杜氏盐藻核基质结合区结合蛋白的表达分析

目的 研究杜氏盐藻(Dunaliella salina)核基质结合区结合蛋白(matrix attachment region binding protein,MBP)基因随盐藻的生长表达变化情况及真核表达.方法 利用实时荧光定量PCR检测盐藻中MBP基因的表达变化,构建MBP的cDNA全长序列及N端和C端序列的含有组氨酸标签的真核表达载体,转染CHO细胞,筛选稳定转染株,Western blotting检测融合蛋白表达情况.结果 盐藻的MBP基因表达随生长周期变化,MBP及其N端和C端的融合蛋白成功在CHO细胞表达.结论 MBP可能参与盐藻增殖过程中RNA的加工,并为下一步分离真核表达的MBP,研究其功能提供了实验基础.     

人子宫内膜腺上皮细胞及基质细胞分离方法的研究

目的 探索子宫内膜腺上皮细胞及基质细胞分离的新方法。方法 通过胶原酶阶梯消化(0．25％，0．15％，0．1％，0．08％)、不同目次的筛网过滤、重力沉降等技术得到高纯度的人子宫内膜腺上皮细胞和基质细胞。结果 应用浓度逐渐降低的胶原酶消化子宫内膜组织，可提高细胞的存活率及细胞收集量。筛网过滤和重力沉降法，可提高子宫内膜腺上皮细胞和基质细胞的纯度，腺上皮细胞可达90％，基质细胞可达96％以上。结论 采用此方法可得到大量高纯度的子宫内膜腺上皮细胞及基质细胞，为体外研究子宫内膜提供模型。     

大鼠骨髓基质细胞的分离培养

目的：建立一种体外分离、培养扩增大鼠骨髓基质细胞的方法.方法：用密度梯度离心法（Percoll法）分离出大鼠骨髓基质细胞,并用含20%（体积分数）胎牛血清的DMEM培养液培养,胰酶消化传代,倒置显微镜下观察.结果：Percoll淋巴细胞分离液分离出的大鼠单核细胞活力达99%,将细胞接种到培养瓶10～14 d后,细胞长满瓶底,第1次传代,以后每5～7 d传代,传3～4代,细胞形态较典型.结论：PercoU法分离出离体培养的大鼠骨髓基质细胞.     

一种实用有效的整装电镜制样法──K_（562）细胞核基质─中间纤维的研究

采用培养板钻孔后覆以Ｆｏｒｍｖａｒ膜代替金网为支撑物培养细胞，并改良了抽提条件及观察条件，对人红白血病细胞Ｋ５６２的核基质－中间纤维体系结构进行了观察。结果显示，Ｋ５６２细胞核基质为粗细不等、分布不规则的纤维交织而成的网状结构，胞质中的中间纤维主要呈放射状分布，并借网板状的核纤层与核基质相连。本研究所采用的整装电镜制样方法与同类方法相比较，材料来源方便、经济，盲目性小，人工假象少，成功率较高，所得的Ｋ５６２细胞核基质－中间纤维图像清晰，为研究哺乳类红系细胞终末分化期的自然排核机理提供了有效手段，并为进一步探讨核基质－中间纤维体系在肿瘤细胞恶性调控中所起的作用奠定了形态学基础。     

杜氏盐藻高纯度叶绿体DNA的提取

目的:分离大量完整的杜氏盐藻叶绿体,提取高纯度的叶绿体DNA(cpDNA).方法:取对数生长后期的杜氏盐藻细胞进行高压破碎,利用差速离心和蔗糖密度梯度离心得到完整的叶绿体.采用优化的SDS-蛋白酶K-酚/氯仿/异戊醇方案抽提cpDNA,并经10 g/L琼脂糖凝胶电泳鉴定.结果:蔗糖密度梯度离心结果表明分离到了大量的叶绿体,相差显微镜及电镜观察证实所得叶绿体的完整性.紫外分光光度仪检测3个批次cpDNA的浓度蛋白酶为(2.21±0.02) mg/L,A(260 nm)/A(280 nm)为(1.772±0.012).结论:获得了高纯度的杜氏盐藻cpDNA,为进行叶绿体的转化研究奠定了实验基础.     

核基质在消化系统肿瘤中的研究进展

核基质是指真核细胞的细胞核依次去除膜脂、可溶性蛋白及染色质后所残留下来的以非组蛋白为主的网架结构,包括外周核纤层、内部纤维-颗粒状网架结构体系和核仁基质3部分。核基质作为细胞核的支架结构,决定着核型,与DNA的复制、转录及转录后修饰以及染色体的组装等许多重要的生命活动相关。组织的细胞种类不同,核基质蛋白成分也有一定的差别。本文对核基质在消化系统肿瘤发生和诊断中的价值做一简要综述。     

外周血单个核细胞结核分枝杆菌DNA的检测价值

目的：探讨单个核细胞结核分枝杆菌DNA检测在肺结核诊断中的价值。方法：380例外周血用淋巴细胞分离出单个核细胞，用1％TritonX—100加蛋白酶K提抽模板DNA作PCR扩增，产物227bp。结果：外周血单个核细胞结核分枝杆菌DNA检出率为90．3％(343/380)明显高于痰样本71．2％(94/132)。特异性93．3％(42／45)。结论：外周血单个核细胞结核分枝杆菌DNA检测可用于结核病的快速诊断，尤其适用于无痰患、肺外结核及儿童肺结核。     

NAC对烧伤大鼠单个核细胞内NF-κB活化及细胞因子mRNA表达的作用

目的：研究烧伤大鼠外周血单个核细胞(PBMC)内NF—κB活化及炎性相关细胞因子mRNA表达的规律，探讨NF—κB在严重烧伤后全身炎症反应中的作用机制。方法：选用SD大鼠制成30％TBSA三度烫伤模型，取全血分离单个核细胞，抽提核蛋白及总RNA，用凝胶电泳迁移率变动分析(EMSA)方法测定NF—κB的活化。用RT—PCR方法检测细胞因子mRNA表达的变化。用N-乙酰-L型半胱氨酸(NAC)阻断NF—κB活化，观察NF—κB对细胞因子表达的影响。结果：烧伤后PBMC内的NF-κB明显活化，在细胞核内积聚明显增加；促炎性细胞因子和Th2型细胞因子mRNA高表达。用NAC后NF—κB的活化水平被抑制，细胞因子表达水平相应地降低。结论：严重烧伤后活性氧(OFRs)至NF—κB的信号转导途径被激活，NF—κB过度活化，促炎性细胞因子失控性高表达。NAC可阻断OFRs至NF-κB信号转导途径，抑制细胞因子的过度表达。烧伤后T辅助细胞出现分化，Th2型细胞占优势，抗炎性细胞因子表达也明显增加。     

溶剂抽提分离烷硫化反应混合物

以铵盐和磷酸作为萃取剂抽提分离甲苯二氨烷硫化反应的反应混合物，重点考察在单级抽提分离过程中，工艺条件对萃取分离效果的影响。研究发现适宜的分离条件为：混合时间为15min，萃取温度为常温，萃取剂与原料的体积比为2，萃取剂的质量分数为0．025。在此条件下，二甲硫基甲苯二胺的质量分数可以由0．814提高到0．949，回收率为95．1％。     

青藤碱对类风湿关节炎树突状细胞核转录因子-κB活性的影响

目的观察中药单体青藤碱对体外培养类风湿关节炎患者树突状细胞核转录因子-κB活性的影响。方法分离12例类风湿关节炎患者外周血单核细胞,分为青藤碱高、中、低剂量组和空白对照组。采用GM—CSF,IL-4联合刺激分化,于分化第6天给予青藤碱干预,48h后于培养第8天收获细胞及培养上清。抽提核蛋白采用凝胶迟滞实验检测核转录因子-κB的活性,酶联免疫吸附实验检测培养上清IL-12的表达。结果与对照组相比,经青藤碱高、中、低剂量干预的树突状细胞核转录因子-κB活性及IL-12表达均降低．不同剂量组之间两者存在正相关。结论青藤碱可能通过抑制树突状细胞转录因子-κB活性,阻断其分化成熟,阻止了它在类风湿关节炎发病中的抗原提呈作用。     

杜氏盐藻高盐诱导蛋白的分离和鉴定

目的:对高盐和低盐培养条件下杜氏盐藻蛋白质组的双向电泳(2-DE)图谱进行比较分析,筛选高盐诱导蛋白并鉴定.方法:提取高盐(3.5 mol/L NaCl)和低盐(1.5 mol/L NaCl)培养条件下杜氏盐藻的总蛋白并进行2-DE,考马斯亮蓝染色后用Image-Scanner扫描仪扫描,ImageMaster 5.0...     

抗生素及草酊磷对盐藻生长的影响

目的：研究常用抗生素和草酊磷（Phosphinothricin,PPT)对盐藻生长的影响。方法：在固体培养基中加入不同浓度的卡那霉素、青霉素、链霉素、壮观霉素、利福平和PPT，在液体培养基中加入不同浓度PPT，对盐藻进行选择培养，观察盐藻在选择试剂作用下的生长情况。结果：卡那霉素、青霉素、链霉素、壮观霉素1600mg/L时尚不影响固体培养基中盐藻的生长；利福平400mg/L时可完全抑制固体培养基中盐藻的生长；而PPT3mg/L时即可完全抑制固体和液体培养基中盐藻的生长，5mg/L时可以杀死液体培养基中的盐藻。结论：PPT对盐藻的生长具有很强的抑制作用，在基因工程中，以抗除草剂（BAR）基因作为盐藻的选择标记基因研究盐藻的转化是合适的，草酊磷可以作为有效的选择试剂。     

蛋白激酶Cα参与高糖致人系膜细胞癌胚纤维连接蛋白的表达

目的:研究高糖环境下人系膜细胞(HMC)蛋白激酶Cα(protein kinase Cα,PKCα)、癌胚纤维连接蛋白(oncofetal FN)表达水平,并进一步探讨PKCα与oncofetal FN mRNA之间的关系。方法:实验HMC分组如下:正常葡萄糖组(NG,5 mmol/L D-葡萄糖),渗透压对照组(LG,5 mmol/L D-葡萄糖+20 mmol/L L-葡萄糖),高葡萄糖组(HG,25 mmol/L D-葡萄糖),高葡萄糖+PKCα抑制剂组(HS,25 mmol/L D-葡萄糖+40μmol/L Safingol)。以激光共聚焦显微镜观察PKCα蛋白表达及转位,RT-PCR法检测oncofetal FN mRNA表达水平。结果:(1)与NG组对比,高葡萄糖可促进蛋白激酶Cα蛋白发生核转位,定量分析示HG组胞浆/胞核强度较NG组降低20%(P<0.05),高葡萄糖刺激诱导HMC oncofetal FN mRNA上调,为NG组的2.36倍(P<0.05)。(2)与HG组比较,HS组PKCα蛋白转位激活被抑制,胞浆/胞核荧光强度比值为HG组的1.15倍,HS组oncofetal FN mRNA表达较HG组降低45%(P值均<0.05)。结论:PKCα的激活参与高葡萄糖致人系膜细胞oncofetal FN的表达。     

高糖对人类肾小球系膜细胞PKC及MMPs/TIMPs的影响

目的：研究体外高糖环境下人类肾小球系膜细胞(NHMC)中PKC激活或使用PKC抑制剂干预后 MMP2,9/TIMP1,2的表达,探讨PKC与MMPs/TIMPs信号转导在糖尿病肾病发生发展中的作用。方法：将NHMC分4组： N组（对照组,5 mmol/L葡萄糖）;H组（高糖组,30 mmol/L葡萄糖）;P组（抑制剂组,30 mmol/L葡萄糖+10-5mol/L白屈菜红碱）;M组(甘露醇组,5 mmol/L葡萄糖+25 mmol/L甘露醇)。分别于上述4种不同成分培养基中进行细胞培养,第24,48,72 h用MTT法测定NHMC增殖;并于培养后第24,48 h收集细胞,抽提mRNA及蛋白质,用ELISA方法测定胞膜、胞核蛋白质PKC活性。用RT-PCR和Western 印迹方法检测MMP2,9, TIMP1,2 mRNA和蛋白质的表达。结果：高糖组细胞膜和胞核部分的PKC活性较对照组明显升高(P＜0.01), MMP2,9, TIMP1,2 mRNA及蛋白质的表达较对照组明显上升(P＜0.01);而MMP-9/TIMP-1, MMP-2/TIMP-2比值较对照组明显下降(P＜0.05)。 高糖加PKC抑制剂白屈菜红碱后,MMP2,9, TIMP1 mRNA及蛋白质表达较对照组明显升高 (P＜0.01),但MMP9/TIMP1, MMP2/TIMP2比值较高糖组明显升高(分别P＜0.05,P<0.01)。PKC活性与MMP-2/TIMP-2及MMP-9/TIMP-1的蛋白质比值均呈负相关(分别r=-0.651,r=-0.702,均P＜0.05)。结论：高糖可刺激人类肾小球系膜细胞PKC活化,在DN中PKC活化与MMP2,9/TIMP1,2的表达水平有密切关系。     

葡萄糖对SVAREC细胞P-糖蛋白转运和表达的影响

目的探讨葡萄糖对内皮细胞SVAREC膜转运蛋白P-糖蛋白的底物转运和表达的影响。方法 1.用含10％胎牛血清的DMEM培养液将SVAREC细胞传入24孔板,等细胞贴壁后将细胞分成4组,分别换以下条件刺激,A组:低葡萄糖(5.5mmoL/L);B组:高葡萄糖(25mmol/L);c组:低葡萄糖(5.5mmol/L)+Verapamil(10~(-4)Mol);D组:高葡萄糖(25mmol/L)+Verapamil(10~(-4)/Mol);每组都同时用不同浓度的秋水仙碱(0;12.5;25;50ug/ml)刺激72小时,以MTT法测定细胞的耐受性。2.按上述方法将细胞传入培养皿中,待细胞贴壁后,分别换葡萄糖浓度为5.5mmol/L,25mmol/L和50mmol/L的DMEM培养液继续培养72小时,提取细胞膜蛋白,Westem-blot检测P-糖蛋白的蛋白表达。结果高糖处理的细胞对秋水仙碱(P-糖蛋白的转运底物)细胞毒的耐受性明显低于低糖处理的细胞,在秋水仙碱浓度为25ug/ml时,差异最为显著(P<0.01),Verapamil(P-糖蛋白转运的特异抑制剂)共处理的低糖组细胞对秋水仙碱的耐受性显著降低(秋水仙碱浓度为25ug/L时,P<0.01),而Verapamil处理后的高糖和低糖组细胞对秋水仙碱的耐受性无显著性差异。Westem-blot结果显示5.5mmol/L葡萄糖刺激的细胞P-糖蛋白蛋白表达明显高于25mmoL/L和50mmoL/L葡萄糖刺激的细胞,而25mmol/L和50mmol/L之间没有显著差异。结论高糖能够降低内皮细胞P-糖蛋白对其底物的转运和表达,增加其底物秋水仙碱在细胞中的积累,使细胞的耐受性下降。     

紫草素对人胎肾小球系膜细胞增殖、凋亡及细胞外基质的影响

目的：研究紫草素对人胎肾小球系膜细胞(MC)增殖、凋亡及细胞外基质的影响。方法：采用人胎肾细胞培养法、MTT法、流式细胞仪及免疫组化的方法。结果：紫草素0．05、0．10、0．50及1，00mmol／L浓度对培养24、48、72h人MC有明显抑制作用；紫草素明显抑制高糖诱发的人MC细胞凋亡；紫草素0．05、0．10、0．50μg/ml显著抑制系膜基质层粘连蛋白(LN)、纤维连接蛋白(FN)及胶原Ⅳ(CoⅣ)的生成。结论：紫草素具抑制人MC增殖、细胞外基质生成及细胞凋亡作用。     

不同剂量维生素 D 对早产儿钙磷代谢影响的研究

目的探讨不同剂量维生素D对早产儿钙磷代谢的影响。方法选取2015年2月~2016年2月本院入住的100例早产儿,按照随机数字表法分为高剂量组与低剂量组各50例,在早产儿10日龄时对高剂量组每天给予口服800 U维生素D,对低剂量组每天给予口服400 U维生素D。在20日龄、40日龄时检测早产儿血清中钙、磷和25-羟维生素D的含量。结果 20日龄高剂量组早产儿的钙、磷、25-羟维生素D水平为(2.42±0.12)mmol/L、(1.82±0.53)mmol/L、(45.56±12.45)nmol/L,明显高于低剂量组的(2.03±0.13)mmol/L、(1.71±0.59)mmol/L、(42.51±9.27)nmol/L(P0.05);40日龄高剂量组早产儿的钙、磷、25-羟维生素D水平为(2.56±0.14)mmol/L、(1.96±0.23)mmol/L、(73.46±18.57)nmol/L,与40日龄低剂量组的(2.12±0.21)mmol/L、(1.81±0.39)mmol/L、(64.48±15.37)nmol/L比较,差异有统计学意义(P0.05)。结论维生素D能改善早产儿钙磷代谢状态,800 U效果优于400 U。     

1, 25-二羟维生素D3对软脂酸诱导的胰岛素抵抗血管内皮细胞功能的影响

目的：探讨1, 25-二羟维生素D3[1, 25(OH)2D3]对软脂酸（PA）诱导的人脐静脉内皮细胞（HUVECs） 的胰岛素抵抗的影响及其可能作用机制。方法：用含0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9mmol/LPA 的DMEM培养基培养HUVECs,建立胰岛素抵抗内皮细胞模型。分别用0、0.01、0.1、1.0、10、100nmol/ L1, 25(OH)2D3干预,硝酸盐/亚硝酸盐荧光试剂盒测定NO含量,Westernblot法测定pAkt及peNOS蛋白的 表达,qPCR法测定VDR、ET-1的表达。结果：0.6mmol/L的PA培养HUVECs18h后,培养液中的葡萄糖浓度 耗减显著低于对照组,细胞活力降低,胰岛素抵抗的内皮细胞模型建立。PA干预后NO含量较对照组HUVECs 减少（ P ＜0.05）,1nmol/L1, 25(OH)2D3干预胰岛素抵抗的内皮细胞后NO含量增加,在1min时NO量达最 大值。1nmol/L浓度1, 25(OH)2D3干预胰岛素抵抗的内皮细胞后peNOS及pAkt的蛋白表达量明显增加（ P ＜ 0.05）,ET-1的mRNA表达水平明显减少（ P ＜0.05）。结论：1, 25(OH)2D3增加PA诱导的胰岛素抵抗血管内皮细 胞peNOS、pAkt的表达,增加NO产生,降低ET-1的表达,可能对胰岛素抵抗的血管内皮细胞存在一定的保护作用。     

高糖培养的大鼠肾小球系膜细胞中NO的变化及其对细胞外基质的影响

目的 探讨高糖培养的肾小球系膜细胞中一氧化氮（NO）合成的变化,以及上述变化对细胞外基质的影响.方法 体外培养大鼠肾小球系膜细胞,按干预方法分为正常组（NG组,5.56 mmol·L-1 DMEM）,高糖组（HG组,25 mmol·L-1 DMEM）、一氧化氮供体组（SNP组,5.56 mmol·L-1 DMEM＋100 μmol·L-1 SNP）、NO清除剂组（C-PTIO 组,25 mmol·L-1 DMEM＋200 μmol·L-1 C-PTIO）,以Griess比色法测定培养上清中NO水平;用ELISA法测定培养上清中Ⅳ型胶原、层黏蛋白含量.结果 高糖培养条件下上清中NO增多（P〈0.05）,Ⅳ型胶原、层黏蛋白含量增加（P〈0.01）,应用C-PTIO可显著降低上清中NO的含量,Ⅳ型胶原、层黏蛋白的含量也降低.结论 高糖可诱导大鼠肾小球系膜细胞产生NO,异常增多的NO又可导致系膜细胞中Ⅳ型胶原、层黏蛋白的积聚.     

用基因枪法将bar基因导入杜氏盐藻及转基因藻株的检测

目的：探讨基因枪转化方法不同轰击条件和启动子的选择对转化杜氏盐藻的影响。方法：以抗除草剂(bar)基因作为报告基因,用基因枪法将其导入杜氏盐藻。通过草丁膦筛选培养获得转化藻株,对转化藻株进行分析。结果：在氦气压力为100L／min条件下,微弹轰击2次比微弹轰击1次或3次的效果都好;杜氏盐藻碳酸酐酶(CA1)基因启动子可驱动bar基因在杜氏盐藻巾瞬时表达,而双拷贝碳酸酐酶(DCA1)基因启动子可驱动bar基因在杜氏盐藻中稳定表达。结论：在氦气压力为100L／min条件下微弹轰击2次,可能是基因枪法转化杜氏盐藻的较好转化条件。在转基因杜氏盐藻研究中,DCA1基因启动子可能是一种较为理想的启动子类型。