Bcl-2及Bax的表达. 结果 高浓度葡萄糖(60mmol/L、90mmol/L)组SCs活力降低,细胞凋亡率增加,抗凋亡蛋白Bcl-2表达下降及凋亡蛋白Bax表达升高. 结论 高糖抑制SCs生长,诱导细胞凋亡,可能与Bcl-2表达下降及Bax表达升高有关.     

黄芪注射液对缺氧缺糖/复氧复糖大鼠海马神经元Bcl-2和Bax表达的影响

目的: 观察黄芪注射液对缺氧缺糖/复氧复糖大鼠海马神经元凋亡相关蛋白Bcl-2、Bax及其mRNA表达的影响。方法: 取原代培养8 d的大鼠海马神经元,随机分为4组:正常对照组、模型组(缺氧缺糖/复氧复糖组)、溶剂对照组(缺氧缺糖/复氧复糖+黄芪注射液溶剂处理组)和黄芪注射液处理组(缺氧缺糖/复氧复糖+黄芪注射液处理组)。除正常对照组外,各组均进行缺糖缺氧0.5 h,再分别于复氧复糖后0 h、0.5 h、2 h、6 h、24 h、72 h和120 h采用Western blotting法检测海马神经元Bcl-2和Bax蛋白的表达,RT-PCR法检测海马神经元bcl-2和bax mRNA的表达。结果: Western blotting结果显示:与正常对照组比,模型组Bcl-2和Bax蛋白表达明显升高,而Bcl-2/Bax比值下调(P<0.05);与模型组比,黄芪注射液处理组Bcl-2蛋白表达升高,Bax蛋白表达明显降低,Bcl-2/Bax比值升高( P<0.05),而溶剂对照组Bcl-2、Bax蛋白表达及Bcl-2/Bax比值则无显著变化(P>0.05)。bcl-2 mRNA、bax mRNA表达趋势同蛋白。结论: 黄芪注射液可提高缺氧缺糖/复氧复糖大鼠海马神经元Bcl-2表达及Bcl-2/Bax比值,抑制Bax表达,从而抑制缺氧缺糖/复氧复糖引起的海马神经元凋亡。     

雌激素对慢性脑缺血大鼠海马神经元的保护作用

目的:探讨雌激素对慢性脑缺血大鼠海马神经元的保护作用.方法:采用永久结扎去势大鼠双侧颈总动脉的方法建立慢性脑缺血模型,项背部皮下注射17β-雌二醇.硫堇染色观察海马神经元的形态变化,SP免疫组织化学法观察海马神经元胆碱乙酰基转移酶(ChAT)、细胞凋亡抑制蛋白Bcl-2和细胞凋亡促进蛋白Bax的表达.结果:模型组大鼠海马神经元排列松散,大小不规则,部分细胞固缩深染,核固缩.雌激素治疗组海马神经元细胞形态、大小与正常接近,偶见个别神经细胞胞核固缩,胞质浓染.与模型组同时间点相比,雌激素治疗组各时间点海马神经元Bcl-2和ChAT蛋白的表达升高,Bax蛋白的表达降低,且均呈时间依赖性.结论:雌激素可通过抑制海马神经元凋亡、上调海马神经元ChAT的表达,发挥对慢性脑缺血大鼠海马神经元的保护作用.