人脐带间充质干细胞源外泌体对高糖环境下RPE细胞自噬和VEGF表达的影响

目的:探讨人脐带间充质干细胞(hUMSC)源外泌体对高糖环境下ARPE-19细胞自噬及VEGF表达情况的影响。方法:原代培养hUMSC,分离纯化hUMSC外泌体,Western blot鉴定hUMSC外泌体标志蛋白CD63表达,透射电镜观察外泌体形态。将体外培养的ARPE-19细胞随机分为对照组、高糖组和外泌体+高糖组(75μg/mL外泌体预处理)。培养48h后,电镜观察三组细胞内自噬体的超微结构,MTT法检测各组细胞增殖情况,Western blot检测各组细胞中自噬标志性蛋白LC3B、Beclin-1及p62的表达,ELISA法检测细胞上清液中VEGF的质量浓度。结果:分离纯化后的外泌体为直径30~100nm的球状膜性囊泡,表达特异性标识蛋白CD63。外泌体+高糖组中自噬体的数量明显少于高糖组。外泌体+高糖组的细胞增殖率较高糖组明显升高(P<0.01)。对照组、高糖组、外泌体+高糖组细胞中LC3B-Ⅱ/Ⅰ、Beclin-1和p62值分别为(0.214±0.019、0.461±0.067和0.332±0.079),(0.186±0.029、0.615±0.044和0.464±0.046)和(0.771±0.051、0.364±0.016和0.547±0.039)。高糖组细胞中LC3B-Ⅱ/Ⅰ值和Beclin-1值均明显高于对照组和外泌体+高糖组(均P<0.05),高糖组细胞中p62值明显低于对照组和外泌体+高糖组(均P<0.01),外泌体+高糖组VEGF的质量浓度较高糖组明显降低(P<0.01)。结论:高糖环境激活ARPE-19细胞自噬,并促进其VEGF的表达。hUMSC外泌体可有效抑制高糖环境下ARPE-19细胞自噬水平,并下调VEGF的表达。     

沉默GFAP基因调控高糖诱导的视网膜微血管内皮细胞增殖与凋亡

目的：研究沉默胶质纤维酸性蛋白(GFAP)基因对高糖诱导的人视网膜微血管内皮细胞(hRMECs)增殖和凋亡的影响及其机制。

方法：采用qRT-PCR法检测高糖(30mmol/mL)和低糖(5mmol/mL)处理的hRMECs中GFAP的表达。通过慢病毒介导法建立GFAP基因稳定沉默的高糖诱导的hRMECs细胞模型,用SRI-011381(TGF-β信号通路特异性激活剂)、二甲基亚砜(DMSO)处理该细胞模型,采用Western blot法检测细胞中GFAP、转化生长因子-β1(TGF-β1)、转录激活因子2(Smad2)、Smad3蛋白的表达,并分别采用CCK-8法和流式细胞术检测细胞增殖和凋亡。

结果：高糖处理的hRMECs中GFAP表达水平显著升高。通过慢病毒介导法可成功构建GFAP基因沉默的高糖诱导的hRMECs细胞模型,且沉默GFAP后,细胞的增殖能力明显提高,凋亡率明显抑制,TGF-β信号通路关键基因TGF-β1、Smad2、Smad3的蛋白表达均明显抑制,而激活TGF-β信号通路可逆转沉默GFAP对高糖诱导的hRMECs细胞的增殖促进和凋亡抑制作用。

结论：沉默GFAP基因可促进高糖诱导的人视网膜微血管内皮细胞增殖,抑制细胞凋亡,其机制可能与TGF-β信号通路失活相关。     

miR-34a-5p对ARPE-19细胞TGF-β/Smad通路相关蛋白表达及细胞增殖、迁移和上皮-间质转化的影响

目的 探讨miR-34a-5p对ARPE-19细胞TGF-β/Smad通路相关蛋白表达及细胞增殖、迁移和上皮-间质转化(EMT)的影响。方法 将ARPE-19细胞分为4组：对照组、转化生长因子(TGF)-β1组、miR-34a-5p过表达组与复合干预组,对照组与TGF-β1组采用Lipofectamine 2000转染试剂转染对照模拟物,miR-34a-5p过表达组与复合干预组转染miR-34a-5p模拟物,培养24 h后采用无血清培养基饥饿培养12 h, TGF-β1组与miR-34a-5p过表达组均添加10 mg·L^-1的TGF-β1,复合干预组添加10 mg·L^-1的TGF-β1与10μmol·L^-1的TGF-β通路激活剂SRI-011381,各组细胞继续培养24 h,测定细胞增殖、迁移与EMT。采用Western blot检测细胞TGF-β/Smad通路相关蛋白的表达水平,Ki67荧光染色检测细胞增殖情况,免疫荧光染色测定细胞EMT相关蛋白表达情况,划痕实验和Transwell实验测定细胞的迁移和侵袭能力。结果 ...     

TGF-β2作用于人晶状体上皮细胞后Smad 4与p-Smad2／3的动态表达

目的观察转化生长因子β2（TGF-β2）作用于人晶状体上皮细胞（LECs）后2类通路转导蛋白Smad4和p-Smad2／3的动态表达变化。方法体外培养的人LECs中添加10ng／mL人TGF—β2,RT-PCR方法测定不同时间点Smadg mRNA的表达,Western blot观察p-Smad2／3的表达,免疫组织化学法观察p-Smad2／3在LECs表达的特点。结果人LECs添加了外源性人TGF-β2,后1h,可出现Smad 4 mRNA表达增高,16h时达峰值（0．72±0．07）,并持续至24h。与对照组比较差异无统计学意义（P〈0．05）。p-Smad2／3在2h后逐渐增强,与对照组比较差异明显,16h达到峰值（2．53g／L）。16h有p-Smad2／3颗粒胞浆表达,24b向核内聚集。结论TGF-β2刺激LECs后,可激活膜受体激活型Smad和通用型Smad,TGF-β2对Smad通路蛋白的激活存在时效关系。TGF—β2可通过特异性激活Smad通路,将信号转导至细胞核内。     

缓激肽对转化生长因子-β1（TGF-β1）诱导视网膜色素上皮细胞发生上皮间充质转化的影响

目的　制作增生性玻璃体视网膜病变(proliferative vitreoretinopathy,PVR)的上皮间充质转化（epithelial-mesenchymal transformation,EMT）细胞模型,研究缓激肽（bradykinin,BK）对视网膜色素上皮（retinal pigment epithelium,RPE）细胞发生EMT的影响,并探讨BK对PVR的影响机制。方法　体外培养人RPE细胞株ARPE-19细胞,采用不同浓度转化生长因子-β1（transforming growth factor- β1,TGF- β1）分别作用于ARPE-19细胞24 h、48 h,于倒置显微镜下观察细胞形态变化;采用CCK-8检测细胞增殖情况,确定TGF-β1浓度及作用时间;利用Western blot和细胞免疫荧光检测EMT标志蛋白E-钙黏素、α-平滑肌肌动蛋白（α-smooth muscle actin,α-SMA）和波形蛋白（Viminten）表达情况;细胞划痕实验、Transwell实验检测细胞迁移能力。同时采用Western blot检测TGF/Smad通路下游pSmad3和Smad7的表达。结果　TGF- β1刺激ARPE-19细胞后可以成功诱导EMT体外细胞模型。当TGF-β1浓度为10 μg·L^-1、作用时间为48 h时,细胞增殖最明显。BK在TGF- β1诱导的EMT中可以降低α-SMA、Viminten的表达,升高E-钙黏素的表达并且降低细胞迁移能力。这些影响能被BK-2受体拮抗剂HOE-140逆转。TGF-β1诱导ARPE-19细胞发生EMT时,pSmad3表达量升高;TGF-β1刺激前给予BK刺激,pSmad3表达量减少;加入BK前预敷HOE-140,然后给予TGF-β1刺激,BK作用减弱,pSmad3表达量升高。Smad7表达趋势与pSmad3表达趋势相反。结论　10 μg·L^-1 TGF-β1可导致ARPE-19细胞发生EMT。BK通过TGF-/Smad信号通路上调Smad 7的表达、下调pSmad 3的表达,从而逆转TGF-β1诱导的EMT。提示BK可能是一种新的、有效的治疗PVR的方法。     

自噬激活剂雷帕霉素对A2E诱导视网膜色素上皮细胞自噬调节的影响

目的 探讨自噬激活剂雷帕霉素对N-亚视黄基-N-视黄基乙醇胺(A2E)诱导视网膜色素上皮(RPE)细胞自噬调节的影响。方法 取人RPE细胞(ARPE-19细胞系)进行培养。将细胞分为4组,其中,对照组：使用DMEM-F12完全培养基孵育ARPE-19细胞;A2E组：使用含20μmol·L^-1 A2E的DMEM-F12完全培养基孵育ARPE-19细胞;雷帕霉素组：使用含100 nmol·L^-1雷帕霉素的DMEM-F12完全培养基预处理细胞1 h后,再用DMEM-F12完全培养基孵育ARPE-19细胞;雷帕霉素联合A2E组：使用100 nmol·L^-1雷帕霉素预处理细胞1 h后,再用含20μmol·L^-1 A2E的DMEM-F12完全培养基孵育ARPE-19细胞。使用CCK-8法检测各组细胞增殖情况,Procarta细胞因子分析试剂盒检测各组细胞培养上清液中细胞因子表达情况。透射电镜观察各组细胞超微结构,Western blot法检测各组细胞自噬相关蛋白Beclin-1和P62的表达,免疫荧光染色法检测...     

TGF-β1基因转染对人晶状体上皮细胞周期调控的影响

目的:探讨脂质体介导的TGF-β1基因(pEGFP-TGF-β1)转染诱导人晶状体上皮细胞系-B3(HLEC-B3)细胞周期蛋白激酶抑制因子p21及细胞周期蛋白激酶CDK2的表达及其对细胞周期调控的影响。方法:将pEGFP-TGF-β1转染人晶状体上皮细胞系-B3(HLEC-B3),采用RT-PCR和Western-blot方法检测pEGFP-TGF-β1转染后24,48,72,96hp21,CDK2和Smad4mRNA和蛋白的表达,设立正常细胞组及pEGFP-C2转染组为对照组。结果:pEGFP-TGF-β1转染组TGF-β124h开始升高,48h达到最高,72h略有减少,96h明显减少,但仍高于正常组,而空载体组与正常细胞组则无明显变化。p21变化趋势和TGF-β1相符,CDK2组变化趋势则正好相反,Smad4组48h明显升高,72h下降明显,96h基本恢复正常。结论:TGF-β1通过活化凋亡基因p21,降低细胞周期蛋白激酶CDK2。     

Anti-fibrotic effect of rosmarinic acid on inhibition of pterygium epithelial cells

AIM: To investigate the anti-fibrosis effect of rosmarinic acid (RA) in pterygium epithelial cells (PECs) to determine if RA is a potent agent for treating pterygium. METHODS: The PECs (1×104 cells/mL) were treated with 100 μmol/L of RA for 1, 3 and 6h. After RA treatment, the cell viability was determined by staining with acridine orange/DAPI and analysis via a NucleoCounter NC-3000. The protein expression levels of type I collagen, transforming growth factor beta-1 (TGF-β1), TGF-β type II receptor (TGF-βRII), p-Smad1/5, p-Smad2, p-Smad3, and Smad4 of the cell lysates were measured by Western blot analysis. RESULTS: The cell viability of PECs was significantly decreased after RA treatment (P<0.01). As the result, RA reduced the protein expression of type I collagen and TGF-β1 of PECs. Additionally, RA also inhibited TGF-β1/Smad signaling by decreasing the protein expressions of TGF-βRII, p-Smad1/5, p-Smad2, p-Smad3, and Smad4. CONCLUSION: This study demonstrate that RA could inhibit fibrosis of PECs by down-regulating type I collagen expression and TGF-β1/Smad signaling. Therefore, RA is a potent therapeutic agent for the treatment of pterygium.     

自噬抑制剂3-MA对高糖诱导的人视网膜色素上皮细胞增生的抑制作用

背景糖尿病视网膜病变(DR)是糖尿病常见的并发症之一,视网膜色素上皮(RPE)细胞作为视网膜重要的组成细胞在DR的发生和发展中至关重要. 目的 探讨自噬抑制剂3-MA对高糖培养的人RPE细胞(hRPECs)增生的影响.方法 将体外培养的hRPECs分为对照组、高糖组和3-MA+高糖组,对照组细胞用含5 mmol/L葡萄糖的DMEM/F12培养基进行培养,高糖组采用含30 mmol/L葡萄糖的DMEM/F12培养基进行培养,干预组细胞先在DMEM/F12培养基中添加10 mmol/L的3-MA处理1h后,再添加30 mmol/L葡萄糖溶液进行培养.将培养的细胞以1×105/孔的密度接种于24孔细胞培养板中,待细胞80％融合后用含体积分数0.5％胎牛血清的培养基继续孵育24 h,使细胞周期同步化.倒置光学显微镜和透射电子显微镜下观察各组jRPECs的形态及超微结构;采用CCK-8法检测各组hRPECs的增生率;采用Western blot法检测各组hRPECs中自噬相关基因微管相关蛋白轻链3B(LC3B)蛋白的表达.结果 对照组细胞生长状态良好,细胞排列整齐;高糖组细胞体积稍增大,细胞数量明显多于对照组,而3-MA+高糖组细胞形态不规则,排列紊乱.透射电子显微镜下可见对照组细胞核呈圆形或卵圆形,亚细胞器形态均正常,未发现自噬小体;高糖组细胞中可见自噬溶酶体,而3-MA+高糖组可见自噬小体.对照组、高糖组、3-MA+高糖组细胞的增生率分别为(100.0±2.0)％、(116.9±5.2)%和(103.7±4.7)％,总体比较差异有统计学意义(F=13.526,P=0.006),高糖组的细胞增生率明显高于对照组和3-MA+高糖组,差异均有统计学意义(均P＜0.05),3-MA+高糖组与对照组间细胞增生率的差异无统计学意义(P＞0.05).与对照组比较,高糖组细胞中LC3B-Ⅰ蛋白表达减弱,LC3B-Ⅱ蛋白表达增强,而3-MA+高糖组细胞中LC3B-Ⅰ和LC3B-Ⅱ蛋白的表达强度与对照组接近.对照组、高糖组、3-MA+高糖组细胞中LC3B-Ⅱ/LC3B-Ⅰ值分别为0.131±0.065、2.504±0.097和0.274±0.007,组间总体比较差异有统计学意义(F=1 694.676,P=0.000),高糖组细胞中LC3B-Ⅱ/LC3B-Ⅰ值明显高于对照组和3-MA+高糖组,差异均有统计学意义(均P＜0.05),3-MA+高糖组与对照组间细胞中LC3B-Ⅱ/LC3B-Ⅰ值的差异无统计学意义(P＞0.05).结论 高糖可激活自噬过程并促进hRPECs增生,而自噬抑制剂3-MA在一定程度上抑制自噬进程,从而发挥抑制细胞增生的作用.     

视网膜色素上皮细胞通过分泌含有miR-4488的外泌体抑制糖尿病视网膜病变进展的机制研究

目的　探讨视网膜色素上皮细胞通过分泌含有miR-4488的外泌体抑制糖尿病视网膜病变进展的分子机制。方法　将人视网膜色素上皮细胞系ARPE-19细胞分为空白组、高糖组。将人视网膜微血管内皮细胞（HRMECs）分为NG组、HG组、NG+外泌体组和HG+外泌体组。空白组、NG组和NG+外泌体组细胞用含5.5 mmol·L^-1正常浓度葡萄糖的培养基培养24 h;高糖组、HG组和HG+外泌体组细胞用含30 mmol·L^-1高浓度葡萄糖的培养基培养24 h;NG+外泌体组和HG+外泌体组细胞在培养基中分别加入空白组或高糖组ARPE-19细胞分泌的外泌体40 μg·L^-1。PKH67绿色荧光标记外泌体;利用CCK-8法、Transwell小室法检测HRMECs增殖、迁移和血管生成。取空白组和高糖组ARPE-19细胞外泌体进行miRNA微阵列分析。采用双荧光素酶报告分析检测miR-4488和转化生长因子β受体Ⅱ（TGFβR2）基因序列的靶向关系。采用Western blot或免疫荧光染色检测各组HRMECs中TGFβR2、Smad2、p-Smad2ser467或Desmin、α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）的表达。结果　空白组和高糖组ARPE-19细胞分泌的被PKH67标记的外泌体加入培养基后都可被HRMECs吸收。与NG组相比,HG组HRMECs细胞增殖率、迁移率、血管结点数和血管总长度、TGFβR2和p-Smad2ser467蛋白表达量、Desmin和α-SMA蛋白荧光强度均增加（均为P<0.05）;与HG组相比,HG+外泌体组上述指标均被逆转（均为P<0.05）;NG+外泌体组与NG组上述指标相比差异均无统计学意义（均为P>0.05）。与空白组相比,高糖组ARPE-19细胞分泌的外泌体中miR-4488相对表达量增加,且miR-4488模拟物和TGFβR2wt共转染可增加双荧光素酶活性（均为P<0.05）。结论　在高糖条件下,ARPE-19细胞释放的外泌体可通过miR-4488/TGFβR2/Smad信号通路抑制HRMECs间充质转化。     

4-苯基丁酸对高糖诱导的人晶状体上皮细胞发生上皮间质转化的影响

目的　探讨4-苯基丁酸（4-PBA）对高糖诱导的人晶状体上皮细胞发生上皮间质转化（EMT）的影响。方法　体外培养人晶状体上皮细胞系HLE-B3细胞,将培养的HLE-B3细胞分为正常对照组、高糖组和4-PBA预处理+高糖组。利用流式细胞术检测各组细胞内活性氧（ROS）的含量;利用Western blot检测各组细胞中内质网应激（ERS）相关通路分子的蛋白表达;采用免疫荧光染色观察各组细胞中上皮因子E-cadherin和间质因子α-SMA的表达;分别采用实时荧光定量PCR和Western blot检测各组细胞中EMT标志分子E-cadherin、α-SMA、Snail的 mRNA及蛋白表达。结果　高糖组细胞呈长梭形改变,丢失上皮细胞特性,类似纤维细胞的表型;4-PBA预处理+高糖组细胞形态不规则,相对于高糖组细胞,长梭形细胞数量较少。流式细胞术检测结果显示,高糖组细胞内ROS含量高于正常对照组,4-PBA预处理后ROS含量降低,差异均有统计学意义（均为P<0.01）。Western blot检测结果显示,高糖组细胞中ERS相关通路分子GRP78、CHOP、p-eIF2α的蛋白相对表达水平均高于正常对照组（均为P<0.05）;4-PBA预处理+高糖组细胞中GRP78、CHOP、p-eIF2α的蛋白相对表达水平均明显低于高糖组（均为P<0.05）。实时荧光定量PCR和Western blot检测结果显示,与正常对照组相比,高糖组细胞中E-cadherin mRNA及蛋白表达下调,α-SMA和Snail的mRNA及蛋白表达均上调（均为P<0.05）;与高糖组相比,4-PBA预处理+高糖组细胞中E-cadherin mRNA及蛋白的相对表达量均明显上调,α-SMA和Snail的mRNA及蛋白的相对表达量则与之相反（均为 P<0.05）。免疫荧光染色结果显示,高糖组细胞中E-cadherin荧光表达明显弱于正常对照组,4-PBA 预处理后荧光增强;α-SMA荧光表达则与之相反。结论　4-PBA通过抑制ERS相关通路分子的表达、减少ROS产生来抑制高糖诱导的晶状体上皮细胞发生EMT,从而对晶状体上皮细胞起到一定的保护作用。     

tTG小干扰RNA对人晶状体上皮细胞转分化和细胞外基质沉积的抑制作用

目的探讨RNA干扰抑制组织型转谷氨酰胺酶(tissue transglutaminase,tTG)的表达对人转化生长因子β2(transforming growth factor-beta2,TGF-β2)诱导的晶状体上皮细胞(lens epithelial cells,LEC)转分化和细胞外基质沉积的抑制作用。方法设计并合成针对tTG的3对小干扰RNA(siRNA):tTG-siRNA-1、tTG-siRNA-2、tTG-siRNA-3,用Real-time PCR和Western blot检测转染了siR-NA后HLE-B3细胞表达tTG mRNA和tTG蛋白的变化。然后将体外培养的HLE-B3细胞分为正常对照组、TGF-β2组和TGF-β2+siRNA组。48h后,用Western blot检测各组tTG、平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscle actin,α-SMA)、纤维连接蛋白(fibronec-tin,FN)和Ⅳ型胶原(collagenⅣ,Col-Ⅳ)的表达。结果转染tTG-siRNA-1、tTG-siRNA-2、tTG-siRNA-348h后,tTG mRNA的表达分别下降为空白对照组的46.60%、12.84%、66.75%(均为P<0.05);tTG蛋白的表达量分别下降为空白对照组的60.49%、27.87%、55.91%(均为P<0.01)。Real-time PCR与Western blot检测结果一致显示了tTG-siRNA-2对tTG基因的抑制效果最佳。与正常对照组相比,TGF-β2组中tTG、α-SMA、FN、Col-Ⅳ的表达量均明显增加(均为P<0.01);与TGF-β2组相比,TGF-β2+tTG-siRNA-2组中tTG、α-SMA、FN、Col-Ⅳ的表达量均明显减少(均为P<0.01)。结论靶向tTG的siRNA可以显著降低tTG的表达水平,同时可以明显抑制TGF-β2诱导的HLE-B3细胞合成α-SMA、FN、Col-Ⅳ。提示tTG是介导TGF-β2诱导人LEC转分化和细胞外基质沉积的重要分子。     

藤黄酸通过CYLD/NF-κB信号通路抑制高糖环境下RPE细胞上皮-间充质转化的作用

目的 基于去泛素化酶圆柱瘤蛋白/核因子κB(CYLD/NF-κB)通路,研究藤黄酸(GA)对高糖环境下视网膜色素上皮(RPE)细胞上皮-间充质转化(EMT)的作用。方法 体外培养ARPE-19细胞,高糖诱导,实验分为NC组(含5.5 mmol·L^-1葡萄糖),HG组(含30 mmol·L^-1葡萄糖),HG+不同剂量GA组(2μmol·L^-1、4μmol·L^-1、8μmol·L^-1GA分别预处理RPE细胞1 h,加30 mmol·L^-1葡萄糖)。CCK-8检测各组RPE细胞增殖活力,免疫荧光染色检测RPE细胞中α平滑肌肌动蛋白(α-SMA)、去泛素化酶圆柱瘤蛋白(CYLD)表达;Western blot检测RPE细胞中α-SMA、CYLD、磷酸化核转录因子κB(p-NF-κB)蛋白表达。结果 与NC组相比,HG组RPE细胞出现明显增殖,RPE细胞中α-SMA、p-NF-κB蛋白表达均增加,CYLD蛋白表达减少(均为P<0.01);与HG组相比,HG+不...     

mTOR regulates TGF-β2-induced epithelial–mesenchymal transition in cultured human lens epithelial cells

Background

Post-cataract surgery fibrosis in the lens capsule is caused by epithelial to mesenchymal transition (EMT) of the lens epithelium. Mammalian target of rapamycin (mTOR) has been demonstrated to be a key regulator of EMT. The aim of this study was to investigate the role of mTOR in transforming growth factor β₂ (TGF-β₂)-induced EMT in human lens epithelial cells (HLECs).

Methods

Human lens epithelial B-3 (HLEB-3) cells were cultured with 10 ng/ml TGF-β₂ for different periods of time. The expression of E-cadherin, connexin 43, fibronectin and α-smooth muscle actin (α-SMA), and activation of mTOR were determined by Western blots. Cell migration was assessed by wound healing assay. An inhibition test was performed using two kinds of mTOR inhibitors.

Results

E-cadherin and connexin 43 expressions were suppressed, whereas fibronectin and α-SMA expressions were increased in HLEB-3 cells after treatment with TGF-β₂. mTOR was activated during the TGF-β₂-induced EMT in a time-dependent manner. Rapamycin or Ku-0063794 with 100 nM was able to inhibit the phosphorylation of mTOR and impaired EMT induced by TGF-β₂. Cell motility enhanced by TGF-β₂ for 24 h was attenuated by both rapamycin and Ku-0063794.

Conclusions

mTOR is activated during TGF-β₂-induced EMT in HLECs, suggesting that it is involved in the regulation of TGF-β₂-induced EMT and may contribute to the development of posterior capsule opacification.     

组织型转谷氨酰胺酶抑制剂对TGF—β2诱导人LECs表达纤维连接蛋白和Ⅳ型胶原的影响

目的观察组织型转谷氨酰胺酶（tTG）特异性抑制剂（MDC）对TGF—β2诱导人晶状体上皮细胞（LECs）表达纤维连接蛋白（FN）、Ⅳ型胶原（Col-Ⅳ）的影响。方法将含10％胎牛血清的DMEM培养基中培养的LECs株HLE—B3传代后分为5组：无血清培养基培养的HLE—B3为正常对照组;加入10μg／LTGF—β2处理的HLE—B3为TGF—β2组;10μg／LTGF—β2与100、200、400μmol／LMDC共同处理的HLE—B3为不同浓度MDC组。用半定量RT—PCR检测tTG、FN、Col-Ⅳ在HLE—B3中的表达,计算A（tTG／β-actin）、A（FN／β-actin）、A（Col-Ⅳ／β-actin）值。结果正常体外培养的HLE-B3中可表达一定量的tTG、FN及Col-Ⅳ。与正常对照组相比,10Ixg／LTGF-β2组中tTG、FN、Col—Ⅳ的表达明显增加（t=33．95,P〈0．01;t=38．24,P〈0．01;t=13．48,P〈0．01）;与TGF—B,组相比,100、200、400μmol／LMDC组中FN和Col-Ⅳ的表达明显减少（P〈0．01）。100、200、400μmol／LMDC组各组间FN和Col—Ⅳ的表达差异均有统计学意义（P〈0．01）。结论MDC可剂量依赖性地抑制TGF—β2诱导的LECs中FN、Col—Ⅳ表达的增加。tTG可促进人LECs表达FN、Col—Ⅳ,并参与后囊膜混浊（PCO）的形成。     

Comparative effects of TGF-β2/Smad2 and TGF-β2/Smad3 signaling pathways on proliferation, migration, and extracellular matrix production in a human lens cell line

The signaling pathway of transforming growth factor β2 (TGF-β2)/Smad plays an important role in the pathological process in posterior capsule opacification (PCO) after cataract surgery. Smad2 and Smad3 are both receptor-regulated Smads (R-Smads) of the TGF-β2 signaling pathway. We aim to find which among Smad2, Smad3, and Smad2&3 plays a key role in PCO pathology. The signal characteristics of TGF-β2 and Smad proteins in the human lens cell line HLE-B3 were investigated. Smad2, Smad3, or Smad2&3 were silenced using small interfering RNA. We then tested cell proliferation by 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide (MTT) and cell growth curve assays, migration by transwell and wound-healing assays, and extracellular matrix production including α-smooth muscle actin (αSMA), fibronectin, and type I collagen by real-time PCR assay, with and without TGF-β2 exposure. Silencing Smad3 blocked the effect of TGF-β2 on cell proliferation and production of fibronectin and type I collagen. Silencing Smad2 blocked the effect of TGF-β2 on cell migration and production of αSMA. Smad2 depletion enhanced Smad3 activity in cell proliferation and ECM production, whereas Smad3 depletion enhanced Smad2 activity in migration and αSMA expression. Silencing Smad2 and Smad3 efficiently blocked the effect of TGF-β2on cell proliferation, migration, and extracellular matrix production. Smad2 and Smad3 are both key in the TGF-β2 signaling pathway. We can prevent the development of PCO following cataract surgery by blocking the TGF-β2/Smad2&3 signaling pathway.