葛根素调节成骨细胞体外增殖及相关信号通路表达改变的实验研究

目的:研究葛根素对成骨细胞体外增殖及相关信号通路表达的调节作用。方法:培养小鼠原成骨细胞MC353-E1,分为用10μg/mL葛根素处理的葛根素组以及不含药物和血清培养基处理的对照组,处理前及处理后12、24、48h时,采用MTS试剂盒测定细胞的增殖活力,采用酶联免疫吸附试剂盒测定PI3K/AKT/FoxO信号通路分子及凋亡基因的表达量。结果:处理后12、24、48h时,葛根素组的细胞活力均显著高于对照组,p-PI3K、p-AKT、p-FoxO1、p-FoxO3a的表达量均显著高于对照组,Bmi、Bax、CytC、AIF、Caspase-3的表达量均显著低于对照组;葛根素对细胞活力以及p-PI3K、p-AKT、pFoxO1、p-FoxO3a、Bmi、Bax、CytC、AIF、Caspase-3表达量的调控作用具有时间依赖性。结论:葛根素能够通过PI3K/AKT/FoxO信号通路促进成骨细胞的增殖。     

骨碎补提取液对成骨细胞增殖的影响

目的:观察骨碎补提取液对体外培养成骨细胞增殖的影响。方法:实验药物与体外培养成骨细胞共同培养3、5、7、10d后,分别采用免疫组化染色和放免法测定I型胶原蛋白和碱性磷酸酶的含量,检测成骨细胞的增殖情况。结果:骨碎补提取液对成骨细胞的增殖有促进作用,且和药物剂量有密切关系。1000mg/L的骨碎补提取液对成骨细胞有明显的促进作用,在1000~1500mg/L的浓度范围内,其促进作用随浓度升高而增加,并于1500~1600mg/L时达到最大效应。结论:骨碎补提取液对成骨细胞的增值分化有促进作用。     

骨碎补、续断、西洋参对成骨细胞MC3T3-E1细胞增殖的影响

骨碎补、续断是中医骨伤科中常用药物,具有促进骨折愈合、强骨补肾的功效,但其作用机制不明。西洋参为补气血常用药,对骨细胞增殖也有一定的促进作用,但对此研究较少。本文以小鼠成骨细胞MC3T3-E1为细胞模型,用体外实验方法,研究了骨碎补、续断、西洋参水提液对成骨细胞增殖的作用,同时了解骨碎补、续断联合用药对成骨细胞增殖的影响,报道如下。     

高表达低氧诱导因子-1对成骨细胞增殖及细胞周期的调控研究

目的探讨低氧情况下高表达低氧诱导因子HIF-1对成骨细胞增殖及细胞周期的影响。方法获取大鼠颌面部成骨细胞,分别在低氧含量（2%O2）、常规氧含量（21%O2）及低氧含量（2%O2）＋二甲氧乙二酰甘氨酸（DMOG）条件下进行培养,在不同培养时间分别检测成骨细胞表达的增殖能力、细胞周期变化及HIF-1蛋白的表达。结果在低氧情况下,成骨细胞增殖活性降低,细胞周期分析可见处于分裂期细胞减少,加入DMOG后细胞的HIF-1蛋白处于高表达,细胞增殖特性与常规氧含量相比无统计学差异。结论 DMOG可促进低氧状态下成骨细胞低氧诱导因子-1的高表达,有利于低氧状态下成骨细胞的增殖活性回复,可加快骨生长,为骨缺损的治疗开辟了新途径。     

脂多糖诱导成骨细胞增殖的Notch信号通路研究

目的:探讨脂多糖(LPS)对成骨细胞增殖的Notch信号通路的诱导激活作用.方法:以MC3T3-E1细胞为模型,设计正常对照组、LPS浓度梯度组(5、10μg组)、DAPT组(先加入DAPT,随后加入10μg LPS)和DMSO组(先加入DMSO,随后加入10μg LPS).分别于OBDM培养基中诱导分化5d和15d时加入不同浓度的脂多糖、DAPT和DMSO,培养3d后进行MTT实验,随后采用PCR检测各组细胞中HES1mRNA表达量.结果:与对照组相比,加入脂多糖5μg组第5天,脂多糖10 μg组第5、6、7天时细胞吸光度显著降低(P＜0.01);与正常对照组相比,5μg组和10 μg组脂多糖均能够使MC3T3-E1细胞和成骨细胞前体细胞增殖能力降低(P＜0.01),而仅5μg组LPS能够使成骨细胞增殖分化能力降低(P＜0.01);不同浓度LPS均能够诱导HES1mRNA的表达,与对照组相比,差异有统计学意义(P＜0.01);随着LPS浓度增加,HES1mRNA表达量显著增加(P＜0.01);与对照组相比,DM-SO组HES1mRNA量显著较高,差异具有统计学差异(P＜0.05).结论:脂多糖抑制骨头发育和愈合,可能是通过激活经典的Notch信号通路,诱导HES1mRNA的表达,抑制成骨细胞及其前体细胞的增殖分化造成.     

氟化钠对成骨细胞增殖及分化影响的实验研究

观察不同剂量氟化钠(NaF)对大鼠成骨细胞增殖分化的影响。成骨细胞经酶消化法从新生24hSprague-Dawlev(SD)种乳鼠头盖骨分离得到。在10-7mol／L～5×10-4mol／LNaF中培养。用MTT测定细胞增殖,并经生化法测定细胞碱性磷酸酶(ALP)及放免法测定培养液中骨钙素含量反映细胞分化。结果表明NaF对成骨细胞增殖率的影响呈双向调节,表现为小剂量NaF(10-mol／L,10-6mol／L,10-5mol／L)刺激细胞增殖,其提高增殖率分别达到11．3％、10．9％、10.6％,(P<0.05),大剂量反之,与对照组相比,10-4mol／L及5×10-4mol／LNaF降低细胞增殖率为9．6％与9．7％。细胞分化对NaF的反应表现为多样性。ALP活性的改变基本与细胞增殖率的变化相同,即小剂量刺激,大剂量抑制。然而骨钙素分泌的改变则呈单向作用,各浓度NaF均刺激细胞骨钙素分泌,其中5×10-4mo1／L组骨钙素水平最高达67.14％(P<o.05)。NaF对大鼠颅骨成骨细胞增殖的影响呈双向调节,但对细胞分化的作用成多样性。     

硅酸二钙离子溶出液体外促进成骨细胞早期增殖及对细胞周期的影响

目的探讨硅酸二钙涂层离子溶出液对成骨细胞早期增殖和细胞周期的影响及其机制。方法含有硅酸二钙离子溶出液的DMEM培养基作为实验组,正常DMEM培养基作为对照组,分别接种人成骨细胞株MG63细胞培养。MTT法测定细胞增殖情况;流式细胞仪测定成骨细胞G0/G1、S、G2/M期变化,并进行比较。结果与对照组比较,实验组MG63细胞增殖在各时间点增强,其中24、72h的差异有统计学意义（P〈0.05）;在48、72h,处在S期和G2/M期的细胞增多;而G0/G1期细胞降低,差异均有统计学意义（均P〈0.05）;结论硅酸二钙涂层离子溶出液能加速成骨细胞周期,进而促进细胞增殖,促进新骨的形成。因此,该材料是一种较理想的生物活性涂层材料。     

柚皮苷对小鼠成骨细胞MC3T3-E1增殖功能的影响

[目的]检测柚皮苷溶液对成骨细胞株MC3T3-E1细胞增殖功能的影响。[方法]以成骨细胞株MC3T3-E1细胞为体外药效的试验模型,通过CCK-8法观察各种浓度的柚皮苷溶液对MC3T3-E1细胞增殖能力的影响。[结果]高浓度的柚皮苷溶液在12h和24h时能促进MC3T3-E1细胞的增殖作用。而低浓度的柚皮苷溶液则无此作用。但是48h时各个浓度的柚皮苷溶液均不能促进细胞增殖。所测的各个组别细胞毒性百分比都较小,且随着时间的推移(12h,24h,48h)变化较小。光镜下观察各个时间点细胞的密度和形态也未发生明显的变化。[结论]柚皮苷溶液可以提高成骨细胞株MC3T3-E1增殖能力。     

胰岛素和IGF-Ⅰ促进成骨样细胞增殖功能的实验研究

目的:应用胰岛素(INS)、胰岛素样生长因子-Ⅰ(IGF-Ⅰ)干预体外培养的人成骨肉瘤细胞MG63(MG63),并以17-β雌二醇(E2)做阳性对照,观察细胞增殖功能的改变;探讨骨质疏松(OP)的发病机制,为治疗OP提供实验依据.方法:将MG63细胞接种到DMEM培养基中培养,并进行药物干预.用四甲基偶氮唑盐(MTT)染色,酶标仪测定细胞OD值.结果:各药物组内OD值比较均有统计学差异(P＜0.05),量效关系呈抛物线形.三药物组间细胞增殖率有统计学差异(P＜0.05).三组药物的最佳药物浓度分别为50nM、10nM、100nM.结论:与E2相同,INS、IGF-Ⅰ两种药物均有促进MG63细胞增殖的作用.     

特异性siRNA抑制HPV16 E7基因表达的实验研究

目的筛选针对HPV16 E7基因有效的siRNA,探讨其对HaCaT E7 细胞中HPV16 E7 mRNA及细胞表面HLA Ⅰ类分子表达的影响。方法采用化学法合成3条HPV16 E7特异性siRNA,应用转染试剂Lipofectamine2000将其转染入HaCaT E7细胞,采用实时荧光定量PCR（RT PCR）检测HPV16 E7 mRNA的表达,采用流式细胞术（FCM）检测细胞表面HLA Ⅰ类分子的表达。结果3条siRNA均能有效抑制HaCaT E7细胞中HPV16 E7的转录表达,以siRNA2作用效果最明显,抑制率达75%,细胞膜表面HLA Ⅰ类分子的表达明显上调,平均荧光强度(MFI)为130.18±1.07,高于空转染对照组（100.32±3.01）和非特异性siRNA对照组（100.82±2.87）。 结论化学合成的HPV16 E7特异性siRNA能有效抑制HaCaT E7细胞中E7 mRNA的表达,同时使细胞表面HLA Ⅰ类分子表达上调。     

藤梨根提取液抗肺癌作用的实验研究

目的:观察藤梨根提取液对肺腺癌A549细胞的生长抑制作用,为其治疗肺癌提供实验依据。方法:采用MTT检测法、集落形成试验观察药物对细胞的作用,用流式细胞术检测细胞凋亡,同时分析药物对细胞周期的影响。采用裸鼠移植瘤模型进行体内实验,并绘制移植瘤生长曲线,计算抑制率。结果:各浓度的藤梨根提取液对肺腺癌A549细胞有较强的抑制效应,呈现出明显的时相性和量－效依赖性,流式细胞仪检测结果显示,藤梨根提取液作用后,G0/G1期细胞数增加,细胞出现凋亡,并随药物浓度增大,作用增强。移植瘤体内试验显示,藤梨根提取液高剂量组（按1?000?mg/kg）和低剂量组（按500?mg/kg）的抑瘤率分别为71.40%和40.35％,治疗组移植瘤生长缓慢,体积明显小于对照组（P＜0.01）。结论:藤梨根提取液在体内外对人肺腺癌A549细胞生长均有抑制作用,体外作用与G0/G1期阻滞有关,并有诱导人肺腺癌A549细胞凋亡的作用。     

食管癌组织中ERCC1和GSTP1表达量与铂类化疗药物敏感性及凋亡、增殖基因表达量的相关性

目的:研究食管癌组织中ERCC1和GSTP1表达量与铂类化疗药物敏感性及凋亡、增殖基因表达量的相关性。方法:选择在我院接受PF方案化疗的晚期食管癌患者,化疗前收集食管癌组织并根据化疗后的效果分为化疗敏感组和化疗耐药组,检测食管癌组织中ERCC1、GSTP1以及凋亡基因、增殖基因的表达量。结果:化疗敏感组食管癌组织中ERCC1、GSTP1的蛋白含量以及蛋白阳性表达率均显著低于化疗耐药组,MBP1、DEC1、PTEN的蛋白含量显著高于化疗耐药组,PLCE1、CyclinD1、PAR2的蛋白含量显著低于化疗耐药组;ERCC1、GSTP1阳性表达食管癌组织中MBP1、DEC1、PTEN的蛋白含量显著低于ERCC1、GSTP1阴性表达食管癌组织,PLCE1、CyclinD1、PAR2的蛋白含量显著高于ERCC1、GSTP1阴性表达食管癌组织。结论:食管癌组织中高表达的ERCC1和GSTP1能够降低癌细胞对铂类化疗药物的敏感性,在铂类药物化疗过程中抑制细胞凋亡、促进细胞增殖。     

乳腺珠蛋白基因的克隆及重组蛋白的表达和纯化

目的克隆人乳腺珠蛋白（hMaM）基因，获得高纯度hMaM重组蛋白。方法从人乳腺癌组织提取总RNA，逆转录合成cDNA，设计特异引物，用PCR方法扩增获得目的片段，利用T／A克隆将PCR产物插入pMD-18T载体。利用BamHI＋XhoI双酶切方法将目的基因导入表达载体，阳性质粒转化BL21（DE3）感受态细胞，通过IPTG诱导获得重组蛋白，并用His-Select^TM和Sephadex-G100进行纯化。结果用RT-PCR方法获得279bp的片段，克隆至T载体后经DNA测序，结果与预期序列一致。表达质粒转化大肠杆菌后经诱导获得27kD的目的蛋白，与预期分子质量一致。表达产物最终纯化为一条带。结论成功克隆hMaM基因，并获得高纯度重组蛋白，为hMaM的深入研究打下基础。     

低剂量激光联合阿魏酸对成骨细胞分化成熟及成骨信号通路表达的影响

目的:研究低剂量激光(LLLI)联合阿魏酸对成骨细胞分化成熟及成骨信号通路表达的影响。方法:取新生24小时以内SD大鼠的颅盖骨,分离培养成骨细胞后分为对照组、阿魏酸组、LLLI组、阿魏酸+LLLI组,不同条件连续处理3天后检测成骨细胞分化标志物、增殖分子、信号通路分子的表达量。结果:处理后3天时,阿魏酸组、LLLI组、阿魏酸+LLLI组细胞中Bax、Bid的mRNA表达量均显著低于对照组,Bcl-2、CyclinD1、E2F、Col-I、OC、ALP的mRNA表达量以及Wnt、β-catenin、Runx2、cAMP、PKA的蛋白表达量均显著高于对照组(P<0.05);阿魏酸+LLLI组细胞中Bax、Bid的mRNA表达量均显著低于阿魏酸组和LLLI组,Bcl-2、CyclinD1、E2F、Col-I、OC、ALP的mRNA表达量以及Wnt、β-catenin、Runx2、cAMP、PKA的蛋白表达量均显著高于阿魏酸组和LLLI组(P<0.05),阿魏酸组和LLLI组细胞中Col-I、OC、ALP、Bax、Bid、Bcl-2、CyclinD1、E2F的mRNA表达量以及Wnt、β-catenin、Runx2、cAMP、PKA的蛋白表达量无显著性差异(P>0.05)。结论:低剂量激光联合阿魏酸能够促进成骨细胞分化成熟、激活成骨信号通路。     

胰岛素样生长因子1促许旺细胞生长的实验研究

目的 探索促进许旺细胞增殖的方法。方法 将原代大鼠许旺细胞进行体外培养，并在培养基中加入不同浓度的胰岛素样生长因子１（ＩＧＦ－１）。通过绘制细胞生长曲线及＾３Ｈ－ＴｄＲ渗入等方法，观察ＩＧＦ－１对许旺细胞的作用。结果 ＩＧＦ－１能使培养的许旺细胞增殖加快，提前进入平台期。许旺细胞的增殖与ＩＧＦ－１的浓度在一定范围内呈现量效关系，同时ＩＧＦ－１的作用并不导致许旺细胞的肥大。结论 ＩＧＦ－１对许旺细胞     

外源性IL-18基因对C6胶质瘤细胞增殖及相关基因表达的影响

目的:研究IL-18基因转染对C6胶质瘤细胞增殖活性及相关基因表达的影响. 方法:用流式细胞仪观察C6/IL-18细胞周期、增殖指数的变化;用RT-PCR,蛋白印迹、免疫细胞化学方法分析C6/IL-18细胞cyclin D1,cyclin B1,Bcl-2 mRNA及蛋白的表达. 结果:与亲代C6细胞相比,C6/IL-18细胞表现为G0/G1期细胞增多、G2/M期细胞减少,细胞增殖指数(PI)降低. C6/IL-18细胞的cyclin D1和cyclin B1,Bcl-2 mRNA及蛋白表达降低. 结论: 外源性IL-18基因可降低C6细胞的增殖活性,其机制可能与Bcl-2,cyclin B1和cyclin D1表达下调有关.     

pcDPG基因治疗甲状旁腺功能减退症的实验研究

目的构建甲状旁腺激素(PTH)基因的重组真核表达质粒,评价体外转染后PTH基因的表达与生物学活性,同时观察其对甲状旁腺功能减退动物的基因治疗作用。方法(1)从人胚甲状旁腺组织中克隆PTH基因,拓扑法构建其重组真核表达质粒pcDNA3.1-PTH-GFP(pcDPG),并采用酶切、聚合酶链反应(PCR)及DNA测序鉴定;(2)用脂质体转染pcDPG入293细胞,观察绿色荧光蛋白(GFP)表达并计算转染率,同时逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)验证PTH基因的表达;(3)纯化转染细胞上清中PTH蛋白,进行生物学活性鉴定;(4)建立甲状旁腺功能减退症的家兔模型,将pcDPG质粒以肌肉注射进行分组治疗,监测血钙、磷和PTH值及存活时间,通过形态学观察各器官的病理变化。结果(1)酶切与PCR结果与预期相同,测序结果与文献中序列同源性为99.3%;(2)细胞转染后24h即可见GFP表达,随时间延长而表达增强,48h转染率达38.9%和62.5%,同时RT-PCR见PTH基因表达;(3)纯化的PTH蛋白可对抗甲状旁腺切除小鼠的抽搐症状;(4)模型兔术后第2d血钙(1.71mmol/L±0.09mmol/L,1.73mmol/L±0.03mmol/L,1.75mmol/L±0.03mmol/L,1.65mmol/L±0.04mmol/L)明显低于术前(2.82mmol/L±0.21mmol/L,P<0.05),术后第2d PTH值(5.03pg/ml±0.05pg/ml,5.04pg/ml±0.05pg/ml,5.03pg/ml±0.07pg/ml,5.29pg/ml±0.03pg/ml)也明显低于术前(11.63pg/ml±1.60pg/ml),但是术后第2d血磷增高(P<0.05),pcDPG质粒大、中剂量组治疗后48h血钙、磷与PTH值均恢复至正常。结论脂质体介导的质粒pcDPG体外转染率较高,能表达有活性的PTH蛋白,同时对甲状旁腺功能减退家兔有较好的疗效,从而为甲状旁腺功能减退症基因治疗的进一步研究奠定了基础。